Identyfikacja, analiza filogenetyczna i klasyfikacja grupowa genów bZIP w A. duranensis i A. ipaensis

Based on homology searches and domain verification, a total number of 50 and 45 unique bZIP genes were identified in A. duranensis and A. ipaensis genom, respectively. Szczegóły dotyczące tych genów, w tym identyfikator genu, pozycja genomowa, skład domenowy i klasyfikacja grupowa podane są w pliku dodatkowym 1. Zgodnie z istniejącym systemem nomenklatury, każdemu z tych nowych genów bZIP przypisaliśmy unikalne nazwy: AdbZIP1-50 i AibZIP1-45. Po sprawdzeniu domen bZIP, 93 geny posiadały typową domenę bZIP, w tym niezmienny motyw N-× 7-R/K w regionie podstawowym oraz heptadowe powtórzenie Leu umieszczone dokładnie dziewięć aminokwasów przed R/K w kierunku końca C (plik dodatkowy 2). Pozostałe dwa geny bZIP, AdbZIP28 i AibZIP22, miały nietypową substytucję w regionie podstawowym: zastąpienie konserwatywnego Arg/Lys (R/K) przez IIe (I). Zastąpienie to odnotowano również u innych gatunków .

Systematyczne badania rodziny genów bZIP przeprowadzono po raz pierwszy w Arabidopsis . W tej analizie wyróżniono różne grupy genów bZIP i nazwano je na podstawie ich relacji filogenetycznych i rozbieżności funkcjonalnych. Ten system klasyfikacji został przyjęty dla innych gatunków w oparciu o grupowanie genów bZIP z ich własnych genomów i genomu Arabidopsis. Tutaj, w oparciu o analizę ML (maximum likelihood) białek bZIP z genomów Arachis i Arabidopsis, zidentyfikowaliśmy 11 odrębnych kladów genów bZIP (grupy A-I, S, i U), wszystkie z wysokim wsparciem bootstrapowym (Rys. 1). Klasyfikacja podgrup bZIP z Arachis została dodatkowo potwierdzona przez rekonstrukcję drzewa filogenetycznego po dodaniu bZIP z soi (plik dodatkowy 3). Większość kladów bZIP obejmuje blisko spokrewnione bZIP Arachis i ich ortologów z Arabidopsis; klady E i F nie mają odpowiednich członków u A. duranensis i A. ipaensis. Warto zauważyć, że geny bZIP w obrębie tego samego kladu miały podobne, specyficzne dla grupy cechy sekwencji, w tym strukturę ekson/intron, fazy intronów, motywy MEME i przewidywaną strukturę miejsc wiążących (analizowane dalej). Ten wzór międzygatunkowego grupowania sugeruje, że cechy specyficzne dla grupy pojawiły się przed dywergencją Arachis i Arabidopsis. Jednakże kilka różnic nagromadziło się również w genach bZIP różnych gatunków roślin w czasie ewolucji.

Struktura genów bZIP Arachis

Jako że organizacja intronów i eksonów może wskazywać na trajektorię ewolucyjną genów bZIP, zbadaliśmy strukturę genów bZIP Arachis, w tym liczbę intronów, długość i fazę splicingu (plik dodatkowy 4). Stwierdziliśmy, że ogólna struktura genów Arachis bZIP w obrębie tej samej grupy filogenetycznej była identyczna lub podobna. Biorąc pod uwagę liczbę intronów bZIP orzeszków ziemnych, 24% AdbZIP i 22% AibZIP było bez intronów, występując wyłącznie w grupach S i B. Wśród genów zawierających introny, liczba intronów wahała się od 1 do 13 w genach AdbZIP i AibZIP. Geny bZIP w grupie G miały najwięcej intronów, zgodnie z obserwacjami w innych genomach roślin strączkowych .

