Improvement of Sperm Quality in Hyperviscous Semen following DNase I Treatment
Abstract
Nadmierna lepkość nasienia upośledza ruchliwość plemników i może prowadzić do niepłodności męskiej. To prospektywne badanie miało na celu ocenę zdolności egzogennej DNazy do poprawy jakości nasienia, biorąc pod uwagę, że DNazy zostały znalezione w plazmie nasienia kilku gatunków i że neutrofile uwalniają chromatynę w celu uwięzienia bakterii. W niniejszej analizie porównano siedemdziesiąt siedem próbek nasienia z wysoką lepkością nasienia (HSV) jako grupą badaną i sześćdziesiąt dwie próbki nasienia z normalną lepkością nasienia (NSV) jako grupą kontrolną. Próbki nasienia podzielono na trzy grupy, które poddano działaniu (a) DNazy I w temperaturze 37°C przez 15 minut, (b) wirowaniu w gradiencie gęstości oraz (c) kombinacji dwóch powyższych metod. Po piętnastominutowym traktowaniu nasienia hiperwiskozowego, ruchliwość plemników w 83% próbek nasienia wzrosła w stopniu statystycznie znamiennym. Przeciwnie, traktowanie DNazą nasienia o normalnej lepkości nie dawało takich efektów. Powyższemu leczeniu towarzyszył również istotny wzrost odsetka prawidłowych plemników, co skutkowało znacznym obniżeniem wskaźnika teratozoospermii. Porównanie próbek nasienia poddanych wirowaniu w gradiencie gęstości po obróbce DNazą I z próbkami pobranymi po samej obróbce w gradiencie gęstości wykazało, że w pierwszym przypadku wyniki były bardziej spektakularne. Ocena każdego z preparatów pod względem wydajności (% całkowitej liczby plemników progresywnie ruchliwych po leczeniu w stosunku do początkowej całkowitej liczby plemników) wykazała, że podejście łączone dało wynik 29,8% vs. 18,5% przy samym leczeniu gradientem gęstości (p=0,0121). Leczenie DNazą I skutkuje poprawą ruchliwości i morfologii plemników i może być korzystne dla mężczyzn z nasieniem nadlepkim w protokołach wspomaganego rozrodu.
1. Wprowadzenie
Badania udokumentowały, że hiperlepkość nasienia (SHV) występuje w 12-29% ejakulatów. SHV jest stanem, który może prowadzić do niepłodności męskiej, ponieważ może poważnie pogorszyć fizyczne i chemiczne właściwości płynu nasiennego. Wiąże się to z obniżoną ruchliwością plemników, jak również z gorszym wynikiem zapłodnienia in vitro i zwiększoną produkcją reaktywnych form tlenu (ROS). Ponadto poziomy produktów uszkodzenia oksydacyjnego nasienia były znacząco skorelowane z lepkością płynu nasiennego u niepłodnych mężczyzn .
Istnieją silne oznaki istnienia szlaków hamujących, które pogarszają jakość nasienia poprzez produkcję ROS podczas transportu plemników przez męski układ płciowy, oznaki uszkodzenia plemników podczas obróbki laboratoryjnej i przechowywania, ale także oznaki dodatkowej produkcji ROS „automatycznie” po ejakulacji, przynajmniej w niektórych przypadkach hiperviscosity nasienia. Stan ten jest najczęściej związany z infekcją męskich dodatkowych gruczołów płciowych i varicocele , chociaż patofizjologia nadal nie jest w pełni zrozumiała. Co więcej, w próbkach oligoasthenozoospermii w przypadkach hiperlepkości nasienia wykryto upośledzoną zdolność antyoksydacyjną płynu nasiennego. Co więcej, nadmiernie generowane poziomy ROS prowadzą do peroksydacji lipidów zaburzając morfologię błon. Obecność zwiększonej ilości leukocytów w nasieniu jest związana z SHV. Ponadto, leukocyty są głównym źródłem ROS i wektorów retrowirusów w nasieniu, a ich obecność została powiązana ze zmniejszonym prawdopodobieństwem poczęcia, jak również z niższym wskaźnikiem powodzenia inseminacji wewnątrzmacicznej (IUI) i konwencjonalnego IVF. Ponadto, SHV jest skorelowane ze składem mikrobioty nasienia i wyższą prewalencją bakterii patogennych .
