Introduction

Wiele cech jest regulowanych i koordynowanych przez wiele genów i warunków środowiskowych. W przyrodzie cechy takie ewoluują w sposób ciągły pod wpływem lokalnych nacisków selekcyjnych i procesów neutralnych, co prowadzi do bogatej różnorodności odmian fenotypowych i strategii radzenia sobie w środowisku. Już Dobzhansky (1964) opisał bogatą różnorodność w świecie żywym jako wynik różnorodności genetycznej, heterogeniczności środowiskowej i adaptacji, które rozwijają się na styku biologii molekularnej i organicznej. Molekularne mechanizmy ewolucji były szczególnie trudne do scharakteryzowania. Po pierwsze, musimy powiązać genotyp z fenotypem. To powiązanie składa się z rozległych i skomplikowanych sieci interakcji genów (Ayroles i in., 2009; Lehner, 2013). Po drugie, musimy zidentyfikować zmiany molekularne odpowiedzialne za adaptacje fenotypowe. This hinges on elucidating the genetic variation and the genetic changes that may occur anywhere in the gene interaction networks (e.g., Edwards et al., 2009).

Objaw zmienności genetycznej w sieciach genowych jest bardzo złożony. Zmiany w pojedynczych genach mogą wpływać na aktywność, a nawet topologię całej sieci genetycznej (np. Knight i in., 2006). Geny i sieci interakcji genowych są często plejotropowe i regulują różne cechy i procesy, co sugeruje, że zmiany w pojedynczym genie mogą przejawiać się w kilku cechach (Stearns, 2010). I odwrotnie, zmiany alleliczne w wielu genach mogą przyczyniać się do zmienności danej cechy fenotypowej (Manolio i in., 2009). Ponadto, epistaza jest wszechobecna, co sugeruje, że warianty alleliczne w wielu loci mogą wpływać na fenotypowe efekty siebie nawzajem (Phillips, 2008; Mackay i Moore, 2014; Moore i Williams, 2015). Te rozważania na temat genetycznych podstaw ewolucji nie są nowe i są badane od kilkudziesięciu lat (np. Wagner i Altenberg, 1996). Genetyka przyszłości i genetyka odwrotna okazały się bardzo skuteczne w wyjaśnianiu funkcji pojedynczych genów lub mutacji dla danej cechy (Nagy i in., 2003). Techniki te są jednak ograniczające przy badaniu złożoności molekularnych sieci interakcji leżących u podstaw fenotypu lub molekularnych mechanizmów ewolucji złożonych cech. Rozwój technologii genomiki był dużym impulsem dla naszej zdolności do badania złożoności genetycznej cech fenotypowych i ich ewolucji (Stapley i in., 2010). Połączenie tych technik z klasycznymi metodami genetyki umożliwia nam ocenę funkcjonalności zmienności genetycznej dla cech fenotypowych (Storz i Wheat, 2010). Pierwsze badania genomiczne na kilku organizmach modelowych podkreślały, że adaptacje ewolucyjne, nawet do specyficznych warunków środowiskowych, generalnie regulują wiele genów lub loci, jak również dynamiczną regulację wzorców ekspresji genów (Gasch i in., 2000; Fay i in., 2004; Pedra i in., 2004). W następnej dekadzie wiele badań wykorzystywało genomikę do identyfikacji genów i białek, które przyczyniały się do powstawania określonych cech i interakcji ekologicznych. Początkowo, koszty i czas potrzebny do sekwencjonowania pojedynczego genomu były nadal bardzo ograniczające. Sekwencjonowanie następnej generacji umożliwiło jednak sekwencjonowanie genomów wielu gatunków i wielu osobników z każdego gatunku. Jest to ogromny zasób do badania ewolucji, ponieważ pozwala nam, po raz pierwszy, mapować zmiany w całym genomie podczas ewolucji.

