6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) jest najszerzej badaną platformą dla różnych koniugacji i zastosowań biotechnologicznych. Jest to wirus dwudziestościanowy o średnicy 30 nm, składający się z dwudzielnego, jednoniciowego genomu RNA o pozytywnym sensie, przy czym każda cząsteczka RNA jest zamknięta w oddzielnej cząsteczce. Kapsyd CPMV składa się z 60 kopii każdej z dwóch różnych podjednostek CP (określanych jako mała, 24 kDa, i duża, 42 kDa) o symetrii pseudo T = 3 ikosaedrycznej. Ze względu na obecność wysoce symetrycznej i heteromerycznej natury kapsydu, CPMV stwarza niezwykłą możliwość różnicowego wprowadzania (w pięciokrotnej, trzykrotnej lub obu pozycjach) wielu rodzajów funkcjonalności poprzez specyficzną inżynierię genetyczną i chemiczną z kontrolą zarówno nad rozmieszczeniem przestrzennym, jak i stopniem wielowartościowości (Uchida i in., 2007; Young i in., 2008; Steinmetz, 2010; Wen i in., 2016). CPMV może być oczyszczany w dużych ilościach z zainfekowanych liści i jest stabilny w szerokim zakresie temperatur (do 60°C) i w zakresie pH 3,0-9,0 oraz jest odporny na działanie niektórych rozpuszczalników organicznych (Steinmetz i in., 2009). Kapsydy CPMV są wykorzystywane do kontrolowanej immobilizacji aktywnych enzymów. Wykorzystanie kapsydu CPMV do szablonowego wytwarzania nanocząstek metalicznych metodą bezelektrodowego osadzania (ELD) i mineralizacji w różnych procesach pozwoliło na wytworzenie cienkich warstw metali i stopów o jednolitej grubości i składzie. Wiriony CPMV są wykorzystywane jako nanobudulec do kontrolowanej budowy struktur 2-D i 3-D z wykorzystaniem podejścia bottom-up, warstwa po warstwie (LbL) do potencjalnych zastosowań jako urządzenia nanoelektroniczne lub elektrochemiczne biosensory wielokrotne (przegląd w Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a, 2016; Narayanan i Han, 2017a).

Naturalne cząstki CPMV i CPMV derywatyzowane kompleksami metali lantanowców zostały uznane za bezpieczne i nietoksyczne, w oparciu o badania biodystrybucji, toksyczności i patologii tych cząstek in vivo (Rae i in., 2005; Singh i in., 2007). Stwierdzono, że CPMV jest związany z obszarami zapalenia i wywołuje przerwanie bariery krew-mózg podczas infekcji ośrodkowego układu nerwowego (CNS) u myszy (Shriver et al., 2009). CPMV z powierzchniową PEGylacją wykazał niską immunogenność, a internalizacja została uniemożliwiona w kilku typach komórek dzięki redukcji wiązania niespecyficznego (Raja i in., 2003). Manchester i współpracownicy odkryli, że znakowany fluorescencyjnie CPMV ma endogenną zdolność do bycia pobieranym przez komórki śródbłonka naczyniowego i może być stosowany jako sonda do obrazowania przyżyciowego w celu wizualizacji naczyń i przepływu krwi do głębokości 500 μm przez 72 h w żywych embrionach myszy i kurcząt (Lewis i in., 2006). Stwierdzono, że CPMV ma naturalną zdolność wiązania się z powierzchniową wimentyną, białkiem cytoszkieletowym, które moduluje architekturę i dynamikę komórek, i stwierdzono jego nadekspresję w komórkach śródbłonka, komórkach nowotworowych i zapalnych (Koudelka i in., 2009). Biokompatybilność, naturalna interakcja z wimentyną i cechy retencji śródbłonka CPMV zostały dalej wykorzystane do obrazowania angiogenezy guza i naprowadzania guza in vivo (Leong i in., 2010; Steinmetz i in., 2011; Yildiz i in., 2011; Wen i in., 2015a).