Several podejścia terapeutyczne zostały zaproponowane w ustawieniach zmniejszenia lepkości nasienia SHV. Overhydration i masaż prostaty nie były skuteczne . Delikatna aspiracja nasienia i wydalanie, przez strzykawkę 5 ml, są prawie nieskuteczne, ponieważ SHV nie jest zjawiskiem mechanicznym. Proteoliza przy użyciu chymotrypsyny poprawia postępowanie z nasieniem hiperwiskozowym, chociaż dochodzi do pewnych zmian w białkach plemników. Biorąc pod uwagę, że taka procedura może uszkodzić strukturę plemników i że w większości przypadków SHV jest skorelowane z leukocytospermią, wysunęliśmy hipotezę, że SHV jest powodowane przez pułapki zewnątrzkomórkowe neutrofilów (NETs) i że są one wrażliwe na degradację DNA przez DNazę I. Według naszej najlepszej wiedzy jest to pierwsze doniesienie o zastosowaniu DNazy I w celu rozwiązania problemu SHV.
2. Materiały i metody
2.1. Uczestnicy
Badanie prospektywne było prowadzone przez ponad 3 lata u pacjentów z historią niepłodności w Klinice Medycznej w Atenach, Locus Medicus, z następującymi kryteriami wykluczenia: hipogonadyzm z varicocele, wnętrostwo i wrodzona niedrożność przewodów nasiennych. Siedemdziesiąt siedem próbek nasienia z HSV uzyskano jako grupę badaną, a sześćdziesiąt dwie próbki nasienia prawidłowe z NSV uzyskano jako grupę kontrolną, stratyfikowaną w następujący sposób. Początkowo, zestaw trzydziestu dwóch próbek nasienia z HSV i dziesięciu próbek nasienia z NSV potraktowano DNazą I. Ponadto, kolejny zestaw dwudziestu sześciu próbek nasienia HSV i pięćdziesięciu dwóch z NSV przetworzono metodą wirowania w gradiencie gęstości (DGC). Wreszcie, dziewiętnaście próbek HSV było przetwarzanych przez połączenie metod, tj. wstępne traktowanie DNazą I, a następnie DGC. Wszyscy uczestnicy podpisali formularz świadomej zgody przed jakimkolwiek zaangażowaniem.
2.2. Analiza nasienia
Próbki nasienia, uzyskane przez masturbację po abstynencji seksualnej przez 3-5 dni, umieszczono w sterylnych pojemnikach. Po pobraniu próbki nasienia pozostawiano do upłynnienia w temperaturze 37°C, a następnie poddawano je konwencjonalnej analizie granic referencyjnych analizy nasienia, przed i po procesie łączonym opisanym powyżej]. Ruchliwość była oceniana przez tego samego, oficjalnie przeszkolonego (ESHRE) biologa, który nie jest zaangażowany w badanie. Obecność białych krwinek (WBC) oceniano za pomocą testu peroksydazowego (Leukoscreen FertiPro; Belgia) zgodnie z wytycznymi WHO 2010 . Chociaż lepkość można było ocenić za pomocą wiskozymetru ilościowego, lepkosprężystość nasienia oceniano za pomocą plastikowych jednorazowych pipet, które pozwalały nasieniu spadać pod wpływem grawitacji i obserwując długość każdej nici . Mężczyźni, których nasienie ma długość nici pomiędzy 2cm i 4cm są klasyfikowane z łagodnym SHV (53,12%); długość nici pomiędzy 4cm i 6cm (40,62%) jest oznaczona jako umiarkowane SHV; i długość nici większa niż 6cm jest diagnozowana jako ciężkie SHV (6,25%) zostały włączone do grupy wysokiej lepkości (HV), podczas gdy lepkosprężystość została uznana za normalną, gdy długość nici była 2 cm lub mniej .
