Odczynniki do hodowli komórkowych

Zasób glicerolowy ludzkiego Akt1 ORF otrzymano jako wektor pENTR221 od GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Zmodyfikowany wektor docelowy (pcDNA/FRT/TO), zawierający SH Tag, był hojnym darem od Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurich, Szwajcaria). Komórki HEK293 Flp-In TREx (#R780-07), mieszaninę enzymów LR Clonase II (#11791-100), wektor pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) i Dynabeads Protein A (#100.02D) otrzymano z firmy Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) otrzymano od firmy Roche. DMEM (#12430-054) i RPMI 1640 (#22400-089) otrzymano z firmy GIBCO. Trypsynę (#CC5027.010L) zakupiono w firmie Genetics. Normalne FBS (#SH30070.03), jak również FBS badane metodą Tet (#SH30070.03T) pochodziły z firmy Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazol (#M1404-10MG), Propidium Iodide (#P4170-250 mg) i proteazę Lys C (#P3428) uzyskano z firmy Sigma. Etykiety SILAC uzyskano z Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Koktajl inhibitorów proteazy (100X) (#78429) i kulki agarozowe Pierce anti-HA (#26182) otrzymano z firmy Thermo Scientific. Kulki MagStrep 'Type 2HC’ (#2-1612-002) otrzymano z IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India zsyntetyzował peptyd HA. Membrana nitrocelulozowa (#RPN303E) została zakupiona od GE Healthcare. Proteaza trypsynowa (#4370282) została zakupiona od AB Sciex. Pełnozakresowy marker masy cząsteczkowej białek tęczowych (#RPN800E) pochodził z firmy Amersham. siRNA, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) otrzymano z firmy Dharmacon. RNaza A (#19101) pochodziła z firmy Qiagen.

Przeciwciała dla Western Blot

Przeciwciała użyte w obecnym badaniu to: anty-HA (#SC-7392; monoklonalne mysie, rozcieńczenie 1:3000); anty-AKT1 (#SC-5298; monoklonalne mysie, rozcieńczenie 1:1000) i anty-GAPDH (#SC-25778; poliklonalny królika, rozcieńczenie 1:1000) z Santa Cruz; anty-CCDC2 (#77055; poliklonalny królika, rozcieńczenie 1:1000); anty-CCNB1 (#4138; poliklonalny królika, rozcieńczenie 1:1000) od Cell Signalling Technology; anty-BUB3 (#ab133699; monoklonalny królika, rozcieńczenie 1:10000); anty-API5 (#ab56392; monoklonalny myszy, rozcieńczenie 1:1000) i anty-SH3PX1 (#EPR14399; monoklonalny królika, rozcieńczenie 1:2000) od Abcam; przeciwciała wtórne zostały pozyskane od Licor Biosciences-Odyssey kozi anty-mouse (#926-32210, rozcieńczenie 1:15000) i Odyssey kozi anty-rabbit (#926-32211, rozcieńczenie 1:15000).

Generacja stabilnej linii komórkowej

W tym badaniu, wektor wejściowy Akt1 zgodny z bramką (pENTR221) został użyty do wygenerowania konstruktu ekspresyjnego przez reakcję rekombinacji LR w obecności odpowiedniego wektora docelowego (pcDNA/FRT/TO). Wektor docelowy został zmodyfikowany w celu włączenia znacznika Strep-HA (SH) zawierającego peptyd wiążący streptawidynę (Strep) i znacznik epitopowy hemaglutyniny (HA). Ten znacznik SH był ostatecznie używany do selektywnego wyciągania Akt1 i jego partnerów interakcyjnych ze złożonych lizatów komórkowych. Aby wygenerować indukowalną linię komórkową do ekspresji Akt1, konstrukt ekspresyjny został poddany współtransfekcji z rekombinazą pOG44 do komórek HEK293 Flp-In TREx, trwale wyrażających represor Tet. Transfekcję ułatwiał odczynnik do transfekcji Xtremegene 9. Komórki wykazujące ekspresję konstruktu Akt1 były selekcjonowane przez 15-20 dni w podłożu RPMI zawierającym higromycynę-B (75 µg/ml), uzupełnionym 10% FBS z dodatkiem Teta. Stężenie Tetu wymagane do optymalnej ekspresji Akt1 określono poprzez indukcję ekspresji Akt1 w zakresie stężeń Tetu (od 0,1 µg/ml do 5 µg/ml), a poziom ekspresji białka Akt1 monitorowano w obecności i nieobecności Tetu przy użyciu przeciwciał anty-Akt1 oraz anty-HA. Tet był dodawany do podłoża hodowlanego co 24 godziny, aby utrzymać stałą ekspresję Akt1.

