Celowanie genów w embrionalnych komórkach macierzystych

Poprzez proces celowania genów w komórkach ES, potencjalnie każda pożądana manipulacja genetyczna może być wprowadzona do linii zarodkowej myszy. Specyficzne sekwencje genów mogą być usuwane konstytutywnie lub warunkowo (Knock-out), specyficzne mutacje lub zmiany par zasad mogą być dokonywane dokładnie w obrębie interesującego nas genu, a geny reporterowe lub inne kasety ekspresyjne mogą być wprowadzane do określonych miejsc w genomie (Knock-in). Przy użyciu tej technologii można wymieniać sekwencje murine na sekwencje ludzkie w celu wygenerowania humanizowanych modeli mysich.

Ta technika może zająć do roku czasu rozwoju, dlatego istotne jest zainwestowanie znacznej ilości czasu na początku projektu w celu zapewnienia, że wybrano najbardziej odpowiednią technologię i strategię genetyczną dla wymaganego modelu. Rdzeń transgeniczny może zapewnić doradztwo w zakresie tego typu decyzji i istotne jest, aby wszystkie projekty ukierunkowane były szczegółowo omawiane z rdzeniem przed rozpoczęciem pracy w laboratorium.

Po podjęciu decyzji dotyczącej strategii konstruowany jest wektor ukierunkowany oraz opracowywana i testowana jest solidna strategia przesiewowa w celu zapewnienia, że wymagana manipulacja genomowa może zostać wykryta na poziomie genomicznym. Wektor docelowy jest następnie transfekowany do komórek ES i rekombinowane klony są badane pod kątem pożądanego zdarzenia rekombinacji homologicznej. Komórki te są następnie wstrzykiwane do zarodków przedimplantacyjnych, a powstałe w ten sposób myszy chimeryczne są wykorzystywane do hodowli genetycznie zmodyfikowanej linii myszy.

Usługa

Oferowana jest elastyczna usługa, która może być podzielona na określone etapy rozwoju modelu, w zależności od dostępnych zasobów.

Rozpoczęcie projektu – bezpłatnie

• Doradztwo z grupą w celu doboru odpowiedniej technologii pozwalającej na uzyskanie bezpiecznego, użytecznego modelu
• Przegląd banków danych pułapek genowych pod kątem istniejących klonów komórek ES
• Przegląd zasobów konsorcjum Knock-out pod kątem istniejących wektorów docelowych, klonów komórek ES i modeli

Doradztwo w zakresie konstrukcji wektorów docelowych – bezpłatnie

• Analiza sekwencji genomowych w celu identyfikacji regionów, które z dużym prawdopodobieństwem mogą być użytecznymi regionami homologicznymi do ukierunkowania genów
• Doradztwo z grupą w celu określenia strategii genetycznej wymaganej do osiągnięcia bezpiecznego, użytkowego modelu
• Konstrukcja wektora celowania nie jest zapewniona przez rdzeń, ale rdzeń może pomóc w zapewnieniu kaset i doradztwa w zakresie metodologii
• Ustalenie strategii przesiewowej nie jest zapewnione przez rdzeń, ale rdzeń może pomóc w zapewnieniu kaset i doradztwa w zakresie metodologii porada

Celowanie genowe w embrionalnych komórkach macierzystych

• Transfekcja gotowego wektora celującego do embrionalnych komórek macierzystych
• Izolacja i przechowywanie co najmniej 192 niezależnych klonów komórek rekombinowanych
• Przygotowanie DNA i dostarczenie płytek 96-dołkowych do badań przesiewowych
• Odmrażanie, ekspansja przypuszczalnie pozytywnych klonów
• Dodatkowe przygotowanie DNA z przypuszczalnie pozytywnych klonów do przesiewu potwierdzającego
• Analiza kariotypu docelowych klonów

Wstrzyknięcie blastocysty klonów komórek ES

• Wstrzyknięcie komórek ES do zarodka przedimplantacyjnego
• Generowanie i przetrzymywanie chimer przez okres do 3 tygodni.
• Rekomendacje dotyczące strategii hodowlanej

.