Dynamic Mechanism for the Transcription Apparatus Orchestrating Reliable Responses to Activators
Matematyczna charakterystyka dynamiki TA
Dynamika TA jest podyktowana tym, jak jego składniki są przestrzennie i czasowo zorganizowane na promotorze. Ponieważ TA może przyjmować wiele różnych stanów konfiguracyjnych, a ewolucja stanu jest zasadniczo stochastyczna, angażując liczne molekuły i złożone interakcje, do zbadania dynamiki TA wykorzystujemy teorie statystyki i prawdopodobieństwa. Dla uproszczenia zakładamy, że stężenia gatunków związanych z transkrypcją, takich jak GTF, pozostają stałe wokół modelowego genu, a oddziaływania molekularne obejmujące promotor są w stanie równowagi dynamicznej. Termin „równowaga dynamiczna” nie oznacza, że wszystkie oddziaływania molekularne są odwracalne; wymaga on jedynie, aby TA po pewnym czasie odzyskała swój aktualny stan. Modelowy gen i wszystkie otaczaj±ce go gatunki stanowi± system. Powyższe założenia implikuj±, że taki system jest w stanie ustalonym. Rozważmy statystyczny zespół składający się z dużej liczby takich identycznych systemów, z których każdy rozwija się niezależnie. Liczba tych układów jest na tyle duża, że wszystkie możliwe stany konfiguracyjne TA mogą być pokryte przez ten zespół. Oznacza to, że każdy stan przechodzony przez pojedynczy gen odwzorowuje stany innych genów w zespole, a proporcja genów w specjalnym stanie X (np. genów, których enhancery są związane przez aktywatory), P(X), pozostaje stała w czasie. Równoważnie, jeśli pojedynczy gen jest obserwowany w dowolnym momencie, to prawdopodobieństwo, że gen znajduje się w stanie X jest również P(X). W tym sensie to, w jakim stanie znajduje się pojedynczy gen, jest zdarzeniem losowym.
Dla modelu minimalnego (Rys. 1a) definiujemy wszystkie stany konfiguracyjne TA jako uniwersalny zbiór Ω, a różne stany o tych samych kluczowych cechach jako odpowiednio następujące podzbiory (Rys. 1b). A oznacza, że enhancer jest związany przez aktywator. S oznacza, że rdzeń promotora jest związany przez białka SCF. M oznacza, że powstający mRNA jest w fazie ciąży (obejmującej proces od utworzenia PIC do ucieczki Pol II w elongację). J oznacza, że aktywator zwi±zany z enhancerem jest przypuszczany do SCF, PIC lub OPC poprzez mediator. Ponieważ eukariotyczna inicjacja transkrypcji wymaga obecności SCF na rdzeniu promotora4,12, M⊂S. Zgodnie z definicjami, J⊂AS. W zestawie MJ, M i A są równoczesne, tzn. aktywatory związane z enhancerem mogą bezpośrednio wpływać na działanie Pol II poprzez Mediator. Zatem inicjację transkrypcji pod bezpośrednią regulacją aktywatorów opisuje zbiór MJ, natomiast podstawowa, niezależna od aktywatorów inicjacja transkrypcji zawarta jest w zbiorze M-J. Prawdopodobieństwo powstania rodzącego się mRNA w ciąży, czyli prawdopodobieństwo wytworzenia mRNA, wynosi
gdzie q jest stałą reprezentującą bazową inicjację transkrypcji, a Aj jest podzbiorem A (szczegóły w S1 Informacji Dodatkowej). W Aj, aktywatory związane z enhancerem są zobowiązane do kontaktu z mediatorem przyłączonym do SCF-, PIC- lub OPC. Równanie (1) charakteryzuje zależność między produkcją mRNA a dynamicznymi właściwościami TA.