PDT Eksperyment

PDT dla komórek HEK293 był monitorowany w normalnych komórkach w porównaniu z komórkami z nadekspresją Akt1 przez 72 godziny po początkowym podaniu Tetu. Dla każdego punktu obserwacji, równoległy zestaw 104 normalnych i Akt1-overexpressing komórek HEK293 został posiany w trzech powtórzeniach, na 96 dołkowej płytce w 100 µl DMEM zawierającej 10% surowicy. Po 24 godzinach od posiewu do podłoża hodowlanego dodawano Tet, a po kolejnej 24-godzinnej inkubacji komórki zbierano jako czas 0. Następnie zestaw komórek w równoległej hodowli zbierano co 24 godziny do 72 godzin. PDT określano przez liczenie komórek w każdym punkcie czasowym metodą barwienia błękitem trypanu.

Znakowanie SILAC w celu zróżnicowania specyficznego dla fazy cyklu komórkowego interakomu Akt1

Komórki HEK293 poddano ekspansji i hodowano w podłożu SILAC zawierającym „lekkie” (K0R0), „średnie” (K6R6) lub „ciężkie” (K8R10) izotopy lizyny (K) i argininy (R) przez co najmniej 5 podwojeń komórek, aby umożliwić całkowitą inkorporację etykiet. Przy 70% konfluencji, do podłoża dodawano Tet (1 µg/ml) w celu indukcji ekspresji Akt1. Komórki znakowane K0R0 były zatrzymywane w fazie G0 przez nocną głodówkę surowicy, która jest szeroko stosowaną metodą zatrzymywania komórek w fazie G042. W tym celu normalne, kompletne podłoże hodowlane zastąpiono pozbawionym surowicy RPMI, a komórki utrzymywano w hodowli przez 16-18 godzin w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2. Komórki znakowane K8R10 były zatrzymywane w fazie G1/S przez hodowlę przez noc w obecności 5 µg/ml afidikoliny; odwracalnego inhibitora replikacji eukariotycznego jądrowego DNA43. Podobnie, w celu zatrzymania komórek w fazie G2, do pożywki hodowlanej komórek znakowanych K6R6 dodano 400ng/ml nocodazolu, a inkubację kontynuowano przez 16-18 godzin przed usunięciem komórek. Nocodazol zakłóca polimeryzację mikrotubul, zatrzymując komórki w fazie G2/M44. Zatrzymane komórki były trypsynizowane i liczone oddzielnie metodą barwienia błękitem trypanu. Komórki zatrzymane w różnych fazach cyklu komórkowego były następnie granulowane przez odwirowanie przy 1500 obr/min przez 10 minut. Wielokrotne osady komórkowe były wykonywane dla każdej fazy cyklu komórkowego i przechowywane w temperaturze -80 °C, aż do użycia.