Fazy splicingu zostały oznaczone jako trzy fazy splicingu: faza 0 (P0), splicing wystąpił po trzecim nukleotydzie kodonu; faza 1 (P1), splicing wystąpił po pierwszym nukleotydzie kodonu; i faza 2 (P2), splicing wystąpił po drugim nukleotydzie. Fazy miejsc splicingu w obrębie otwartych ramek odczytu (ORF) były zróżnicowane, ale były wysoce konserwowane w regionach podstawowych i zawiasowych domeny bZIP, ponieważ jakiekolwiek zmiany w tych regionach mogłyby wpłynąć na ich kod i funkcję. Na podstawie pozycji intronów i obecności lub liczby faz splicingu w domenie bZIP zidentyfikowano cztery wzorce intronów (a do d) w genach bZIP Arachis (ryc. 2 i plik dodatkowy 2). Wzór a zawierał tylko jeden intron wstawiony w pozycji – 5 regionu zawiasowego, pomiędzy aminokwasami Gln i Ala; wzór ten zidentyfikowano we wszystkich genach bZIP Arachis w grupach A i G. Wzór b zawierał dwa introny wstawione w fazie 0, jeden w regionie podstawowym, a drugi w regionie zawiasowym; wzór ten zidentyfikowano we wszystkich genach bZIP w grupie D. Wzór c miał pojedynczy intron wstawiony w pozycji – 20 w regionie podstawowym w fazie 2 (P2) i obejmuje wszystkie geny bZIP z grup C i H. Wzór d nie miał intronów w regionie podstawowym i zawiasowym i obejmuje wszystkie geny bZIP z grup B i S. Ponadto większość genów bZIP Arachis wykazujących wzór d była pozbawiona intronów, z wyjątkiem AdbZIP45 i AibZIP40. Każdy z tych genów miał jeden intron poza regionem podstawowym i zawiasowym. Zaobserwowane tutaj wzorce faz splicingu w domenie bZIP Arachis były zgodne z tymi obserwowanymi u innych gatunków. Wysoka konserwacja struktury genów i faz intronów w obrębie kladów filogenetycznych wspierała przyjętą klasyfikację grup i sugerowała, że te różne wzorce splicingu eksonów mogą odgrywać ważną rolę w ewolucji funkcjonalnej.

Składy motywów dla różnych grup bZIP Arachis

Oprócz domeny bZIP, wiele dodatkowych konserwowanych motywów wykryto w genach bZIP za pomocą narzędzia analizy MEME. Jak pokazano na Rys. 3, zidentyfikowano łącznie 18 konserwatywnych motywów poza domeną bZIP, a następnie skonstruowano kompozycje motywów konsensusowych dla każdej podgrupy (plik dodatkowy 5). Wskazały one, że ogólny skład motywów był podobny w obrębie tej samej podgrupy, ale różny pomiędzy różnymi grupami. Sugeruje to, że funkcjonalna dywergencja genów bZIP może być determinowana przez motywy specyficzne dla danej grupy. Indywidualne badanie tych motywów wykazało, że wiele z nich było specyficznych dla danej grupy. Na przykład motywy 1, 2, 3 i 10 zostały zidentyfikowane tylko w grupie D; motywy 5, 14 i 15 zostały zidentyfikowane tylko w grupie G; motyw 6 został zidentyfikowany tylko w grupie I; a motyw 9 został zidentyfikowany tylko w grupie H. Kilka motywów może być związanych ze specyficznymi funkcjami biologicznymi. Na przykład, motyw 1 to domena DOG (DELAY OF GERMINATION) 1, która jest wymagana do indukcji spoczynku i wielu aspektów dojrzewania nasion, częściowo poprzez interferencję z komponentami sygnalizacyjnymi ABA. Motyw 3 zawiera potencjalne miejsca fosforylacji kinazy kazeinowej II (CK II) (S/TxxD/E), które odgrywają kluczową rolę w podziale i ekspansji komórek oraz wpływają na różne ścieżki rozwoju i reagowania na stres. Co ciekawe, te specyficzne dla grupy motywy zostały również zidentyfikowane w bZIPs z tej samej grupy w innych genomach roślin strączkowych , sugerując, że skład motywów jest konserwowany w roślinach strączkowych.