Koduje stężenie aktywatorów transkrypcji
Przylegając do odmiennych architektur chromatyny promotorowej na różnych etapach transkrypcji, aktywatory związane z enhancerem mogą pełnić różne funkcje, takie jak promowanie acetylacji histonów i rekrutacja GTFs4,5,15. W szczególności, zestaw Aj obejmuje aktywatory związane z enhancerem, które są odpowiedzialne za obsługę podstawowej maszynerii transkrypcyjnej i kontrolę inicjacji transkrypcji. Co więcej, aktywność tych aktywatorów jest również związana z kodowaniem jądrowego stężenia aktywatorów, gdyż 
jest jedynym czynnikiem w równaniu (1) zależnym od stężenia aktywatorów. Tutaj badamy dynamikę takich aktywatorów.
Aktywatory szybko przemieszczają się w obrębie jądra, a prawdopodobieństwo ich dotarcia do enhancera jest proporcjonalne do ich jądrowej obfitości9. Rozważmy okres czasu, w którym aktywatory zaangażowane w zestaw Aj wiążą się do enhancera, a następnie od niego odchodzą przez m (m = 1, 2, 3, …) cykli. Czasowy wskaźnik zajętości RTOR tych aktywatorów definiujemy jako 
, gdzie 
i 
oznaczają odpowiednio czas wiązania i czas od wiązania w j-tym cyklu. Dla stałej liczby na aktywatorów w jądrze, mamy
gdzie aon i aoff są funkcjami propensity odpowiednio wiązania i rozpinania (szczegóły w S2 Informacji Dodatkowej). aon jest funkcją na, podczas gdy aoff jest niezależne od na. Równanie (2) wskazuje, że wraz ze wzrostem m, 
zbiega się do wartości deterministycznej, która jest monotonicznie rosnącą funkcją na (Rys. 1c-d i Rys. S1; jest to ogólna własność i może być zastosowana do przypadków, w których liczba poznawczych miejsc wiążących na enhancerze jest większa niż jeden (patrz równania S13-S18)). Ta zbieżność sugeruje, że nawet zmienne w czasie stężenie aktywatorów może być kodowane przez RTOR, pod warunkiem, że aktywatory włączają się i wyłączają z enhancera wystarczająco często w oknie czasowym, w którym ich stężenie jest prawie niezmienione. W istocie istnieją aktywne mechanizmy dysocjacji, które gwarantują szybką cykliczność aktywatorów9,19,20,21,22. Czas wiązania oszacowano w przedziale od sekund do kilkudziesięciu sekund9,10. Co więcej, na endogennym genie CUP1 udowodniono, że taka szybka cyrkulacja jest funkcjonalna10. Przypuszczalnie, RTOR koduje stężenie aktywatorów transkrypcji. Z drugiej strony, w okresie, w którym aktywatory cyklicznie włączają i wyłączają enhancer przez m razy, prawdopodobieństwo, że enhancer zostanie znaleziony związany przez taki aktywator wynosi 
. Ponieważ średnia 
z całego zespołu jest również f(na), mamy
Warunki ograniczające zapewniające wiarygodne odpowiedzi transkrypcyjne
Zważywszy na stochastyczność w występowaniu zdarzeń transkrypcyjnych, uzyskanie wiarygodnej odpowiedzi transkrypcyjnej wymaga, aby kod RTOR, który terminowo reprezentuje stężenie aktywatorów, był z dużą wiernością przetransdukowany na ilość transkryptów. Idealnie byłoby, gdyby P(S), 
i 
wszystkie równały się 1, dokładnie taka transdukcja informacji zostałaby osiągnięta. Poniżej przedstawiamy warunki, w których te trzy czynniki mogą być wystarczająco duże, by zapewnić wiarygodne odpowiedzi transkrypcyjne w obecności losowych fluktuacji (Rys. S2 i S3 dostarczają intuicyjnych wyjaśnień dla tego podpunktu).