SH-tagged Affinity Purification

Taką samą liczbę komórek Akt1-overexpressing zatrzymanych w fazach G0, G1/S i G2 zmieszano w stosunku 1:1:1 i lizowano na lodzie przez 1 godzinę w buforze IP (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X koktajl inhibitorów proteazy i 1 mM PMSF). Lizat komórkowy został oczyszczony z resztek po oddzieleniu wirówkowym przy 10,000 rpm przez 15 minut w 4 °C. Kompleksy białkowe Akt1 były selektywnie oczyszczane w równoległych zestawach przez jednoczesne skierowanie znacznika Strep i HA, zgodnie z instrukcjami podanymi w instrukcjach odpowiednich zestawów. W skrócie, kompleksy białkowe Akt1 znakowane strepem mieszano ze 100 µl kulek magnetycznych streptaktyny i utrzymywano przez 1 godzinę inkubacji na wytrząsarce obrotowej w temperaturze 4 °C. Wszelkie niespecyficzne interaktory były wypłukiwane podczas pięciu kolejnych etapów płukania z użyciem pięciu objętości buforu paciorkowego do płukania streptaktyny. Białko Akt1 i jego interaktory były ostatecznie eluowane w dwóch etapach elucji przy użyciu 125 µl buforu do elucji strep na elucję (invitrogen). W celu oczyszczenia kompleksów białkowych Akt1 znakowanych HA, oczyszczone lizaty komórkowe inkubowano z 50 µl wstępnie przemytych kulek agarozowych HA przez 2 godziny w temperaturze 4 °C na wytrząsarce obrotowej. Po 3 szybkich przemyciach, dziesięcioma objętościami buforu TBS-T, kompleksy białkowe Akt1 eluowano trzykrotnie 50 µl peptydu HA (250 µg/ml). Powyższe etapy oczyszczania wykonano dla trzech takich replik biologicznych w celu oczyszczenia białka Akt1 i jego oddziałujących partnerów, a eluaty Strep i HA dla każdej repliki połączono, zliofilizowano i zachowano w temperaturze -80 °C do dalszego przetwarzania.

Trawienie białka i przygotowanie próbki do LC-MS/MS

Wszystkie trzy repliki biologiczne przetwarzano oddzielnie do trawienia białka. Do zliofilizowanej próbki dodawano 40 µl 100 mM wodorowęglanu amonu, dobrze worteksowano, a następnie dodawano 2 µl buforu denaturującego (AB Sciex). Próbki redukowano za pomocą 4 µl odczynnika redukującego (AB Sciex) przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C. Dodano 2 µl odczynnika blokującego cysteinę na 10 minut w temperaturze pokojowej w celu zablokowania zredukowanych reszt cysteinowych. Trawienie białek rozpoczynano przez dodanie 5 µl 0,1 µg/µl endoproteinazy Lys C. Próbki inkubowano przez 4 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Po krótkim wirowaniu do próbek dodawano 1 µl trypsyny (1 µg/µl) i kontynuowano inkubację przez kolejne 12-16 godzin w temperaturze 37 °C. Trawienie białek kończono dodając kroplę kwasu mrówkowego (FA).

Zakwaszone próbki liofilizowano i poddawano oczyszczaniu peptydowemu przy użyciu kolumn monospin C-18. Przed użyciem kolumny C-18 kondycjonowano metanolem i wodą, a następnie równoważyły się 3% ACN w 0,1% FA. Zliofilizowane próbki rozpuszczono w 3% ACN w 0,1% FA i załadowano na kolumny C-18, po czym pozostawiono na 10 minut w celu związania. Próbki były dwukrotnie przepuszczane przez kolumny w celu zapewnienia całkowitego związania. Po 10 rygorystycznych przemyciach 3% ACN w 0,1% FA, strawione peptydy były eluowane najpierw w 40% ACN, po czym następowały dwie elucje w 60% ACN. Na koniec, trzy eluaty zostały połączone i zliofilizowane, dla każdej replikacji.

Wyeluowane peptydy zostały ponownie rozpuszczone w 500 µl 5 mM mrówczanu amonu (pH 2,5) w 30% ACN i delikatnie wymieszane. Wkład kationowymienny był utrwalany i kondycjonowany przed załadowaniem próbki. Po załadowaniu próbki, wkład przemywano trzykrotnie 5 mM mrówczanem amonu (1 ml). Peptydy były ponownie eluowane dwukrotnie 400 µl 500 mM mrówczanu amonu (pH 2,5) w 30% ACN na elucję, a eluaty były łączone dla każdej repliki próbki i liofilizowane.