2.3. Leczenie enzymem
Wpływ DNazy I oceniano w próbkach nasienia normalnego i o wysokiej lepkości. Po upłynnieniu, DNazę I delikatnie wprowadzano do sterylnego pojemnika z próbką nasienia do końcowego stężenia 20 U/ml i stale mieszano, a następnie inkubowano w temperaturze 37°C przez 15 do 60 minut. Ruchliwość i morfologia powyższych próbek nasienia były analizowane przed i po trawieniu enzymatycznym, a % PR (ruchliwość (a+b) % całkowitej liczby plemników) plemników przed jakimkolwiek leczeniem był oceniany (tj. początkowy % PR).
2.4. Przygotowanie nasienia
Wirowanie metodą gradientu gęstości (DGC) przeprowadzono zgodnie z zaleceniami producenta. Gradient gęstości przygotowano przez nałożenie 1 ml pożywki 40% na pożywkę 80% PureSperm® (Nidacon International, Gothenburg, Szwecja) w 15 ml stożkowej probówce wirówkowej. Nasienie nakładano na wierzch gradientu i wirowano przy 300g przez 20 minut. Zakres i siłę wirowania można zmieniać w zależności od jakości próbki: na przykład, czas wirowania można wydłużyć w przypadku próbek o dużej lepkości. Po odwirowaniu należy delikatnie usunąć większość supernatantu, a osad umieścić w nowej, czystej probówce i ponownie zawiesić w 5 ml podłoża, aby usunąć podłoże gradientu gęstości. Następnie należy wirować przy 200 g przez 10 minut, usunąć supernatant, a końcowy osad ponownie zawiesić w sterylnym podłożu do wspomaganych technik rozrodu (ART). Wreszcie, w leczeniu kombinatorycznym, próbki o wysokiej lepkości były wstępnie traktowane DNazą I, a następnie przygotowywane wyżej opisaną metodą DGC. Stężenie, ruchliwość i morfologię określano przed i po preparatyce.
Biorąc pod uwagę, że po płukaniu całkowita liczba plemników progresywnie ruchliwych (TPMSC) może być przydatna do przewidywania skuteczności inseminacji domacicznej, wydajność każdej z metod oceniano również w następujący sposób: odsetek TPMSC po traktowaniu albo preparatem DGC, albo DNazą I, albo połączonym traktowaniem DNazą I, po którym następowało przygotowanie DGC, dzielono przez liczbę całkowitych plemników przed traktowaniem. Ponadto, wynik wydajności (tj. % końcowy PR/ogółem plemników przed) porównywano z % początkowym PR/ogółem plemników przed jakimkolwiek leczeniem. Wydajność była oceniana w próbkach nasienia o wysokiej lub normalnej lepkości. Chociaż nie ma konsensusu co do liczby podawanych ruchliwych plemników w ART, ogólnie przyjmuje się, że odzyskanie maksymalnej liczby ruchliwych plemników z każdej próbki nasienia po jakimkolwiek leczeniu ma zasadnicze znaczenie.
2.5. Analiza statystyczna
Dane analizowano za pomocą jednokierunkowej ANOVA, a następnie testu wielokrotnych porównań Kruskala-Wallisa przy użyciu GraphPad Prism 6.0. Wartość p mniejszą niż 0,05 uznano za istotną statystycznie.
3. Wyniki
Stężenie białych krwinek (WBC) przedstawiono na rycinie 1. Stwierdzono istotną statystycznie różnicę pomiędzy wszystkimi grupami (p=0,0238 jednoczynnikowa ANOVA). Ponadto, statystyczna różnica w obrębie grupy HV wynosi 0,0018.
Stężenie WBC (106/ml) zgodnie z długością nici lepkości (łagodna, umiarkowana i ciężka) jako grupa HV; w/o V: nasienie bez lepkości.