Z równania (3) wynika, że stężenie aktywatorów nie może być wystarczająco zakodowane bez utrzymywania się SCF na promotorze. Zatem SCF powinien się szybko montować, gdy pozwala na to architektura chromatyny i być znacznie bardziej stabilny niż aktywatory związane z enhancerem (Warunek I). Taka stabilność SCF została zaobserwowana eksperymentalnie, a czas wiązania TBP (białka wiążącego TATA, głównego składnika SCF) na promotorze może wynosić do 20 min w komórkach ludzkich11. W przypadku 
, Aj jest warunkiem koniecznym wystąpienia J. Ponieważ RTOR jest zdeterminowany przez poszczególne krótkie czasy wiązania aktywatorów, J powinien wystąpić natychmiast po wystąpieniu Aj (Rys. S3). W przeciwnym razie informacja o RTOR jest w dużym stopniu tracona lub nawet fałszywie wykorzystywana do ukierunkowania inicjacji transkrypcji (zauważmy, że J jest warunkiem wstępnym M). Dlatego, aby prawidłowo przekazać kod RTOR, Mediator powinien działać poprzez oczekiwanie na związanie aktywatorów cyklicznych i przekazanie informacji poprzez allosteryzację23,24,25 (Warunek II). Dzieje się tak dlatego, że inne rodzaje oddziaływań molekularnych, takie jak swobodne zderzenia, nie są w stanie precyzyjnie przekazać informacji o czasie wiązania aktywatorów. Za takim allosteryzmem Mediatora przemawiają wcześniejsze prace26. 
określa, w jaki sposób informacja o RTOR dziedziczona przez J jest przekształcana do kierowania ilością transkryptów. Ponieważ RTOR zależy od przerywanego wiązania aktywatorów, duży 
wymaga, aby podczas krótkich okresów wiązania transkrypty były produkowane w dość szybkim tempie (Fig. S2) (Warunek III). Cecha ta jest również weryfikowana przez obliczeniowe oszacowania danych eksperymentalnych (patrz S3 w Informacji Dodatkowej). Zatem wszystkie te trzy warunki mogą być spełnione w sposób naturalny.
Dynamiczny mechanizm transkrypcji regulowanej aktywatorem
Powyższe trzy warunki ograniczeń wspólnie określają sposób działania TA. Powtarzalnie powstaje stan, w którym pomiędzy mediatorem a enhancerem tworzy się względnie stabilna przestrzeń przypominająca klamrę (Rys. 2; zgodnie z Warunkami I i II). Ponieważ eksperymentalnie wykazano, że SCF nie jest zbyt stabilna11 , przestrzeń ta jest tworzona tymczasowo. Zaciskowa przestrzeń przyciąga wolne aktywatory, a następnie gwałtownie je odrywa, przy czym o RTOR decyduje stężenie aktywatorów (zgodnie z równaniami (2-3)). Gdy jedna cząsteczka aktywatora dostanie się do tej przestrzeni, powstaje allosteria w mediatorze, co stwarza ułatwione okoliczności do pełnienia funkcji przez GTF-y i inne związane z nimi białka. W konsekwencji Pol IIs może bardzo szybko inicjować/reinicjować transkrypcję (zgodnie z Warunkami II i III), przy czym RTOR reguluje ilość transkryptów.
Ilustracja dynamicznego mechanizmu TA orkiestrującego niezawodną odpowiedź transkrypcyjną.
Powtarzalnie powstaje stan, w którym między mediatorem a enhancerem tworzy się względnie stabilna przestrzeń przypominająca klamrę. Aktywatory transkrypcji cyklicznie wchodzą i wychodzą z tej przestrzeni szybko. Tylko wtedy, gdy przestrzeń ta jest zajęta przez aktywatory, Pol II inicjuje/reinicjuje transkrypcję w tempie szybszym niż tempo cykliczności aktywatorów.