Spektrometria masowa Projekt eksperymentalny i uzasadnienie statystyczne

AnalizaLC-MS/MS

Wszystkie próbki analizowano metodą chromatografii cieczowej nano-przepływowej w systemie nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) sprzężonym z potrójnym spektrometrem masowym TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Kanada). Każdy replikat biologiczny był wstrzykiwany dwukrotnie jako replikaty techniczne. System działał przy użyciu gradientu faz dwuskładnikowych, z rozpuszczalnikiem A (2% ACN w 0,1% FA) i rozpuszczalnikiem B (98% ACN w 0,1% FA). W celu uzyskania optymalnej odtwarzalności podawania próbki, autosampler pracował w trybie pełnego wstrzyknięcia, przepełniając pętlę o pojemności 1 µl 3 µl próbki. Do pomiarów każdej iniekcji próbki peptydy były wychwytywane na pułapkę cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) i rozdzielane na kolumnie cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) przy przepływie 300 nl/minutę, stosując gradient liniowy: 5-60% rozpuszczalnika B w ciągu 80 minut, 60-90% przez 2 minuty. Kolumna była regenerowana przez płukanie 90% rozpuszczalnikiem B przez 6 minut i ponownie ekwilibrowana 5% rozpuszczalnikiem B przez 22 minuty.

Spekrometr mas był sprzężony ze źródłem jonów Nano Spray Ion Source (AB Sciex), kontrolowanym przez oprogramowanie Analyst (v.1.6). Źródło jonów było wyposażone w 10 μm emiter SilicaTip electrospray PicoTip (AB Sciex), a eluowane peptydy były monitorowane przez następujące parametry źródła jonów-IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gaz kurtynowy = 25. Spektrometr mas pracował w trybie akwizycji zależnej od informacji (IDA) top10 oraz w trybie wysokiej czułości z czasem akumulacji 500 i 200 ms odpowiednio dla skanów MS1 i MS2 oraz 12 s dynamicznego wyłączenia, co daje całkowity cykl pracy ~2.55 s. Analizę spektrometru mas prowadzono z wykorzystaniem skanów TOF-MS1 i MS2 w zakresie odpowiednio 350-1250 i 140-1600 m/z. Energia kolizji walcowania była automatycznie kontrolowana przez skrypt parametrów IDA rolling collision energy. Kryteria wyboru jonów macierzystych do fragmentacji obejmowały intensywność – gdzie jony musiały być większe niż 150 cps, tolerancję masy 50mDa, stan naładowania od +2 do +5. Automatyczna kalibracja widm została przeprowadzona po akwizycji każdych 2 próbek przy użyciu dynamicznej LC-MS i akwizycji MS/MS 25fmol β-galaktozydazy.

Przetwarzanie i analiza danych

Akwizycja MS-MS Akt1 i jej współdziałających partnerów białkowych została przeprowadzona w 3 różnych fazach cyklu komórkowego tj. w fazie G0, G1/S i G2. Komórki znakowane SILAC reprezentujące każdą fazę były łączone w trzy oddzielne zestawy i sondowane jako repliki biologiczne. W wyniku akwizycji każdego replikatu biologicznego uzyskano 2 pliki wiff i 2 pliki wiff.scan, reprezentujące jego repliki techniczne. Pliki wiff były ponownie łączone dla każdego replikatu biologicznego przed przeszukiwaniem względem bazy UniProtKB/SwissProt Human (release April 2015) przy użyciu oprogramowania protein pilot, wersja 4.5 (revision no.1656). Referencyjna baza danych składała się z 20,204 wpisów białek w podanym wydaniu. Wyszukiwanie białek w programie Protein Pilot oparte było na algorytmie paragon, będącym częścią domyślnych statystyk programu. a) gatunek jako Homo sapiens, b) Lys C i Trypsin jako kategorie enzymów dla różnych przebiegów, c) maksymalna liczba pominiętych rozszczepień = 2, d) stałe modyfikacje jako etykiety SILAC – K6R6 i K8R10; alkilacja cysteiny przez metanetiosulfonian metylu (MMTS), (e) modyfikacje zmienne jako utlenianie przy metioninie, co jest domyślną opcją w protein pilot, (f) identyfikacja, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) i SILAC (Lys + 8, Arg + 10) jako typy próbek, (g) parametr „Search Effort” „Thorough ID”, co daje nam szerokie przeszukiwanie różnych modyfikacji białek, (h) tolerancja masy dla jonów prekursorowych i fragmentacyjnych wynosiła 0.05 i 0.1 Da, odpowiednio. Dla każdej replikacji biologicznej dla każdej etykiety SILAC wygenerowano pliki strawione Lys C i Trypsyną. Do filtrowania danych zastosowano następujące parametry, aby uzyskać pewny zestaw danych do dalszej analizy -(a) Zastosowano algorytm automatycznej korekcji Bias dla stosunku ciężkich jonów do lekkich. Koryguje on nierównomierne mieszanie podczas łączenia różnych znakowanych próbek w jednym eksperymencie i usuwa wszelkie eksperymentalne lub systematyczne uprzedzenia. Współczynnik auto bias zwiększa dokładność kwantyfikacji poprzez normalizację zmian w początkowych ilościach białek45, (b) zatrzymywano białka przy 1% globalnym współczynniku fałszywego odkrycia (FDR) z dopasowania (G-FDR-fit). Analiza FDR została przeprowadzona przy użyciu oprogramowania Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP), które jest zainstalowane z oprogramowaniem protein pilot; (c) Minimalny próg ufności białka został ustawiony na 95%; (d) Identyfikacja co najmniej jednego unikalnego peptydu z 95% pewnością we wszystkich trzech replikacjach.

