Materiały i metody

Zbieranie próbek

Uczestnicy w wieku 18 lat i starsi zostali zaproszeni do udziału w badaniu za pośrednictwem powiadomień e-mail i ogłoszeń umieszczonych na tablicach ogłoszeń na Uniwersytecie Kolumbii Brytyjskiej, Vancouver BC. Uczestnicy zostali poproszeni o dostarczenie próbek przy użyciu suchych wacików policzkowych (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) i wacików policzkowych z końcówką gąbczastą (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) przy użyciu instrukcji; kolejność, w której te próbki zostały podane, była randomizowana komputerowo. Asystent badawczy był obecny podczas pobierania próbek, aby odpowiedzieć na pytania uczestników dotyczące instrukcji pobierania próbek. Wszystkie próbki były przechowywane w temperaturze pokojowej. Raporty farmakogenetyczne nie były przekazywane uczestnikom, ponieważ nie wchodziło to w zakres tego badania.

Ekstrakcja DNA

DNA ekstrahowano przy użyciu zestawu do ekstrakcji DNA opartego na paciorkach Ambion MagMAX (Applied Biosystems, Foster City, CA) zgodnie z instrukcjami producenta. DNA ekstrahowano 3 dni po pobraniu próbki i eluowano w 60 µl. Ilość i jakość DNA oceniano przy użyciu testu fluorescencyjnego Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Czystość próbek określono na podstawie wartości gęstości optycznej A260/280 (ODA260/280) przy użyciu spektrofotometru NanoVue.

Genotypowanie

Genotypowanie przeprowadzono na urządzeniu QuantStudio 12K Flex do ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) na testach zwalidowanych przez producenta (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). Zawartość testów obejmowała 28 SNP wpływających na odpowiedź na lek na platformie OpenArray (patrz plik dodatkowy 2) oraz test TaqMan CYP2D6 CNV (Assay ID: Hs_00010001_cn). W celu walidacji testów wykonano genotypowanie 44 kontroli DNA z National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository w Coriell Institute for Medical Research. Zgodność wywołań została potwierdzona z oczekiwanym genotypem. Dodatkowo sekwencjonowanie Sangera kontrolnego DNA weryfikowało wyniki. Dla każdego badania próbki uczestników były wykonywane w duplikatach na OpenArray i poczwórnie na teście CNV wraz z próbkami DNA Corriell używanymi jako kontrole pozytywne i kontrole bez wzorca (NTC).

Analiza statystyczna

Program TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) został użyty do określenia odsetka wywołań genotypu SNP na OpenArray. Wskaźnik wywoływania genotypów obliczono dla każdego testu OpenArray, dzieląc całkowitą liczbę pomyślnie przypisanych genotypów przez całkowitą liczbę prób przypisania genotypu.

Dla testu CNV TaqMan oprogramowanie CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) zostało użyte do przypisania wywołań liczby kopii CYP2D6 i wyników zaufania CNV. Próbkom DNA przypisano diploidalną liczbę kopii typu dzikiego, a zmiany liczby kopii (zdarzenia delecji lub duplikacji) zgrupowano odpowiednio w grupach 2N i CNV. Dla wyników genotypowania SNP i CNV ustalono 95% współczynnik wywoływania genotypów i 95% wynik ufności, odpowiednio. Dwupróbkowy test t-Studenta zakładający nierówne wariancje został obliczony w celu określenia istotnej różnicy pomiędzy wydajnością DNA, czystością i wskaźnikami wywołań z różnych typów DNA w parach. Przypisania genotypowe wygenerowane z typu próbki DNA (gąbczasta vs sucha zablokowana) od tego samego uczestnika zostały porównane w celu obliczenia zgodności.

Wyniki

Trzydziestu jeden uczestników zostało zrekrutowanych i zebrało wymazy gąbczaste i suche zablokowane. Uczestnicy uznali, że instrukcje samodzielnego pobierania wymazów są proste i łatwe do wykonania dla obu rodzajów wymazów. Uczestnicy zadawali pytania dotyczące koniecznego nacisku przy pocieraniu wymazów i prawidłowego umieszczania wymazów w jamie ustnej. Komentarze uczestników na temat obu rodzajów wymazówek były podobne, przy czym niektórzy preferowali wymazówki z końcówką gąbczastą, a inni wymazówki z suchą blokadą; nie było zgodności opinii.