Technologia genomiczna ma ogromny potencjał, aby poprawić nasz wgląd w procesy ewolucyjne. Podejścia porównawcze zostały zastosowane do mapowania zmian w sekwencjach genomu lub sieci interakcji genów w długich skalach czasowych ewolucji (Drosophila 12 Genomes Consortium et al., 2007; Nowick et al., 2009; Jones et al., 2012). Selekcja eksperymentalna lub podejścia ewolucji eksperymentalnej, a następnie transkryptomika lub sekwencjonowanie genomu, zostały wykorzystane do mapowania zmian ewolucyjnych w znacznie krótszych skalach czasowych (Hunt i in., 2010; Turner i in., 2011; Wertheim i in., 2011; Tenaillon i in., 2012; Linnen i in., 2013; Jalvingh i in., 2014). Badania te pokazały na przykład, jak duplikacje genów, mutacje i silna dywergencja sekwencji w niewielkich podgrupach genów mogą mieć głęboki wpływ na aktywność transkrypcyjną dużych sieci interakcji genowych i wiele cech fenotypowych.

W tej perspektywie przedstawiam najnowsze odkrycia i osiągnięcia dotyczące genomicznych podstaw ewolucji, wykorzystując ewoluującą odporność jako studium przypadku. Odporność jest cechą, która szybko ewoluuje, co czyni ją przydatną do badania genomowych podstaw procesów ewolucyjnych (Obbard i in., 2009; Sironi i in., 2015). Co więcej, sieci molekularne w odporności zostały dość dobrze scharakteryzowane ze względu na ich znaczenie dla zdrowia człowieka (Schadt, 2009; Lazzaro i Schneider, 2014; Zak i in., 2014). Po pierwsze, bardzo krótko podsumowuję nasze obecne rozumienie sieci molekularnych wrodzonych odpowiedzi immunologicznych i procesów selekcji, które działają na odpowiedzi immunologiczne. Następnie opisuję zmiany genomowe, związane z zyskiem, utratą i modulacją poszczególnych aspektów odpowiedzi immunologicznych u Drosophila. Wreszcie, proponuję przyszłe kierunki badań nad genetyczną architekturą złożonych cech i procesów ewolucyjnych.

Odpowiedzi immunologiczne

Układ odpornościowy składa się z kombinacji procesów fizjologicznych, które działają wspólnie w obronie przed patogenami i pasożytami. Odporność wrodzona jest starożytną cechą, którą można znaleźć u wszystkich organizmów wielokomórkowych, podczas gdy kręgowce posiadają również odporność nabytą. Oba systemy odpornościowe łączą w sobie komponenty komórkowe i humoralne: komponent komórkowy obejmuje wyspecjalizowane komórki, które pełnią funkcje ochronne. Obejmuje ona klasy komórek krwi, które służą do fagocytozy mikrobów, otoczkowania większych ciał obcych lub rozpoznawania antygenów (w odporności nabytej), a także wyściełają jelita komórkami nabłonkowymi, które tworzą fizyczną barierę i mogą wydzielać związki obronne. Komponent humoralny polega na uwalnianiu czynników zewnątrzkomórkowych, które zwalczają inwazyjne patogeny, często z wyspecjalizowanych tkanek lub populacji komórek. Obejmuje to uwalnianie peptydów przeciwdrobnoustrojowych (AMP) przez wątrobę (lub ciało tłuszczowe u bezkręgowców) i komórki nabłonka jelitowego, reaktywnych form tlenu w komórkach fagocytarnych i nabłonkowych oraz przeciwciał z białych krwinek (w odporności nabytej; Lemaitre i Hoffmann, 2007; Buchmann, 2014).

Kompleksowe sieci oddziaływań molekularnych koordynują odpowiedzi immunologiczne (ryc. 1A). Te same szlaki są centralne dla odpowiedzi immunologicznej od bezkręgowców do kręgowców, co sugeruje silną konserwację podstawowych elementów sieci molekularnych w odporności (Silverman i Maniatis, 2001; Evans i in., 2003; Buchmann, 2014). Różnorodne cząsteczki receptorowe mogą rozpoznawać patogeny lub pasożyty, na przykład na podstawie wzorów molekularnych związanych z patogenami (np. lipopolisacharydy specyficzne dla błon bakteryjnych). Po aktywacji receptorów, indukują one specyficzne szlaki transdukcji sygnału, takie jak szlaki Toll, Imd i Jak/Stat (omówione w Lemaitre i Hoffmann, 2007; Buchmann, 2014). Ścieżki te składają się z proteaz, kinaz, cytokin i innych białek, które ostatecznie aktywują czynniki transkrypcyjne i kofaktory. Indukcja tych czynników transkrypcyjnych skutkuje produkcją humoralnych cząsteczek efektorowych (np. AMPs) i może indukować proliferację i różnicowanie komórek zaangażowanych w odporność. Produkcja różnych klas komórek krwi jest istotnym aspektem komórkowej składowej odpowiedzi immunologicznej, zarówno w odporności wrodzonej, jak i nabytej. W tych komórkach krwi, kaskady transdukcji sygnału są również regulowane w celu indukowania właściwości komórek i białek, które powodują usuwanie pasożytów. Aby regulować siłę, specyficzność, czas trwania i czas trwania odpowiedzi immunologicznej, sieci molekularne są modulowane przez cytokiny, proteazy i wzajemne oddziaływanie z innymi szlakami sygnalizacyjnymi (Liew i in., 2005; Aggarwal i Silverman, 2008). Obejmuje to również zróżnicowane sieci regulacji posttranskrypcyjnej (Ivanov i Anderson, 2013; Carpenter i in., 2014).