Zewnętrzna powierzchnia kapsydu CPMV została szeroko zmodyfikowana przy użyciu naturalnie występujących lub genetycznie zmodyfikowanych odsłoniętych reszt lizyny, cysteiny, tyrozyny oraz reszt kwasu asparaginowego i glutaminowego za pomocą standardowych chemicznych metod koniugacji i koniugujących cross-linkerów w celu dołączenia kilku odczynników, takich jak nanocząstki Au, redoks reaktywne odmiany metylowe wiologenu, organometaliczne odmiany karboksylanowe ferrocenu, fluorofory, biotyna, łańcuchy PEG, pochodne stylbenu, węglowodany, heterologiczne białka (np.g., ludzka holotransferyna, lizozym T4, domiana LRR internaliny B i produkt genu Intron 8 receptora kinazy tyrozynowej HER2), przeciwciała, oligonukleotydy, półprzewodnikowe kropki kwantowe i fulereny. Wbudowywanie nienaturalnych aminokwasów do kapsydu CPMV prowadzono za pomocą wielu ortogonalnych metod chemicznych (takich jak chemoselektywna strategia ligacji hydrazonowej i katalizowana miedzią cykloaddycja azydkowo-alkilowa (CuAAC) lub reakcja „click”). Te wysiłki ułatwiły zastosowanie cząsteczek CPMV jako sond optycznych, kandydatów na szczepionki oraz nanourządzeń pamięciowych i sensorowych (przegląd w Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso i Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff i Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan i Han, 2017a). CPMV i TMV zostały załadowane w celu przenoszenia środków kontrastowych dla dwumodalności rezonansu magnetycznego (MR) i obrazowania optycznego, a obie modalności wykazały specyficzność wiązania fibryny in vitro z obecnością peptydów docelowych. Badania przedkliniczne w modelu fotochemicznego urazu tętnicy szyjnej w zakrzepicy potwierdziły naprowadzanie skrzeplin przez nanoprobelki, przy czym wydłużone pręciki TMV wykazywały znacznie większe przywiązanie do skrzeplin niż icosahedralne CPMV (Wen i in., 2015b,c). CPMV ozdobione peptydami E7p72 (peptyd o wysokim powinowactwie wiążący epidermalny czynnik wzrostu podobny do domeny 7 (EGFL7), który specyficznie celuje w ludzkie komórki śródbłonka) ukierunkowane do neowaskularyzacji związanej z guzem z wysoką specyficznością, jak oceniono za pomocą obrazowania przyżyciowego (Cho i in., 2017).

Protokoły montażu in vitro i in vivo dla podjednostek kapsydu CPMV nie są jeszcze dobrze ustalone. To ograniczyło jego potencjał do wykorzystania jako nanokontenera do enkapsulacji cząsteczek ładunku. Natywna zawartość kwasu nukleinowego w wirusach CPMV została wykorzystana jako elektrostatyczna gąbka do przyciągania środków obrazowania i cząsteczek terapeutycznych za pomocą prostej techniki infuzji (Yildiz et al., 2013). Przejściowa koekspresja prekursora CPMV (VP60), który składa się z połączonych dużych i małych białek oraz proteinazy 24K do proteolitycznego przetwarzania VP60 w roślinach spowodowała powstanie VLPs CPMV (eCPMV), które były całkowicie pozbawione RNA (zarówno wirusa jak i gospodarza) (Saunders i in., 2009). Takie puste kapsydy zostały wykorzystane do przenoszenia szerokiej gamy cząsteczek ładunku, takich jak metale, barwniki fluorescencyjne czy leki (Culver i in., 2015; Wen i in., 2015a; Narayanan i Han, 2017a). Fluorofory, znaczniki powinowactwa do biotyny, PEG i różne peptydy zostały selektywnie umieszczone na wewnętrznej powierzchni pustego CPMV poprzez ukierunkowanie na reaktywne lizyny (Wen i in., 2012b). Skuteczność eCPMV jako szczepionki in situ wykazano w mysich modelach przerzutowego czerniaka, raka piersi, raka jajnika i raka jelita grubego, gdzie indukowała ona przeciwnowotworową odpowiedź immunologiczną poprzez wyzwalanie aktywacji i infiltracji neutrofili, co skutkowało profilem chemo/cytokinowym prowadzącym do aktywacji odporności adaptacyjnej. Większość myszy rechallengowanych z guzami na przeciwległej flance całkowicie odrzucała rechallengowany guz (Lizotte i in., 2016). Intratumoralne dostarczenie magnetycznej nanocząstki (mNP) w celu wywołania hipertermii i eCPMV w połączeniu poprawiło miejscową i systemową skuteczność leczenia nowotworów (opóźnienie wzrostu wtórnego guza (efekt abscopal) i odporność na rechallenge guza) w modelach komórek nowotworowych gruczolakoraka sutka myszy C3H/MTG-B i czerniaka C57-B6 myszy/B-16-F10 (Hoopes i in., 2017a). Wykorzystując osiem spontanicznych nowotworów psów (dwa czerniaki jamy ustnej, trzy amelioblastoma jamy ustnej i jeden rak), Hoopes i wsp. (2017b) wykazali, że hipofrakcjonowana radioterapia i hipertermia indukowana mNP oraz śródmiąższowe leczenie eCPMV w połączeniu wywoływały wzmocnione odpowiedzi immunologiczne.