Listy białek uzyskanych po trawieniu Lys C i Trypsyny zostały połączone na replikę biologiczną. Stosunki kwantytatywne pomiędzy średnimi i ciężkimi białkami znakowanymi SILAC w stosunku do ich lżejszych odpowiedników zostały uśrednione. Następnie uzyskano trzy listy białek dla każdej etykiety SILAC – K0R0, K6R6 i K8R10. Następnie przygotowano listę łączną zidentyfikowanych białek; Oszacowanie ilościowe wykonano ręcznie, łącząc pliki z trzech powtórzeń biologicznych dla każdego warunku SILAC. Białka, które zostały zidentyfikowane we wszystkich trzech zestawach replik zostały zachowane do dalszej analizy, a stosunki ilościowe pomiędzy średnimi i ciężkimi etykietami w odniesieniu do lekkich etykiet dla tych białek zostały uśrednione. Ostateczny połączony plik został następnie przygotowany dla K0R0 (faza G0), K6R6 (faza G2) i K8R10 (faza G1/S). Białko kwalifikowało się do znalezienia się na ostatecznej liście interaktorów Akt1 tylko wtedy, gdy zostało zidentyfikowane we wszystkich 3 zestawach replik dla którejkolwiek z faz cyklu komórkowego. Białkom, które zostały zidentyfikowane, ale nie zostały określone ilościowo we wszystkich trzech powtórzeniach, przypisano wartość kwantyfikacji 0,01 (minimum) lub 100 (maksimum) po wprowadzeniu do współczynników SILAC peptydów.

Aby jeszcze bardziej odciąć listę interaktorów Akt1 od wszelkich niespecyficznych interakcji z matrycą powinowactwa lub znacznikiem per se, GFP znakowane SH zostało poddane nadekspresji w komórkach HEK293. Interaktywni partnerzy białka GFP byli selektywnie eluowani jak opisano dla kompleksów białkowych Akt1. Białka, które pokrywały się z interakcją specyficzną dla fazy cyklu komórkowego Akt1 były usuwane z listy interaktorów Akt1 jako białka niespecyficzne. To ostatecznie dało nam pewny zestaw danych dla partnerów interakcyjnych dla Akt1. Podsumowanie informacji o białkach oddziałujących z Akt1 i ich oszacowaniach ilościowych znajduje się w Tabeli Dodatkowej 3. Dzieląc je ze współczynnikiem Akt1 w odpowiedniej fazie znormalizowano współczynniki ilościowe dla wszystkich interaktorów Akt1. To dało jednolitość Akt1 jako 1 w fazach G0, G1/S i G2.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym i Western blotting