Mechanizm ten sugeruje, że oddziaływania molekularne z udziałem promotora podlegają eleganckim zasadom dynamiki, jak następuje. Podczas gdy przestrzeń przypominająca klamrę jest tymczasowo utworzona, jest ona znacznie bardziej stabilna niż osiadłe w niej aktywatory. Aktywatory mogą cyklicznie wchodzić i wychodzić z tej przestrzeni wiele razy, nawet podczas krótkich epizodów, kiedy ich stężenie prawie się nie zmienia; tak więc stężenie aktywatorów może być reprezentowane przez RTOR w odpowiednim czasie. Ponieważ mediator przekazuje informację za pośrednictwem alosterii, a tempo reinicjacji transkrypcji jest znacznie większe niż tempo cykliczności aktywatorów, kod RTOR jest efektywnie wykorzystywany do kierowania syntezą mRNA. Jednym słowem, przestrzeń przypominająca klamrę jest strukturalną podstawą niezawodnych odpowiedzi transkrypcyjnych. Zamiast stanowić przeszkodę, stochastyczna natura oddziaływań molekularnych jest w pełni wykorzystywana do niezawodnej indukcji transkrypcji; w dużej mierze zależy to od różnych zakresów stabilności składników TA, które obejmują kilka rzędów wielkości. Powyższe argumenty są poparte danymi eksperymentalnymi, a typowe skale czasowe są następujące: okres półtrwania przestrzeni clampopodobnej wynosi około 5 min11, czas zajęcia aktywatorów w tej przestrzeni mieści się w zakresie od sekund do dziesiątek sekund10, allosteria zwykle zachodzi w czasie od milisekund do nie więcej niż 1 sekundy23,24,25, a ponowna inicjacja transkryptu trwa zaledwie kilka sekund (patrz S3 Informacji Dodatkowych).
Weryfikacja mechanizmu przez symulacje numeryczne
Aby dalej zweryfikować proponowany mechanizm dynamiczny, zbudowaliśmy uproszczony stochastyczny model transkrypcji genów z fizjologicznie realistycznymi parametrami (patrz Rys. S4 i S4 w Informacjach Dodatkowych dla szczegółów). Model ten przedstawia kluczowe przejścia stanów TA, a także w prosty sposób opisuje powiązaną dynamikę chromatyny, dzięki czemu jest w stanie scharakteryzować odpowiedź transkrypcyjną na aktywatory transkrypcji. W dalszej części, „wejście” i „wyjście” oznaczają jądrowe stężenie aktywatorów i ilość produktów genu, mRNA lub białka, odpowiednio.
Po pierwsze, badamy czasową ewolucję liczby komórkowego mRNA przy stałych poziomach wejściowych (Rys. 3a). Zauważmy, że mRNA jest produkowane w sposób skokowy, zgodnie z dominującym poglądem14,27,28,29,30,31,32. W przypadku niskich poziomów wejściowych, jeden allel jest transkrybowany, podczas gdy drugi jest niemy w komórce diploidalnej, a zatem zjawisko burstingu jest widoczne. Dla wejść wysokiego poziomu, jednakże oba allele wybuchają często, tak że suma staje się prawie stała. Sugeruje to, że fenotyp trwałych, podwyższonych odpowiedzi transkrypcyjnych może być obserwowany przy wysokich poziomach wejściowych14.
Odpowiedzi transkrypcyjne na aktywatory w oparciu o proponowany mechanizm dynamiczny.
Wejście równa się aon/aoff, co jest dodatnio związane z jądrowym stężeniem aktywatorów. (a) Czasowa ewolucja liczby komórkowych mRNA w pojedynczej komórce diploidalnej przy różnych poziomach wejściowych. mRNA produkowane przez dwa allele pokazane są oddzielnie w kolorze czerwonym i czarnym. Wybuch transkrypcyjny staje się gęsty wraz ze wzrostem siły wejściowej. (b) Średnia relacja wejście/wyjście w pojedynczych komórkach diploidalnych. Maksymalne wyjścia są znormalizowane do 1. Słupki błędów oznaczają odchylenie standardowe wyjścia, SDout. Wstawka pokazuje stosunek SDout do średniego wyjścia vs. wejście. Ponieważ obfitość mRNA lub białek zależy również od tempa ich degradacji/inaktywacji, które są modulowane przez sygnalizację komórkową, tempo produkcji mRNA bardziej bezpośrednio odzwierciedla dynamikę TA (patrz również Rys. S9, gdzie pokazano również tempo produkcji białek44,45). (c) Krzywe SDout vs. wejście. Krzywe te niemal pozostają w kształcie dzwonu, nawet przy różnych szybkościach degradacji mRNA lub białek (patrz też Rys. S10). (d) Rozkład poziomów mRNA w całej populacji komórek dla różnych poziomów wejściowych. Wielkość bloku wynosi 10. (e) Ewolucja stanu promotora w odpowiedzi na okresowo zmieniające się dane wejściowe. G1 oznacza, że enhancer jest związany przez aktywator. SCF oznacza, że rdzeń promotora jest związany przez SCF. OPC oznacza, że promotor rdzenia jest w stanie OPC. Krzywe opisują odpowiednio dane wejściowe, odpowiadające im stany promotora i produkcję mRNA (od góry do dołu). (f) Symulacja ChIP odpowiedzi transkrypcyjnej. Dane wejściowe i symbole są takie same jak w panelu (e). TATAn i Pol II oznaczają, że rdzeń promotora jest związany przez histony i Pol II, odpowiednio.