Wystąpiła istotna różnica w średniej wydajności DNA między DNA pobranym przy użyciu wymazówek z suchą blokadą a wymazówkami z końcówką gąbczastą (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabela 1). Średnia czystość DNA we wszystkich rodzajach pobrań mieściła się w przyjętym zakresie dla czystego DNA (średnia (SD)) 1,72(0,78) i 1,85(0,39) odpowiednio dla wymazów suchych i wymazów z końcówką gąbczastą.

Były trzy próbki pobrane z wymazów z końcówką gąbczastą, które miały niskie stężenia DNA (< 5 ng/µl). Te trzy próbki miały 100% współczynników wywoływania genotypów na OpenArray i 100% wyników zaufania CNV (Ryc. 1). I odwrotnie, jedna z próbek, która miała stężenie DNA 79 ng/µl miała najniższy wskaźnik wywołań OpenArray (18%). Najwyższe wskaźniki wywołań w OpenArray (> 95%) dla wymazów suchych zaobserwowano dla siedmiu próbek o stężeniu w zakresie od 1,2 do 8,9 ng/µl (Ryc. 1a). Najwyższe wartości CNV confidence calls (> 95%) zaobserwowano dla próbek o stężeniu od 1,0 do 24,4 ng/µl (Ryc. 1b).

Dla wszystkich testów na OpenArray, próbki DNA pobrane z wymazów z końcówką gąbczastą skutkowały ogólnie wyższymi wskaźnikami wywoływania genotypów (97%) w porównaniu do wymazów z końcówką suchą (54%) (ryc. 2). 2). Po dodaniu kroku polegającego na 0,5-krotnym rozcieńczeniu wyekstrahowanego DNA, wymazy z końcówką gąbczastą miały stały wskaźnik wywołań genotypowych > 95%. Częstość wywoływania próbek w OpenArray różniła się w zależności od osoby, przy czym 29(93,5%) uczestników miało częstość wywoływania próbek > 95% z DNA z wymazu gąbczastego, a 4(12,9%) miało częstość wywoływania próbek > 95% z DNA z wymazu suchego. Pomiędzy wymazami pobranymi od tego samego osobnika a wymazami pobranymi na sucho zaobserwowano 94% zgodność skutecznych testów genotypowych.

Copy number calls for CYP2D6 were assigned to 2(6.5%) of the samples from sponge-tipped swabs with an overall confidence score of 0.99. Dla porównania, 8(25.8%) próbek z wymazów suchych zostało przypisanych do numerów kopii z ogólnym wynikiem ufności 0.91 (zobacz plik dodatkowy 3).

Dyskusja

Celem tego badania jest pomoc badaczom i firmom w zidentyfikowaniu optymalnej metody zbierania, która daje wysokiej jakości DNA do genotypowania. Badanie to dostarcza nowych informacji na temat jakości DNA dla dwóch rodzajów wymazów, która była wysoka (zdefiniowana jako ODA260/A280 1,8), chociaż istniała znacząca różnica w wydajności DNA (p-value = 4,4-7). Na platformie OpenArray wymazy z końcówką gąbczastą charakteryzowały się najwyższym ogólnym odsetkiem wywołań genotypowych (97% vs. 54%) i najwyższym wynikiem ufności dla CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91). Uznaje się, że wskaźnik wywoływania genotypów SNP > 95% odzwierciedla dane o akceptowalnej jakości, a wynik zaufania CNV 99% jest uważany za wysoką jakość .

Jedna próbka DNA wyizolowana z wymazu gąbczastego miała wskaźnik wywoływania poniżej 95%. W rutynowej praktyce laboratoryjnej próbki o niskim wskaźniku wywoływania zostałyby ponownie pobrane z powodu niekompletnych wyników dla raportów pacjentów. Pominięcie tej próbki zwiększyło ogólny wskaźnik wywoływania genotypów do 99,5% dla wymazów z końcówką gąbczastą.

Wyniki CNVCYP2D6 wykazały wzrost liczby przypisań CNV dla DNA pobranego z wymazów suchych 8(25,8%) w porównaniu z wymazami z końcówką gąbczastą 2(6,5%). Wyższa liczba przyporządkowań CNV korelowała z niższą oceną wiarygodności. Większość uczestników 30(97%) była w stanie zebrać próbki, które skutkowały wysokim wskaźnikiem wywołań genotypowych dla wymazu z końcówką gąbczastą, podczas gdy tylko kilka osób 4(13%) było w stanie zebrać próbki o wysokim wskaźniku wywołań dla obu rodzajów wymazów. Podsumowując, wymazy z końcówką gąbczastą były akceptowane przez pacjentów i dostarczały dobrej jakości DNA o wystarczającej wydajności do testów farmakogenetycznych opartych na qPCR.

.