Zastosowanie DNazy I zwiększa ruchliwość plemników u mężczyzn (32 badanych) z wysoką lepkością. Jak pokazuje Rycina 2(a), dodanie enzymu na piętnaście minut (t=15) poprawia odsetek (a) ruchu z 2,875% plemników do 8,094% plemników bezpośrednio po upłynnieniu (t=0), co jest istotne statystycznie (p=0,049, test porównań wielokrotnych). Ponadto ruch PR pomiędzy tymi samymi punktami czasowymi wzrósł z 27,468% do statystycznie istotnego 46,59% (p<0,0001, wielokrotny test porównawczy). W tym samym czasie ruchliwość frakcji (c) zmniejszyła się z 34,687% (t=0) do 21,5% (t=15) (p<0,0001, wielokrotny test porównawczy), natomiast ruchliwość frakcji (d) zmniejszyła się z 37,812% (t=0) do 31,968% (t=15) (p=0,45 wielokrotny test porównawczy). Zastosowanie DNazy I w nasieniu o prawidłowej lepkości nie zwiększa ruchliwości plemników w sposób istotny statystycznie, w żadnej z próbek, co przedstawiono na rycinie 2(b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Efekt DNazy I w ruchliwości plemników po 15 min inkubacji z DNazą I. DNaza I poprawia ruch PR w sposób statystycznie istotny w nasieniu hiperwiskozowym (a), ale nie ma wpływu na plemniki o normalnej lepkości (b). w/o: plemniki bez leczenia, traktowane: plemniki traktowane DNazą I, a: plemniki szybko postępujące, b: plemniki wolno postępujące, c: nie postępujące, d: niemotylne, a PR: ruchliwość (a+b).
Kontynuacja inkubacji przez dodatkowe piętnaście minut (u 21 badanych z 32) (dla całkowitego czasu trzydziestu minut, t=30) zwiększyła ruchliwość frakcji plemników do 9,524% (t=30) z 1,761% (t=0) (p=0,046, test porównań wielokrotnych), jak pokazano na Rycinie 3. Co ciekawe, ruch PR uległ radykalnej poprawie z 24% (t=0) do 45,047% (t=30) (p<0,0001, wielokrotny test porównawczy) plemników. Ruchliwość frakcji (c) i (d) plemników zmniejszyła się w sposób istotny statystycznie odpowiednio z 35,714% do 22,08% (p=0,001, wielokrotny test porównawczy) i z 40,238% do 32,238% (p=0,039, wielokrotny test porównawczy). Ponowna ocena lepkości nasienia po leczeniu DNazą I wykazała, że w większości przypadków lepkość uległa normalizacji lub przynajmniej poprawie.
Wpływ DNazy I na ruchliwość nasienia nadlepkiego po 30 min inkubacji z DNazą I. DNaza I poprawia ruch w sposób statystycznie istotny w nasieniu hiperwiskozowym, ale w sposób mniej spektakularny niż po 15-minutowej inkubacji. w/o: plemniki bez leczenia, traktowane: plemniki traktowane DNazą I, a: plemniki szybko postępujące, c: nie postępujące, d: niemotylne, a PR: ruchliwość (a+b).
Następnie porównaliśmy wyniki uzyskane z plemników poddanych wirowaniu w gradiencie gęstości po traktowaniu DNazą I, z wynikami uzyskanymi po samym traktowaniu gradientem gęstości. Ze względu na limity próbek, obie procedury nie były stosowane na próbkach pobranych od tych samych osób, ale na próbkach pochodzących od różnych osób, u których lepkość spermy była wysoka. Wirowanie w gradiencie gęstości zastosowano również do inseminacji wewnątrzmacicznej (IUI). Jak przedstawiono na Rycinie 4, odsetek (a) ruchu po wirowaniu w gradiencie gęstości po traktowaniu DNazą I wzrósł z 3,416% do 35,083% plemników (10,27-krotna poprawa) w porównaniu do 6,333% do 26,866% plemników (4,242-krotna poprawa) w przypadku samego traktowania gradientem gęstości (p<0,0001, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa). W odniesieniu do ruchu (b), po wirowaniu w gradiencie gęstości po traktowaniu DNazą I, poprawa była również istotna statystycznie (z 28,583% do 40,916% plemników (1,43-krotny wzrost), p=0,0112). W grupie poddanej wirowaniu w gradiencie gęstości odpowiednia poprawa wzrosła z 34,533% do 46,466% plemników (poprawa 1,34-krotna), choć różnica między grupami nie była istotna statystycznie (ns, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa). Ponadto ruch PR w pierwszej grupie wzrósł z 32% do 76% plemników (2,375-krotna poprawa) w porównaniu z 1,776-krotną poprawą w drugiej grupie (z 40,866% do 72,666% plemników) (nieistotna statystycznie różnica między grupami, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa). Ruchliwość frakcji (c) i (d) plemników zmniejszyła się odpowiednio z 36,083% do 10,583% i z 31,916% do 13,583%. Odpowiedni spadek w samej grupie poddanej wirowaniu w gradiencie gęstości wynosił od 29,40% do 14,80% (brak istotności statystycznej między grupami, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa).