Arachis bZIP DNA-binding-site structure and dimerization properties

Rdzeniowy region podstawowy i region zawiasowy domeny bZIP niezależnie determinują specyficzność wiązania DNA, jak wykazano w kilku eksperymentach . Nietypowe zastąpienie dwóch niezmiennych miejsc, asparaginy (Asn/N; pozycja: – 18) i argininy (Arg/R; pozycja: – 10), zmieniło specyficzność wiązania DNA. Wyrównaliśmy sekwencje aminokwasów regionów podstawowych i zawiasowych białek bZIP orzeszków ziemnych, aby zidentyfikować konserwowane i polimorficzne reszty aminokwasowe w każdej grupie (plik dodatkowy 6). W żadnym z białek bZIP orzeszków ziemnych nie zaobserwowano substytucji Asn/N w pozycji – 18. Jednakże wszyscy członkowie grupy I mieli lizynę (Lys/K) zamiast argininy (R) w pozycji – 10, zgodnie z grupą I bZIPs z innych gatunków roślin strączkowych. Ponadto AdbZIP28 i AibZIP22 (grupa U) miały hydrofobową resztę izoleucyny (Ile/I) zamiast argininy (Arg/R), a takie zastąpienie wykazano, że całkowicie hamuje powinowactwo bZIP do AP1 w drożdżach i nie rozpoznaje skrzynek G w ryżu .

Sekwencja suwaka Leu pośredniczy w homo- i / lub heterodimeryzacji białek bZIP, które są znane z wiązania się z DNA jako dimery . Region Leu zipper składa się z powtórzeń heptad, aminokwasy są określane jako a, b, c, d, e, f, i g w każdej heptadzie. Ponieważ aminokwasy w pozycjach a, d, e i g znajdują się w pobliżu interfejsu suwaka Leu, to właśnie te aminokwasy w głównej mierze decydują o oligomeryzacji suwaka Leu, stabilności dimeryzacji i specyficzności dimerów. Przeanalizowaliśmy skład aminokwasów występujących w pozycjach a, d, e i g białek bZIP orzeszków ziemnych (Rys. 4a).

W pozycji a, około 20% reszt stanowiła asparagina (Asn/N), która może tworzyć polarną kieszeń w interfejsie hydrofobowym, co pozwala na bardziej stabilne oddziaływania N-N w pozycji a↔a′ (odpowiednia pozycja w przeciwległej helisie), w porównaniu z innymi aminokwasami . Wśród różnych heptad, druga i piąta heptada miały najwyższą częstotliwość występowania reszt Asn/N w pozycji a (odpowiednio 61.46 i 60.22%; Rys. 4b). W pozycji d (ryc. 4a) Leu występował w 45% wszystkich bZIP orzeszków ziemnych i jest jednym z najbardziej stabilizuj±cych dimery aminokwasów alifatycznych. W pozycji e, 37% wszystkich bZIP orzeszków ziemnych miało kwaśne aminokwasy D lub E, podczas gdy w pozycji g, 44% wszystkich bZIP orzeszków ziemnych miało podstawowe aminokwasy R lub K (Rys. 4a). Uważa się, że te naładowane aminokwasy tworzą mostki solne pomiędzy helikatami w oddziaływaniach elektrostatycznych. Atrakcyjne lub odpychające oddziaływania elektrostatyczne g↔e′ mogą również tworzyć międzyhelikalne mostki solne, które wpływają na specyficzność i stabilność dimeryzacji. W celu zbadania udziału naładowanych reszt w pozycjach e i g w regulacji właściwości dimeryzacyjnych białek bZIP Arachis, obliczono częstość występowania atrakcyjnych i odpychających par g↔e′ w każdej heptadzie (Rys. 4c). We wszystkich heptadach atrakcyjne pary g↔e′ koncentrowały się w drugiej (15,6%), piątej (35%) i szóstej (30%) heptadzie, co wskazuje, że mogą one tworzyć kompletne atrakcyjne oddziaływania g↔e′ i przyczyniać się do stabilności poprzez komplementarność w heterodimerze. Trzy grupy obejmujące 28 podrodzin (BZ1-BZ28) zostały dalej podzielone w oparciu o właściwości homo- i heterodimeryzacji, szczególnie specyficzność dimeryzacji (plik dodatkowy 7).