Z listy zidentyfikowanych interaktorów Akt1, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 i SH3PX1 zostały losowo wybrane do walidacji ich asocjacji z Akt1 przez western blotting. Asynchronizowany osad komórkowy z ekspresją Akt1 lizowano w buforze IP i poddawano oczyszczaniu powinowactwa do znacznika SH, jak opisano wcześniej. Eluaty były łączone i rozcieńczane w 1X SDS buforze do próbek, podgrzewane przez 10 minut i rozdzielane na 10% SDS-PAGE. Pasma białek przenoszono na membranę nitrocelulozową, którą blokowano używając buforu blokującego 1:1 odyssey: PBS przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie membranę nacinano, aby umożliwić sondowanie białek o różnej wielkości odpowiednimi przeciwciałami pierwotnymi do walidacji wraz z przeciwciałem anty-HA. Przeciwciała pierwotne rozcieńczano w buforze odyssey: PBST i inkubowano przez noc w temperaturze 4 °C na wytrząsarce. Po dokładnym wypłukaniu bibuły naświetlano odpowiednimi znakowanymi IR przeciwciałami drugorzędowymi anty-mysimi lub anty-rabbitowymi w rozcieńczeniu 1:15000; rozcieńczonymi w buforze odyssey: PBST. Paski były wykrywane przy użyciu skanera podczerwieni odyssey.

Odwrotna koimmunoprecypitacja została również wykonana przy użyciu Dynabeads protein A. Wcześniej wykryte interaktory Akt1 były używane jako białka przynęty, a Akt1 był sondowany jako ich partner interakcji przy użyciu przeciwciała anty-Akt1. Przeciwciała przeciwko wybranym interaktorom Akt1 mieszano z 50 µl dynabeads w oddzielnych probówkach w stężeniu 1:20-1:70; rozcieńczano w 200 µl PBST. Mieszaniny paciorków z przeciwciałami przechowywano do inkubacji w temperaturze pokojowej przez 10 minut. Kompleksy paciorki-przeciwciało granulowano za pomocą separatora magnetycznego i ponownie zawieszano w 200 µl PBST w celu przemycia. Następnie do każdej probówki dodawano po 250 µl lizatu i inkubowano w temperaturze 4 °C przez 2 godziny na wytrząsarce obrotowej. Kulki wraz z odpowiednimi kompleksami przeciwciało-antygen były ponownie granulowane i przemywane trzykrotnie 200 µl PBST na każde przemywanie. Następnie kulki były gotowane w 50 µl 1X SDS buforu do próbek przez 10 minut, a następnie schładzane. Supernatant ładowano na 10% SDS-PAGE i sondowano metodą western blotting. Przeciwciało Anti-Akt1 było używane do sondowania Akt1 w elucji API5, CCNB1, CDK1, BUB3 i SH3PX1.

klasyGO

klasyGO przedstawiające funkcję każdego interaktora Akt1 zostały określone z baz danych UniProt (http://www.uniprot.org/) i EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Po dokładnej ręcznej kuracji, zidentyfikowane interaktory Akt1 zostały podzielone na 3 główne klasy funkcjonalne, tj. proliferacja i przeżycie, metabolizm i synteza białek. Pozostałe zostały przedstawione jako wspólna klasa zwana „inne”, która obejmowała białka o funkcjach takich jak transport, hematopoezy, itp.

Znoszenie genów przy użyciu siRNA

Standaryzacja

Aby określić optymalne stężenie siRNA do transfekcji, 1,2 × 105 komórek HEK293 zostało wysianych na płytce 12-dołkowej. siRNA przeciwko PLK1 zostało użyte jako kontrola pozytywna we wszystkich próbach znokautowania. Zakres stężeń siRNA od 10 nM do 50 nM został poddany transfekcji przy użyciu odczynnika do transfekcji dharmafect, zgodnie z protokołem dostawcy. Zmiany w poziomie ekspresji białek monitorowano metodą western blotting odpowiednio po 24 godzinach, 48 godzinach i 72 godzinach (Supplementary Figure 2). Kilka innych celów (SH3PX1, AKT1, CCNB1 i SLC25A5) zostało znokautowanych, a efekt znokautowania został określony przez western blotting. GAPDH wykorzystano jako kontrolę obciążenia.