Porównanie pomiędzy DGC po leczeniu DNazą I vs. samo DGC w ruchliwości nasienia hiperwiskozowego. Leczenie kombinowane miało większy wpływ na ruch plemników niż samo DGC. w/o: nasienie bez leczenia, traktowane: nasienie traktowane DNazą I, a: plemniki szybko postępujące, b: plemniki wolno postępujące, c: nie postępujące, d: niemotylne, i i PR: ruchliwość (a+b).
Oceniany był TPMSC po płukaniu w stosunku do początkowej liczby (wydajności) każdego preparatu (M&M). Wydajność obróbki gradientem gęstości w przypadku osobnika bez lepkości nasienia wyniosła 27,096% (Ryc. 5, w/o V-d). Wydajność tego samego preparatu w przypadku osobników o wysokiej lepkości (Rysunek 5, HV-d) wynosiła 18,519%. Zmiana w obu przypadkach w stosunku do kontroli (tj. Ryc. 5, w/o V, HV) była istotna statystycznie (odpowiednio p<0,0001 i p=0,0377, test wielokrotnego porównania Kruskala-Wallisa), co świadczy o utracie dużej ilości plemników PR po leczeniu DGC. Gdy plemniki pochodzące od osobników o dużej lepkości poddano działaniu DNazy (Ryc. 5, HV-DNase), odpowiednia wydajność wyniosła 42,47%, a porównanie pomiędzy traktowaniem gradientem gęstości (HV-d) a traktowaniem DNazą (HV-DNase) dało wynik p<0,0001 w odniesieniu do grupy HV, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa. Pomimo wielkości powyższego osiągnięcia, kombinacja traktowania DNazą, po którym następuje traktowanie gradientem gęstości (Rysunek 5, HV-DNase-d) daje wynik 29,782% (p=0,0121 w odniesieniu do grupy HV, wielokrotne porównanie testem Kruskala-Wallisa). Ponadto, preparat łączony (HV-DNase-d) porównano z % plemników PR w nasieniu o wysokiej lepkości przed jakimkolwiek leczeniem (Rycina 5, HV) i otrzymano wynik p=0,448, co oznacza, że większość plemników PR została odzyskana. Ponadto, w porównaniu z grupą w/oV-d nie ma statystycznie istotnej różnicy jako p=0,619 wielokrotnego porównania testem Kruskala-Wallisa.
Ocena wydajności % (TPMSC po leczeniu/total plemników przed leczeniem) DGC, leczenia DNazą i ich kombinacji, w nasieniu o wysokiej lub normalnej lepkości. w/oV-d: nasienie o normalnej lepkości po DGC, HV-d: nasienie o wysokiej lepkości po DGC, HV-DNase: nasienie o wysokiej lepkości po leczeniu DNazą, i HV-DNase-d: nasienie o wysokiej lepkości po leczeniu DNazą, a następnie DGC. w/oV: nasienie o normalnej lepkości przed leczeniem; HV: nasienie o wysokiej lepkości przed leczeniem.
Następnie, ocena morfologii plemników po piętnastominutowej inkubacji z DNazą I skutkuje statystycznie znamiennym wzrostem odsetka prawidłowych plemników z 5,468% do 7,25%, p=0,0197, co ilustruje Rycina 6. W tym samym czasie nieprawidłowości główki zmniejszyły się z 81,75% do 74,937% (p=0,0004), a nieprawidłowości szyjki z 22,062% do 19,343% (p=0,0197). Anomalie ogona i kropli cytoplazmatycznych wykazują tę samą prawidłowość. W wyniku tych zmian morfologicznych można zaobserwować istotny wpływ na wskaźnik teratozoospermii (TZI). Jak przedstawiono na Rycinie 6, zmniejszył się on z 1,205 do 1,084 (p<0,0001).