Wpływ duplikacji całego genomu i duplikacji tandemowej na ekspansję rodziny genów Arachis bZIP

Zidentyfikowaliśmy w całym genomie kolinearnie zduplikowane bloki w genomach A. duranensis i A. ipaensis oraz ortologiczne kolinearne bloki pomiędzy dwoma genomami. Obliczono parami odległości synonimiczne (wartości Ks) między paralogami i ortologami w obrębie kolinearnych bloków i wykreślono ich rozkłady częstości (Ryc. 5a; Ks bin = 0,05). Szczytowa częstotliwość Ks między A. duranensis i A. ipaensis, reprezentująca średnią zmienność sekwencji, wynosiła 0,035. Odpowiada to rozbieżności sekwencji między tymi dwoma blisko spokrewnionymi gatunkami Arachis, która, jak się szacuje, nastąpiła ~ 2,16 mln lat temu. Ponadto, wartości szczytowe Ks dla paralogów A. duranensis i A. ipaensis wynosiły odpowiednio 0,90 i 0,95, co odpowiada dywergencji sekwencji wczesnego papilionoidalnego zdarzenia duplikacji całego genomu (WGD), które miało miejsce ~ 58 milionów lat temu .

Wykryliśmy 35 AdbZIP i 32 AibZIP zaangażowanych w zduplikowane bloki genomowe, odpowiadające za około 70% (35/50) i 71% (32/45) genów bZIP w każdym gatunku (Rys. 5b i plik dodatkowy 8). Co więcej, zduplikowane pary genów bZIP występowały zarówno w obrębie chromosomu, jak i pomiędzy chromosomami, a niektóre z tych par były segmentalnie zduplikowane raz, dwa lub trzy razy. Wynik ten wskazuje na preferencyjne zatrzymanie genów i częste układy chromosomalne po WGD. Duplikacje tandemowe wykryto tylko dla dwóch par genów (AdbZIP33/AdbZIP34 i AdbZIP41/AdbZIP42) u A. duranensis i tylko dla jednej pary genów (AibZIP28/AibZIP29) u A. ipaensis. Sugeruje to, że duplikacja tandemowa występowała rzadko i nie była ważniejsza niż duplikacja segmentalna w ekspansji rodziny genów bZIP. Zastosowaliśmy również analizy filogenetyczne i synteniczne, by zidentyfikować 35 par ortologicznych genów bZIP między A. duranensis i A. ipaensis. Geny te były również homeologami między dwoma subgenomami tetraploidalnego orzeszka ziemnego.

Aby zrozumieć ograniczenia ewolucyjne działające na geny bZIP Arachis, obliczyliśmy wartości Ka/Ks dla każdej zduplikowanej pary genów bZIP w dwóch gatunkach Arachis (plik dodatkowy 9). Dla większości tych porównań parami, wartości Ka/Ks były mniejsze niż 0,5 (tylko jedno porównanie parami między zduplikowanymi genami AdbZIP i tylko dwa między zduplikowanymi genami AibZIP były większe niż 0,5). To sugerowało, że silna selekcja oczyszczająca działała na zduplikowane bZIP Arachis, aby usunąć szkodliwe mutacje na poziomie białka.

Analiza ekspresji genów bZIP Arachis podczas rozwoju nasion orzeszków ziemnych

Aby profilować ekspresję genów bZIP, wykorzystaliśmy nasze wcześniej opublikowane dane RNA-seq , które dokumentują ekspresję genów w nasionach orzeszków ziemnych na różnych etapach rozwoju: 20, 40, i 60 dni po kwitnieniu (DAF). Używając tych danych, zidentyfikowaliśmy wartości FPKM dla wszystkich bZIP Arachis i wszystkich różnie wyrażonych bZIP w trzech stadiach rozwojowych. Z wyjątkiem 24 bZIP, które nie ulegały ekspresji w żadnym stadium rozwojowym, wyodrębniono cztery grupy obejmujące odpowiadające im geny bZIP o specyficznym profilu ekspresji (ryc. 6a i plik dodatkowy 10). Pierwsza grupa składała się z 37 bZIPs, które ulegały ekspresji we wczesnym okresie rozwoju (20 DAF), a następnie w 40 i 60 DAF ulegały obniżeniu. Druga grupa składała się z 15 bZIPs, które były podwyższone w 40 DAF, podczas gdy trzecia grupa składała się z 17 bZIPs, które były obniżone w 40 DAF. Czwarta grupa składała się z 22 bZIP, które ulegały wysokiej ekspresji na wszystkich trzech etapach rozwoju. Wysoko wyrażone bZIP w grupie czwartej były rozmieszczone głównie w kladach A, C i S. Kilka z tych bZIP było homologicznych do genów, które były zaangażowane w rozwój nasion u innych roślin, takich jak Arabidopsis, ryż i kukurydza. Tutaj, 12 bZIPs, które ulegały wysokiej ekspresji i były homologiczne do wcześniejszych dobrze zbadanych genów w rozwoju nasion, zostało wybranych do potwierdzenia qRT-PCR i okazało się, że wzorce ekspresji określone przez RNA-seq były zgodne z tymi znalezionymi przy użyciu qRT-PCR (Fig. 6b).