Znokautowanie białek docelowych

Białka wykazujące zaburzoną asocjację z Akt1 podczas gdy komórka przechodziła z fazy G0 do fazy G1/S cyklu komórkowego zostały znokautowane indywidualnie w komórkach HEK293 i zbadane przez FACS. Każdy siRNA został ponownie zawieszony w 1x buforze siRNA, aby uzyskać stężenie 20 µM. Transfekcję przeprowadzono w trzech egzemplarzach 24 godziny po posianiu komórek; wraz z odpowiednimi kontrolami pozytywnymi i negatywnymi. Każdy siRNA rozcieńczano do stężenia roboczego 25 nM w RPMI do końcowej objętości 50 µl i przechowywano w temperaturze pokojowej przez 5 minut inkubacji. Podobnie, odczynnik do transfekcji również rozcieńczano w RPMI do objętości 50 µl i przechowywano do inkubacji w podobnych warunkach. Zarówno siRNA, jak i odczynnik do transfekcji mieszano delikatnie w celu utworzenia kompleksów i kontynuowano inkubację przez kolejne 20 minut w temperaturze pokojowej. Objętość końcową uzupełniano do 500 µl podłożem zawierającym 10% surowicy. Następnie kompleksy te delikatnie dodawano do komórek i kontynuowano inkubację w temperaturze 37 °C. Po 24 godzinach media hodowlane wymieniano na świeże 10% pożywki. W końcu, 48 godzin po transfekcji, wydajność transfekcji była określana poprzez monitorowanie siGLO pod mikroskopem odwróconym Nikon Ti.

Akwizycja i analiza FACS

W 48 godzin po transfekcji, komórki były krótko odwirowywane, a media aspirowane. Komórki wybarwiano 300 µl roztworu jodku propidium zawierającego 0,1 mg/ml jodku propidium (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml cytrynianu sodu (Sigma) i 20 µg/ml RNazy (Sigma) przez 30 minut w 4 °C. Wybarwione komórki natychmiast przenoszono do probówek BD FACS i poddawano akwizycji w programie BD FACS Canto.

Uzyskane dane analizowano przy użyciu oprogramowania FlowJo. Histogramy DNA analizowano w celu ilościowego określenia populacji sub G0, G0/G1, S i G2/M. Niewielkie przesunięcia zaobserwowano w populacjach G0/G1 i G2/M, dlatego do analizy tych populacji wykonano ręczne bramkowanie.

Obliczanie PDT i RT

PDT i RT w fazach G1, S i G2 cyklu komórkowego obliczono po znokautowaniu siRNA zestawu białek wykazujących zaburzoną asocjację z Akt1 w fazie G1/S. PDT dla tych 23 genów, wraz z kontrolą, monitorowano w komórkach HEK293 przez 72 godziny. Krótko mówiąc, 10 000 komórek posiano na płytkach 96-dołkowych, w 100 µl podłoża RPMI z 10% surowicą. Następnego dnia przeprowadzono transfekcję siRNA w trzech powtórzeniach dla każdego białka docelowego i uznano ją za punkt czasowy 0 godzin. Liczbę komórek określano dla nietraktowanych komórek HEK293 metodą barwienia błękitem trypanu. Po 24 godzinach pożywkę zawierającą kompleksy siRNA zastępowano świeżym RPMI zawierającym 10% surowicy. Następnie liczono komórki dla każdej z komórek transfekowanych siRNA, aby reprezentować 24-godzinny punkt czasowy. Następnie, zestaw komórek, działających w hodowli równoległej, zbierano i liczono odpowiednio w punktach czasowych 48 godzin i 72 godzin.

where; % populacji komórek określono na podstawie akwizycji FACS.

Dostępność danych

Dane ze spektrometrii mas zostały zdeponowane jako zestaw danych „Defining the Akt1 interactome and delineating alterations in its composition as a function of cell cycle progression.” do ProteomeXchange poprzez bazę danych PRIDE. Jest on publicznie dostępny za pośrednictwem ProteomeXchange z identyfikatorem ProteomeXchange: PXD005557. Zestaw danych składa się z 12 surowych plików (wiff i wiff.scan) i powiązanych 18 plików pilotów białkowych.

.