Piętnastominutowa inkubacja z DNazą I usprawnia morfologię plemników i TZI nasienia o wysokiej lepkości. w/o: nasienie bez leczenia, traktowane: nasienie traktowane DNazą I, head abn: nieprawidłowości w głowie, tail abn: nieprawidłowości w ogonie, oraz TZI: indeks teratozoospermii.
4. Dyskusja
W tym badaniu postawiliśmy hipotezę, że hiperlepkość nasienia pochodzi od NETs. Przedstawione dane wskazują, że trawienie wyciśniętego DNA NETs jest wykonalne, prowadząc do poprawy ruchliwości plemników. Badano enzymatyczne trawienie DNA plazmy nasienia w celu zwiększenia ruchliwości plemników, a tym samym ich przydatności do zastosowania w ART. Zastosowanie DNazy I po upłynnieniu nasienia spowodowało poprawę zarówno ruchliwości, jak i morfologii plemników. Zastosowano kilka punktów czasowych inkubacji w celu osiągnięcia najlepszych rezultatów, które uzyskano po 15 min inkubacji. Celem pracy była poprawa skuteczności inseminacji domacicznej w kohorcie mężczyzn z subpłodnością, których plemniki charakteryzują się wysoką lepkością, wynikającą najprawdopodobniej z utrudnień spowodowanych przez ekstrudowane DNA. Ponadto, zastosowanie DNazy I poprawiło nieprawidłową morfologię, która zwykle współistnieje z wysoką lepkością. Wzbogacenie nasienia oceniano również na podstawie końcowej liczby wyizolowanych plemników, zarówno szybko, jak i wolno postępujących.
Statystycznie istotna poprawa morfologii plemników po zastosowaniu DNazy I może sugerować, że nieprawidłowości te materializują się po ejakulacji i utrzymują się z powodu wysokiej lepkości. Biorąc pod uwagę, że nasienie hiperwiskozowe ma obniżoną całkowitą pojemność antyoksydacyjną, obecność plemników w tym środowisku może indukować peroksydację lipidów i uszkodzenia DNA, a w konsekwencji upośledzenie morfologii. Przynajmniej niektóre z tych zaburzeń morfologicznych okazały się odwracalne po zastosowaniu DNase I. Ta poprawa sugeruje optymalne zastosowanie powyższego leczenia w przypadkach, gdy nie ma tak dużego zapotrzebowania na dużą liczbę bezpośrednio ruchliwych plemników, jak w przypadku inseminacji wewnątrzmacicznej, ale gdy istnieje zapotrzebowanie na najlepszą możliwą morfologię, jak w przypadku IVF lub procedury ICSI do zapłodnienia .
Nasze wyniki ujawniają, że zastosowanie DNazy I jest skuteczne tylko w obecności hiperlepkości. Jak pokazuje Rysunek 2(b), w przypadku braku hiperlepkości, zastosowanie DNase I nie jest skuteczne. W szczególności, w warunkach normalnej lepkości i niezależnie od ruchliwości plemników, trawienie enzymatyczne nie spowodowało żadnej statystycznie istotnej różnicy w żadnym z badanych parametrów. Przeciwnie, w kohorcie nasienia hiperwiskozowego zastosowanie enzymu skutkowało poprawą ruchliwości PR w sposób istotny statystycznie, co przedstawiono na Rycinie 2(a). Ponadto, nie stwierdzono różnic w ruchliwości plemników i odbudowie morfologii w grupie HV w zależności od ciężkiej lub umiarkowanej lepkości, chociaż liczba próbek nasienia o ciężkiej lepkości była niska. Ponadto, jak pokazano na rycinie 5, statystycznie istotna różnica po przygotowaniu DGC między grupą o wysokiej lepkości (HV-d) a grupą o normalnej lepkości (w/oV-d) wynosi 0,0179, co sugeruje, że poprawa jest osiągalna. Ponadto, na tym samym rysunku, wydajność leczenia skojarzonego (HV-DNase-d) spowodowała odzyskanie odsetka plemników PR, który osiągnął poziom odpowiadający plemnikom u mężczyzn z wysoką lepkością (HV) przed leczeniem, jako że końcowy odsetek PR (29,782%, HV-DNase-d) w pierwszym przypadku nie ma statystycznej różnicy w stosunku do początkowego PR (26,478%, HV przed leczeniem), p=0,4480. Znaczenie tego połączonego podejścia, chociaż obniża ono wydajność w porównaniu z samym traktowaniem DNazą (p<0001 pomiędzy HV-d i HV-DNase), zostało potwierdzone przez fakt, że traktowanie gradientem gęstości odjęło od odzyskanych, (c) i (d) odpowiedników plemników klasy, oczyszczając je w ten sposób. W przeciwieństwie do tego, odpowiednia różnica statystyczna pomiędzy wydajnością preparatu DGC (HV-d, 18.519%) i „HV przed obróbką” (26.478%) była znacząca (tj., p=0.0322).