Czynnikami napędzającymi ewolucyjne zmiany w reakcjach odpornościowych są łączne efekty wysokich kosztów fitnessowych infekcji dla gospodarzy, koszty odporności, bogata różnorodność patogenów i pasożytów, które zagrażają gospodarzom, oraz dynamiczne współewolucyjne wyścigi zbrojeń między gospodarzami i patogenami (Schmid-Hempel, 2003). Każdy lub wszystkie z tych aspektów mogą działać w lokalnym środowisku żywiciela i prowadzić do silnej presji selekcyjnej. Rodzaj selekcji jest jednak różny, od kierunkowej, przez oczyszczającą, po równoważącą, w zależności od kosztów i korzyści, jakich doświadcza populacja gospodarza w swoim środowisku lokalnym. Na przykład, wysoce zjadliwy patogen atakujący lokalną społeczność może powodować selektywną zamiatanie lub kierunkową selekcję dla określonych alleli odporności, ponieważ tylko gospodarze posiadający te allele mogą przyczynić się do rozwoju następnych pokoleń. Alternatywnie, zróżnicowana lub współewoluująca społeczność patogenów może prowadzić selekcję zależną od częstotliwości lub równoważącą, sprzyjając zachowaniu zmienności genetycznej. Ewolucja odpowiedzi immunologicznej odzwierciedla zarówno tę współewolucyjną dynamikę z pasożytem, jak i fizjologiczne i ekologiczne koszty układu odpornościowego (Kraaijeveld i in., 2002; Rolff i Siva-Jothy, 2003; Schmid-Hempel, 2005; Lazzaro i Little, 2009).

Genomiczne podstawy zmian ewolucyjnych w odporności Drosophila

Podczas gdy centralna maszyneria odpowiedzi immunologicznej jest silnie konserwowana, kilka składników rozbudowanych sieci molekularnych może szybko ewoluować lub różnicować się (Rysunek 1B). W Drosophila, szybkie zmiany ewolucyjne odnotowano dla receptorów i efektorów odpowiedzi immunologicznej (Sackton i in., 2007; Obbard i in., 2009; Salazar-Jaramillo i in., 2014). Cząsteczki te działają na styku żywiciela i patogenu, są zatem kluczowe dla rozpoznania przez żywiciela organizmu inwazyjnego oraz pośredniczenia w ukierunkowaniu i antagonistycznym działaniu odpowiedzi immunologicznej na patogen. W tym samym czasie pasożyt jest poddawany selekcji, aby pozostać niewykrytym, aby uniknąć lub złagodzić antagonistyczne efekty odpowiedzi immunologicznej. Dlatego dla molekuł na styku i tych modulujących odpowiedź immunologiczną można się spodziewać dynamiki Czerwonej Królowej. Każda ze stron stara się zdobyć przewagę w antagonistycznym wyścigu zbrojeń, wzajemnie napędzając zmiany w sieciach genetycznych stron. Zróżnicowanie cząsteczek receptorów, modulatorów i efektorów odbywa się głównie poprzez duplikacje genów i szybkie zmiany sekwencji (Drosophila 12 Genomes Consortium i in., 2007; Sackton i in., 2007; Salazar-Jaramillo i in., 2014).