W grupie A, AdbZIP33 i AibZIP28 były ortologiczne do Arabidopsis ABA insensitive 5 (ABI5), który jest związany z sygnalizacją ABA, jak również regulacją rozwoju nasion i długowieczności w Arabidopsis i roślinach strączkowych. Nasze wyniki RNA-seq i qRT-PCR wykazały, że obie ortologiczne kopie ABI5 z dwóch subgenomów tetraploidalnego orzeszka ziemnego ulegały wysokiej ekspresji podczas rozwoju, co sugeruje, że funkcja tych genów może być podobna u orzeszka ziemnego i Arabidopsis. Nasze wyniki qRT-PCR wykazały również, że geny grupy A: AdbZIP42, AdbZIP48 i AibZIP31 ulegały stabilnej ekspresji podczas rozwoju (Rys. 6b i plik dodatkowy 11). Geny te są homologiczne do ABFs i AREB, które są zaangażowane w rozwój nasion pod wpływem ABA, kiełkowanie i dojrzewanie zarodków. Trzy geny w grupie C (AdbZIP23, AdbZIP37 i AibZIP30) również ulegały wysokiej ekspresji i są homologiczne do kukurydzianego czynnika bZIP Opaque2. Opaque2 reguluje akumulację białek oraz metabolizm aminokwasów i cukrów w nasionach kukurydzy. Ponadto, geny grupy S: AibZIP10, AdbZIP12, AdbZIP24, AdbZIP26 i AdbZIP36 ulegały niezwykle wysokiej ekspresji w nasionach orzeszków ziemnych (ryc. 6b i plik dodatkowy 11). Co ciekawe, geny grupy S AdbZIP24 i AdbZIP36 miały podobny wzorzec ekspresji jak geny grupy C AdbZIP37 i AibZIP30: spadek poziomu ekspresji w miarę rozwoju nasion.

Następnie zbadaliśmy rozbieżności w ekspresji genów pomiędzy genami homeologicznymi z genomów AA i BB tetraploidalnego orzeszka ziemnego. Analiza mapy cieplnej wykazała, że ogólne wzorce ekspresji w całym rozwoju nasion były podobne dla 31 par genów homeologicznych/ortologicznych z genomów AA i BB. Zastosowaliśmy metodę analizy ekspresji różnicowej w połączeniu z metodami statystycznymi, aby obliczyć różnice w ekspresji genów pomiędzy tymi parami genów dla każdej próbki. Stwierdziliśmy, że 3 pary genów (AdbZIP5 i AibZIP5, AdbZIP17 i AibZIP15, AdbZIP46 i AibZIP41) były różnie wyrażone w 20 DAF, 3 pary (AdbZIP3 i AibZIP1, AdbZIP4 i AibZIP4, AdbZIP49 i AibZIP45) w 40 DAF oraz 5 par (AdbZIP3 i AibZIP1, AdbZIP33 i AibZIP28, AdbZIP37 i AibZIP30, AdbZIP10 i AibZIP10, AdbZIP1 i AibZIP3) w 60 DAF. Wyniki te wskazywały na ogólną konserwację ekspresji pomiędzy dwoma genomami, ale sugerowały, że 20% genów różniło się w ekspresji podczas równoległej ewolucji i poliploidyzacji dwóch genomów (Fig. 6c).

qRT-PCR expression profiles of Arachis bZIP genes under salt stress

We used qRT-PCR to explore changes in bZIP gene expression in response to salt-treatment (Fig. 7 and Additional file 12). Nie byliśmy w stanie wyraźnie amplifikować 4 bZIPs za pomocą PCR. Po traktowaniu korzeni orzeszków ziemnych solą przez 1 h, 20 genów ulegało istotnie różnej ekspresji; po 5 h, 27 genów ulegało istotnej ekspresji; a po 10 h, 41 genów ulegało istotnej ekspresji (Fig. 7j; test t-Studenta: P < 0,05). W każdym punkcie czasowym o wiele więcej genów ulegało ekspresji w górę niż w dół (14 vs. 6 w 1 h; 21 vs. 6 w 5 h; i 34 vs. 7 w 10 h). Wśród tych różnie wyrażonych bZIPs po traktowaniu solą, wiele z nich było rozmieszczonych w grupach A i S (Rys. 7k), wskazując bZIPs w tych grupach odgrywają ważne role w sygnalizacji cukru i regulacji stresu abiotycznego .