W dodatku, mogłoby to zastąpić mechaniczną obróbkę nasienia hiperwiskozowego; w ten sposób jest ono powszechnie rozcieńczane lub wciągane do igły podskórnej i przetłaczane w celu przezwyciężenia podwyższonej lepkości. Chociaż metody te są mało prawdopodobne, aby być skuteczne, ponieważ ten rodzaj leczenia zwiększa produkcję ROS . Ponadto hiperlepkość jest negatywnie skorelowana z integralnością chromatyny jako wadliwa dekondensacja, co zostało już zauważone .
Ogólnie rzecz biorąc, zastosowanie DNase I w drogach oddechowych zostało już medycznie zatwierdzone przez FDA w przypadku mukowiscydozy . Ponadto DNaza jest naturalnym składnikiem osocza nasienia, którego rolą jest prawdopodobnie rozcieńczanie NETs powstających w żeńskim torze rozrodczym po rekrutacji neutrofili w odpowiedzi na stan zapalny, a proponowana procedura jest potencjalnie medycznie możliwa do zastosowania w ART. Jego rolę zwiększa również fakt, że jego brak ma niekorzystny wpływ na zapłodnienie naczelnych .
Nadlepkość jest prawdopodobnie spowodowana albo przez zapalenie, albo przez jakąkolwiek dysfunkcję gruczołów nasiennych, chociaż dokładny mechanizm nie jest jasny. Może to być związane z infekcjami wirusowymi dróg rodnych, co zostało wcześniej wykazane przez nasze laboratorium. Kilka protokołów terapeutycznych zostało zastosowanych w celu zmniejszenia lepkości nasienia, ale rzadko wyniki były zachęcające. Metody takie jak nadmierne nawodnienie i masaż prostaty nie przyniosły oczekiwanych rezultatów. Zastosowanie enzymów proteolitycznych, takich jak alfa-chymotrypsyna, dało obiecujące wyniki, ale ich zastosowanie nie zostało przyjęte .
W innym badaniu, DNaza I została użyta do zmniejszenia lepkości, ale ostateczne wyniki nie były pomyślne w tym zakresie. Autorzy nie badali jakościowych parametrów nasienia, tj. ruchliwości. Ponadto czas inkubacji był znacznie dłuższy (jedna godzina) niż proponowany przez nas (piętnaście minut), więc neutralny wpływ na lepkość mógłby być ewentualnie przypisany przedłużonej inkubacji enzymu z plazmą nasienia.
Wreszcie, pomimo danych, że hiperlepkość nasienia została skorelowana ze stanem zapalnym męskich narządów płciowych, tj, pęcherzyków nasiennych, co doprowadziło do stosowania antybiotyków i antyoksydantów, to te formy terapii mogły leczyć ten stan tylko w przypadkach, gdy głównym czynnikiem był stan zapalny. Zazwyczaj jest to spowodowane przez różne czynniki, które działają synergistycznie i dlatego nie ma bezpośredniej terapii przyczynowej dla nadlepkości .