Badaliśmy odpowiedź immunologiczną Drosophila przeciwko pasożytniczym osom jako system modelowy do zrozumienia genomowych podstaw procesów ewolucyjnych. Larwy Drosophila są żywicielami różnych gatunków parazytoidów, które składają w nich jaja (Fleury i in., 2009). Gdy jajo pasożyta się wykluje (∼2-4 dni po ataku pasożyta, w zależności od gatunku pasożyta i temperatury), larwa pasożyta zaczyna żerować na żywicielu i zabija go. Niektóre gatunki Drosophila posiadają mechanizm obronny przeciwko parazytoidom poprzez wrodzoną odpowiedź immunologiczną, zwaną melanotyczną enkapsulacją. Ta odpowiedź immunologiczna składa się z komponentów komórkowych i humoralnych, które działają wspólnie w celu sekwestracji i zabicia jaja pasożyta. Atak pasożyta uruchamia immunologiczne szlaki transdukcji sygnału, które indukują (i) proliferację i różnicowanie dwóch klas hemocytów (tj. owadzich komórek krwi), które przylegają do jaja pasożyta i do siebie nawzajem, oraz (ii) odkładanie się melaniny na jaju pasożyta i kapsule komórkowej wokół niego (Lemaitre i Hoffmann, 2007). Żywiciel musi zakończyć proces pełnej enkapsulacji i melanizacji przed wykluciem się jaja parazytoida, aby przeżyć inwazję parazytoida.

Przed erą genomiki zidentyfikowano kilka genów, które były zaangażowane w odpowiedź immunologiczną przeciwko pasożytniczym osom. Szlaki Toll i Jak/Stat zostały zidentyfikowane jako centralne komponenty proliferacji i różnicowania hemocytów, a szlak prophenoloksydazy dla melanizacji (przegląd w Brennan i Anderson, 2004). Następnie przeprowadzono dwa badania mikromacierzy w celu zidentyfikowania dodatkowych genów potencjalnie zaangażowanych w melanizację po ataku pasożytów. Podej¶cie to ujawniło wiele dodatkowych genów, które nie były wcze¶niej zwi±zane z odpowiedzi± immunologiczn± przeciwko parazytoidom, a także ujawniło czas ich działania (Wertheim i in., 2005; Schlenke i in., 2007). Badania te ujawniły kilka skoordynowanych i funkcjonalnie spójnych grup genów, które były czasowo podnoszone lub obniżane podczas części odpowiedzi immunologicznej (Wertheim i in., 2005). Co ciekawe, wykazano, że mechanizmy wirulencji dwóch gatunków parazytoidów różniły się sposobem, w jaki ingerowały w genetyczną sieć odpowiedzi gospodarza: jeden gatunek eliminował początkową aktywację całej sieci, podczas gdy inny gatunek celował w ostatni etap kaskady (Schlenke i in., 2007).

Gatunki Drosophila różnią się w dużym stopniu pod względem odporności na parazytoidy. Niektóre gatunki są całkowicie wrażliwe na parazytoidy, co zostało opisane jako niedobór odporności (Eslin i Doury, 2006). Bliższa inspekcja ujawniła jednak, że odporność na pasożyty nie jest powszechna wśród wszystkich gatunków Drosophila, ale jest ograniczona do kilku kladów. Wykazaliśmy, że w jednym z tych kladów, podgromadzie melanogaster, ewolucyjny wzrost odporności na pasożyty był związany z pojawieniem się nowego typu komórek krwi, lamellocytów, które również są ograniczone do tego samego kladu (Salazar-Jaramillo i in., 2014). Niektóre gatunki Drosophila spoza podgromady melanogaster również mogą enkapsulować jaja parazytoidów, ale wydaje się, że wyewoluowały one różne typy komórek krwi dla reakcji enkapsulacji (Havard i in., 2012; Márkus i in., 2015). Odpowiedź immunologiczna przeciwko parazytoidom ewoluowała niezależnie u różnych taksonów owadów, często z nieco innymi mechanizmami i typami komórek krwi (Lavine i Strand, 2002). Tak więc ewolucja wrodzonego układu odpornościowego obejmuje dodawanie nowych komponentów lub „modułów”. Rodzi to pytanie, jak zmienia się genom podczas nabywania nowego modułu.