Grupa A bZIPs posiada motywy fosforylacji CKII i Ca2 + -dependent protein kinase phosphorylation site zaangażowane w stres i/lub sygnalizację ABA, a motywy te są ważne dla adaptacji roślin do różnych abiotycznych stresorów środowiskowych. Rzeczywiście, wiele genów grupy A jest związanych z odpowiedzią na stres solny. W Arabidopsis, ABI5 i ABFs/AREB są kluczowymi, zależnymi od ABA czynnikami transdukcji sygnału zaangażowanymi w tolerancję na stres abiotyczny. Nadekspresja GhABF2 znacząco poprawiła tolerancję na stres solny zarówno u Arabidopsis, jak i u bawełny. U pomidora nokaut slAREB1 i slbZIP1 zwiększył tolerancję na stres solny, podczas gdy nadekspresja slAREB1 i slbZIP1 zmniejszyła tolerancję na stres solny. Tutaj, geny AdbZIP42 i AibZIP35 były znacząco podwyższone w odpowiedzi na stres solny, a te geny są homologiczne do ABFs, GhABF2, slAREB1 i slbZIP1. Ponadto stwierdzono, że geny te są fosforylowane przez aktywowane przez ABA kinazy białkowe SnRK2, co sugeruje, że fosforylowanie czynników wiążących elementy odpowiedzi ABA może być krytyczne dla odpowiedzi na stres solny wywołany przez ABA.

Geny grupy B AdbZIP45 i AibZIP40 były regulowane w górę po 10 h stresu solnego, a geny te są homologiczne do AtbZIP17, co może poprawić ekspresję kilku genów odpowiedzi na stres solny w Arabidopsis. Siedem genów bZIP z grupy G (AdbZIP7, AdbZIP15, AdbZIP19, AdbZIP50, AibZIP17, AibZIP21 i AibZIP38) było homologicznych do Arabidopsis AtbZIP41 i pomidorowego slbZIP38, i wykazano, że oba te geny negatywnie regulują stres solny. Spośród tych siedmiu genów, AdbZIP15 był znacząco wyregulowany w dół po 1 h i 5 h stresu solnego, podczas gdy AdbZIP19 i AibZIP17 były znacząco wyregulowane w górę po 10 h stresu solnego. Tak więc, AdbZIP15, AdbZIP19 i AibZIP17 mogą nadawać odporność na stres solny. AdbZIP15 może być negatywnym regulatorem stresu solnego, ponieważ jego wzór ekspresji był podobny do wzoru ekspresji slbZIP38 w odpowiedzi na stres solny.

Geny grupy S AdbZIP24 i AdbZIP36 były homologiczne do AtbZIP1, AtbZIP53, MtbZIP2 i MtbZIP26, a wzory ekspresji tych genów w odpowiedzi na stres solny były podobne (Rys. 7). W szczególności, ekspresja AdbZIP36 była znacząco podwyższona po 10 h stresu solnego. Wykazano, że dwa homologiczne geny w Arabidopsis, AtbZIP1 i AtbZIP53, przeprogramowuj± pierwotny metabolizm węglowodanów i aminokwasów, aby pomóc korzeniom przystosować się do stresu solnego. Homologi MtbZIP2 i MtbZIP26 są również transkrypcyjnie indukowane przez sól i poprawiają tolerancję roślin na stres solny. W szczególności, wzór ekspresji AdbZIP36 był podobny do tych z AtbZIP1, MtbZIP2, i MtbZIP26 w Arabidopsis i M. truncatula , sugerując, że AdbZIP36 może być pozytywnym regulatorem tolerancji na stres solny w orzeszku ziemnym. Podsumowując, nasze badanie analizy ekspresji zidentyfikowało kilka kandydackich bZIPów orzeszków ziemnych, które mogą być związane z odpowiedzią na stres solny, jako cele dla przyszłych badań.