Po ekspozycji na bodźce zapalne, neutrofile, główna populacja leukocytów w nasieniu, wywierają swoją rolę ochronną poprzez inaktywację bakterii przez fagocytozę i późniejsze zabijanie poprzez ekspozycję na enzymy proteolityczne i ROS. Drugim sposobem działania, dzięki któremu neutrofile mogą neutralizować patogeny, jest wytwarzanie przez nie pułapek zewnątrzkomórkowych (NETs). NETs są trójwymiarowymi włóknistymi sieciami, składającymi się głównie z chromatyny, które mogą zatrzymywać i unieruchamiać mikroorganizmy. Wykazano, że NETs są wrażliwe na degradację DNazą, ale nie proteazą. Ponieważ tworzenie NETs jest oparte na DNA, a nasienna DNaza okazała się trawić wyciśnięty DNA i uwalnia zaplątane plemniki, postawiliśmy hipotezę, że użycie egzogennej DNazy może okazać się cennym leczeniem w przypadkach hiperviscosity nasienia spowodowanej głównie obecnością zewnątrzkomórkowego, odsłoniętego DNA neutrofilów.
Z patofizjologicznego punktu widzenia, koncepcja, która przypisuje hiperviscosity do zapalenia, została prawie ustalona. Reakcje zapalne obejmują tworzenie NETs z neutrofili w celu wychwytywania mikroorganizmów. Jest bardzo prawdopodobne, że plemniki zużywają dużo energii próbując uwolnić się z NETs i w związku z tym badanie ich utleniania i statusu apoptotycznego jest bardzo ważne. Ponadto, „efekt uwięzienia”, który został już opisany, jest konsekwencją ruchomej prewencji plemników z powodu ich uwikłania w NETs.
W tym badaniu próbowaliśmy zlizywać pozakomórkowe DNA plazmy nasienia, które jest głównym składnikiem NETs, z DNazą I w celu uwolnienia ich z NETs i odzyskania parametrów jakości plemników, tj. ruchliwości i morfologii. Ponadto, jak pokazuje rycina 1, istnieje statystycznie istotna różnica pomiędzy stężeniem WBC a stopniem lepkości. Proponowane leczenie jest ograniczone do fazy postejakulacyjnej, a nie klinicznej. Ponadto zweryfikowano wstępną hipotezę, że zwiększona lepkość plemników jest wynikiem obecności DNA w nasieniu, choć do potwierdzenia tej hipotezy potrzebne są dalsze badania. Biorąc pod uwagę fakt, że neutrofile rekrutowane do miejsc objętych stanem zapalnym tworzą NETy, wysunęliśmy hipotezę, że DNA w nasieniu pochodzi od neutrofilów. Chociaż nie przedstawiliśmy bezpośredniego dowodu potwierdzającego to przypuszczenie, uważamy, że zgodnie z naszą wiedzą, głównym możliwym źródłem DNA jest chromatyna neutrofili, która jest wyciskana pod wpływem stanu zapalnego.
5. Wnioski
Wyniki naszych badań potwierdzają wniosek, że leczenie DNazą I zapewnia istotną statystycznie poprawę ruchliwości i morfologii plemników. Poprawia ona podstawowe dla ART parametry nasienia, tj. ruchliwość i morfologię, tylko w przypadku nasienia hiperwiskozowego. Co więcej, nasze wyniki sugerują, że główną przyczyną SHV jest powstawanie NETs i w związku z tym proponujemy potencjał terapeutyczny i użyteczność tego podejścia.
Dostępność danych
Dane wykorzystane do poparcia wyników tego badania są dostępne na życzenie od autora odpowiadającego.
Zatwierdzenie etyczne
Wszystkie procedury przeprowadzone w tym badaniu z udziałem ludzi były zgodne ze standardami etycznymi Komisji Bioetyki i Deontologii, National Kapodistrian University of Athens, Faculty of Medicine, zatwierdzonymi w styczniu 2014 roku (numer referencyjny: 1130).
Zgoda
Wszyscy pacjenci wyrazili świadomą zgodę przed udziałem w badaniu.
Konflikt interesów
Wszyscy autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych.
Wkład autorów
Angelos D. Gritzapis i Vassilis Tsilivakos wymyślili badanie. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, and Vassilis Tsilivakos performed the acquisition of data, participated in its design, and drafted the manuscript. Effrosyni Nosi wykonała testy immunologiczne, a Angelos D. Gritzapis przeprowadził analizę statystyczną. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti i Vassilis Tsilivakos uczestniczyli w analizie i interpretacji danych. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.
Podziękowania
Projekt ten został sfinansowany przez Clinical Diagnostic Laboratory, Locus Medicus S.A.
.