Niedawna analiza eksperymentalna wykluczyła możliwość, że środowisko chromatyny odgrywa centralną rolę w kształtowaniu rozerwania transkrypcyjnego32. Tutaj pokazujemy, że wybuch transkryptów pochodzi z uporczywej reinicjacji przez Pol IIs, gdy przestrzeń przypominająca klamrę jest zajęta przez aktywatory (Fig. 4). Oznacza to, że inicjacja mRNA jest sama w sobie burst-like. Wybuch nie jest zwykłym szumem; zamiast tego, jest bezpośrednią manifestacją kodu RTOR, który reprezentuje stężenie aktywatorów i kieruje produkcją mRNA.
Esencja wybuchu transkrypcyjnego.
Pokazany jest mikroskopowy widok wybuchu transkrypcyjnego. 'CA’ oznacza, że aktywator znajduje się w przestrzeni przypominającej klamrę. OPC’ oznacza, że maszyneria transkrypcyjna jest w stanie OPC (wyświetlany jest również panel powiększający). Kiedy cząsteczka aktywatora jest obecna w przestrzeni clamp-like, szybka reinicjacja transkrypcji skutkuje wybuchem mRNA.
Po drugie, badamy średnią relację wejście/wyjście odpowiedzi transkrypcyjnej. Średnie wyjście przypomina funkcję Hilla dla danych wejściowych, która jest szeroko stosowana w biologii systemów do modelowania ekspresji genów3,33,34 (Rys. 3b). Krzywa odchylenia standardowego SDout wyjścia w stosunku do wejścia ma w przybliżeniu kształt dzwonu (Rys. 3c). Intensywność szumu wewnętrznego, zdefiniowana jako stosunek SDout do średniej wartości wyjściowej35, jest odwrotnie skorelowana z wejściem (wstawka na Rys. 3b). Co więcej, powyższe cechy są niewrażliwe na niewielkie fluktuacje na wejściu (tj. szum zewnątrzpochodny) (Rys. S5), sugerując odporność odpowiedzi transkrypcyjnej na szum. Wszystkie te wyniki są w dobrej zgodzie z pomiarami eksperymentalnymi zarówno u Saccharomyces cerevisiae36 jak i u embrionów Drosophila37. W szczególności, lewa strona krzywej SDout jest niższa niż jej prawa strona; ta cecha jest prawie ilościowo zgodna z danymi eksperymentalnymi37 (patrz S5 Informacji Dodatkowej dla dalszej dyskusji). Natomiast odstępstwa od zaproponowanych powyżej zasad dynamiki (w tym okoliczności, w których cykl aktywatorów jest powolny, kompleks rusztowania/przestrzeń podobna do klampy nie jest stabilna lub/i szybkość reinicjacji transkrypcji jest niska) zmniejszyłyby zdolność TA do niezawodnej odpowiedzi na dane wejściowe (Rys. S6).