Genomika porównawcza ujawniła, że pomimo uzyskania nowego typu krwinki w podgrupie melanogaster, geny, które są znane z różnicowania lamellocytów, są w dużej mierze zachowane w całej filogenezie. Również gatunki, które nie wytwarzają lamellocytów w odpowiedzi na atak pasożytów, posiadają te geny, które są wymagane do różnicowania lamellocytów. Co więcej, geny te wykazuj± niewielk± dywergencję lub oznaki selekcji, podczas gdy należałoby się tego spodziewać w przypadku genów, które uzyskały now± funkcję. Wskazuje to, że istniejące szlaki transdukcji sygnału dla różnicowania hemocytów są modulowane przez otaczającą sieć interakcji genów w celu wytworzenia nowego typu komórek krwi w podgrupie melanogaster. Ta kooptacja istniejącego podstawowego szlaku proliferacji hemocytów jest prawdopodobnie osiągana poprzez dodanie innych lub nowych komponentów do sieci interakcji genów (Salazar-Jaramillo i in., 2014). Zidentyfikowaliśmy kilka nowych genów, które powstały około czasu nabycia lamellocytów i ulegają różnej ekspresji podczas odpowiedzi immunologicznej przeciwko parazytoidom, w tym cząsteczki receptorowe i proteazy typu serynowego (Salazar-Jaramillo i in., 2014). Postawiliśmy hipotezę, że szczególnie endopeptydazy typu serynowego mogą odgrywać kluczową rolę w tej ekspansji sieci interakcji genów. Znaczna liczba tych cząsteczek powstała w czasie nabywania lamellocytów, ulegają one ekspresji w odpowiednim momencie odpowiedzi immunologicznej i wykazują silne sygnatury pozytywnej selekcji (Wertheim i in., 2005; Salazar-Jaramillo i in., 2014).

Również w obrębie jednego gatunku, D. melanogaster, odpowiedzi immunologiczne wykazują duże zróżnicowanie genetyczne. Populacje terenowe zebrane z całej Europy wykazują znaczące różnice w zdolności do skutecznej enkapsulacji jaj parazytoidów (Kraaijeveld i van Alphen, 1995; Kraaijeveld i Godfray, 1999; Gerritsma i in., 2013). Najwyraźniej koszty i korzyści wynikające z silnej obrony immunologicznej różnią się geograficznie, co prowadzi do modulacji i różnicowania współadaptowanych sieci genetycznych. Znalazło to również odzwierciedlenie w odpowiedzi hemocytarnej po ataku parazytoidów. Linie polowe różniły się znacznie pod względem bezwzględnej i względnej liczby różnych hemocytów, które produkowały w odpowiedzi na atak pasożytniczych, nawet wśród linii, które odniosły duży sukces w hermetyzacji (Gerritsma i in., 2013). To ponownie podkreśla, że tło genetyczne populacji i połączone lokalne presje selekcyjne prowadzą do alternatywnych odpowiedzi ewolucyjnych. Porównanie genomów osobników odpornych i podatnych z kilku populacji może ujawnić adaptacyjną zmienność w genetycznej architekturze tej cechy.

Aby zmapować zmiany w genomie podczas ewolucji zwiększonej odporności, przeprowadziliśmy eksperymentalną ewolucję dla odporności na parazytoidy. W laboratorium wystawiliśmy dużą populację outbredową na działanie parazytoidów. Tylko te larwy, którym udało się przeżyć atak pasożytów, były dopuszczane do następnego pokolenia. Dzięki takiemu podejściu zwiększyliśmy poziom odporności z 20 do ∼50% larw przeżywających atak pasożytów po zaledwie pięciu pokoleniach selekcji. Kiedy zmierzyliśmy zmiany w ekspresji genów w wyselekcjonowanych populacjach, w porównaniu do ekspresji genów w liniach kontrolnych, jeszcze przed atakiem pasożytów, znaleźliśmy kilkaset genów, które były nieznacznie odmiennie regulowane (Wertheim i in., 2011). Zmiany te dotyczyły głównie genów, które nie ulegały różnicowej ekspresji podczas odpowiedzi immunologicznej, co wskazuje, że zmiany ewolucyjne nie spowodowały wstępnej aktywacji odpowiedzi immunologicznej w oczekiwaniu na atak pasożytów, ale modulowały kanoniczne szlaki rozwojowe, co (również) prowadziło do zwiększenia ich zdolności obronnych. Powtórzyliśmy ten eksperyment, a następnie zsekwencjonowaliśmy genomy populacji wyselekcjonowanych i kontrolnych. W genomach linii, które wyewoluowały zwiększoną odporność, znaleźliśmy sygnatury selekcji na wielu wąsko zdefiniowanych regionach genomu (Jalvingh i in., 2014). Niektóre z tych regionów pokrywały się również z regionami, które wykazywały zmienioną ekspresję po selekcji na zwiększoną odporność (Wertheim i in., 2011; Jalvingh i in., 2014). Tak więc szybki i silny selektywny przemiat na tak złożoną cechę jak odporność może nadal wpływać na wiele, ale wysoce zlokalizowanych, regionów genomowych.

Przyszłe wyzwania

Jak pogodzimy długoterminowe zmiany ewolucyjne, takie jak nabywanie nowych genów w sieciach interakcji genowych, z krótkoterminowymi zmianami ewolucyjnymi, takimi jak warianty sekwencji, które mogą być przemieszczane przez populację? Kluczem do tego jest (i) rekonstrukcja sieci interakcji genowych leżących u podstaw złożonych cech, oraz (ii) scharakteryzowanie roli zmienności genetycznej w tych sieciach. Sieci genetyczne mogą się rozszerzać o nowe geny poprzez np. duplikacje, mogą się łączyć z innymi sieciami lub modułami, a niewielkie zmiany sekwencji mogą modulować aktywność i topologię sieci. Jeśli uda nam się zdekomponować sieci genetyczne i ocenić rolę wariantów genetycznych w kontekście sieci, pozwoli nam to ostatecznie określić, w jaki sposób zmienność genetyczna przekłada się na zmienność fenotypową. Poprawi to również nasze zrozumienie molekularnych podstaw złożonych chorób człowieka oraz ewolucji wrodzonej i nabytej odporności (Cooper i Alder, 2006; Manolio i in., 2009; Star i in., 2011; Mackay i Moore, 2014; Sironi i in., 2015).

Biologiczne podejścia systemowe będą nieocenione dla rozwikłania złożonych sieci interakcji genów. Opracowywane są tam modele matematyczne opisujące mechanizmy molekularne leżące u podstaw danej cechy oraz przewidujące dynamikę grup oddziałujących ze sobą elementów sieci. Modele te oparte są na danych z genetyki molekularnej i genomiki. Obecnie biologia systemów jest stosowana głównie w odniesieniu do specyficznych cech u organizmów jednokomórkowych i jest to uważane za granicę możliwości (Papp et al., 2011). Jest jednak prawdopodobne, że ten model może nie być reprezentatywny dla ewolucji w rozmnażających się płciowo organizmach wielokomórkowych. Zamiast czekać, aż uproszczone modele dokładnie odzwierciedlą małe podsieci, musimy rozwinąć i udoskonalić nasze metody, aby wykorzystać i określić ilościowo właściwości emergentne z ogromnej ilości danych genomicznych. Możemy wnioskować o sieciach interakcji genów z macierzy korelacji białko-białko lub transkryptów, czy też współekspresji (Shannon i in., 2003; Langfelder i Horvath, 2008), a także łączyć je z analizami wariantów naturalnych (Nuzhdin i in., 2012). Powinniśmy dalej rozwijać te metody i alternatywne podejścia, aby w pełni wykorzystać nasze pomiary na danych genomicznych i przekształcić te ilościowe pomiary w analizy sieciowe. Choć dane genomiczne same w sobie nie dadzą pełnej odpowiedzi na pytanie, co determinuje zdolności adaptacyjne życia, to pozwalają nam na kwantyfikację i obserwację tego, co dzieje się na poziomie molekularnym podczas ewolucji. Kiedy połączymy i zintegrujemy to z heterogenicznością środowiska jako motorem adaptacji, możemy być w stanie odkryć złożone molekularne mechanizmy adaptacji i ewolucji.

Oświadczenie o konflikcie interesów

Autor oświadcza, że badania zostały przeprowadzone przy braku jakichkolwiek komercyjnych lub finansowych relacji, które mogłyby być interpretowane jako potencjalny konflikt interesów.

Podziękowania

Dziękuję Kirsten Jalvingh, Laurze Salazar-Jaramillo i Sylvii Gerritsma za cenne dyskusje. BW było wspierane przez fundusze Holenderskiej Organizacji Badań Naukowych (NWO; grant 864.08.008).

.