Uważano, że relacja wejście/wyjście obserwowana w embrionach Drosophila jest realizowana poprzez maksymalne wykorzystanie granicy oddziaływań molekularnych37,38,39. Właściwości takich mikroskopowych oddziaływań są zintegrowane, aby makroskopowo przejawiać się jako SDout. Krzywa SDout ma nadal ogólny kształt dzwonu w porównaniu z krzywą SDin (por. Rys. 1d). Oznacza to, że sygnatura kodu RTOR może być bezpośrednio przeniesiona na wyjście. Potwierdza to, że czasowa zajętość aktywatorów jest rzeczywiście wykorzystywana do regulacji transkrypcji, a mediator przekazuje tę informację poprzez allosteryzację. Z drugiej strony, krzywa SDout jest asymetryczna, przy czym prawa strona jest wyższa niż lewa. Powód jest oczywisty. Gdy wejście jest bardzo wysokie, enhancer jest związany przez aktywatory prawie cały czas, a więc fluktuacje odzwierciedlają głównie dynamiczne właściwości SCF i reinicjację transkrypcji przez Pol IIs. Nasze dalsze symulacje pokazują, że prawa strona krzywej SDout opada wraz ze wzrostem stabilności SCF lub szybkości reinicjacji transkrypcji; dopiero przy zwiększeniu ich siły poza fizjologiczne zakresy krzywa staje się symetryczna (Rys. S6F). Weryfikuje to również, że zarówno P(S) jak i 
są rzeczywiście wystarczająco duże. Dlatego właściwości SDout powinny niezbicie dowodzić mikroskopowego mechanizmu transkrypcyjnego.
Po trzecie, badamy rozkład poziomów mRNA w całej dużej populacji komórek narażonych na to samo wejście (Rys. 3d). Dla małych wejść, zjawisko bursting jest szczególnie oczywiste i większość komórek nie ma lub ma niewiele mRNA. Jest to zgodne z obserwacjami eksperymentalnymi27,30,31. Ale rozkład stopniowo staje się normalny wraz ze wzrostem wejścia. Dla aon/aoff >1, rozkład staje się ostrzejszy wraz ze wzrostem wejścia. Wyniki te czekają na eksperymentalną identyfikację.
Po czwarte, symulujemy odpowiedź transkrypcyjną na periodycznie zmieniające się wejście. Mikroskopowy proces na promotorze jest raczej dynamiczny i stochastyczny, z różnymi składnikami TA wykazującymi różną stabilność (Rys. 3e). Jednakże, ilość mRNA może podążać za wejściem. Wyniki te są zgodne z rezultatami ujawnionymi przez FRAP, tzn. TA jest wysoce dynamicznym aparatem8,10,11,22. Z drugiej strony, symulacje ChIP (chromatin immunoprecipitation assays), które charakteryzują czasową ewolucję rozkładu różnych stanów promotora w populacji komórek, ujawniają silną regularność rozkładów (Rys. 3f). Wzorce zarówno aktywatorów wiążących się do enhancera, jak i SCF oraz Pol II wiążących się do promotora podążają za wejściem. Transkrypty mRNA są produkowane w fazie z wejściem, podczas gdy histony zajmują promotor w fazie odwrotnej. Wszystkie te wyniki są zgodne z wynikami eksperymentalnymi22,40. Dlatego obserwowane rozbieżności między wynikami eksperymentów FRAP i ChIP mogą wynikać z różnych rozdzielczości pomiarów. Pomiary ChIP integrują interakcje molekularne zarówno w czasie, jak i w całej populacji komórek, podczas gdy FRAP dokładniej odzwierciedla natychmiastowe interakcje. Co więcej, odpowiedź transkrypcyjna na zmienne w czasie dane wejściowe jest odporna na zewnętrzny szum, ale wrażliwa na złożone sygnały wejściowe, a odchylenia od zasad dynamiki (takie jak przypadki z niską szybkością cykliczności aktywatorów, niestabilnym kompleksem rusztowania/przestrzenią podobną do klampy lub/i niską szybkością reinicjacji transkrypcji) zmniejszyłyby zdolność odpowiedzi (patrz Rys. S7 i S8).