Aby wykorzystać CPMV do ukierunkowanego dostarczania leków do komórek nowotworowych i przezwyciężyć naturalną interakcję między CPMV a komórkami ssaków, zastosowano reakcję „kliknięcia”, aby sprzęgnąć PEG i ligand folianowy moiety (CPMV-PEG-FA) do CPMV. Koniugacja ta umożliwiła specyficzne ukierunkowanie CPMV na receptory folianowe (FRs) wykazujące ekspresję w komórkach HeLa i KB (Destito et al., 2007). Ukierunkowanie CPMV na komórki nowotworowe neuroblastoma zostało osiągnięte poprzez modyfikację genetyczną CPMV, tak aby zawierał analog neuropeptydu Y (NPY) jako ligandu ukierunkowującego. Wykazano, że CPMV-NPY oddziaływał specyficznie z komórkami SK-N-MC, które nadekspresjonowały receptor Y1 (Destito i in., 2009; Ma i in., 2012). Obrazowanie ukierunkowane na receptory zostało osiągnięte poprzez zakotwiczenie krótkich sekwencji peptydowych (F56 i bombesyna specyficzna dla receptora-1 czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGFR-1)) i receptorów peptydu uwalniającego gastrynę (GRPR), odpowiednio do CPMV. Te oparte na CPMV sensory okazały się specyficzne w wiązaniu się z komórkami nowotworowymi, które wykazują nadekspresję tych receptorów na powierzchni komórek (Brunel i in., 2010; Steinmetz i in., 2011). Wen i Steinmetz (2014) opracowali podejście bottom-up do syntezy nanocząstek CPMV, dimerów i złożeń zawierających ligandy celujące (cykliczne peptydy RGD) oraz barwniki fluorescencyjne i stwierdzili, że symetryczna prezentacja peptydów RGD i dimeryzacja nanocząstek zwiększyła skuteczność celowania w komórki nowotworowe.

CPMV został z powodzeniem wykorzystany do wyświetlania kilku heterologicznych peptydów w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej. Immunizacja zwierząt każdą z tych chimer wywołała silną humoralną odpowiedź immunologiczną, która chroniła przed wyzwaniem ze strony danego patogenu. Wielowartościowa ekspozycja cząsteczek przeciwwirusowych i węglowodanów na CPMV ułatwiła ich wykorzystanie do zastosowań terapeutycznych (Lomonossoff i Evans, 2011; Koudelka i in., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali i wsp. (2013) ustanowili kowalencyjną koniugację dox do CPMV poprzez wiązanie amidowe lub mostek disulfidowy z wykorzystaniem reszt lizynowych lub cysteinowych na zewnętrznej powierzchni CPMV. Obciążone dox CPMV wykazywały wyższy efekt zabijania komórek niż wolne dox, nawet przy niskich dawkach. CPMV zmodyfikowany koroną ujemnie naładowanych dendronów został użyty do załadowania dodatnio naładowanych fotouczulaczy (do terapii fotodynamicznej (PDT)). Ten hybrydowy system nośników PDT-CPMV był skuteczny w zabijaniu zarówno komórek czerniaka, jak i makrofagów w warunkach in vitro (Wen i in., 2016). Aby przezwyciężyć ograniczające dawkę niespecyficzne toksyczności trójwartościowego chromu (korzystnego mineralnego składnika odżywczego), który może selektywnie hamować proliferację indukowanych wysokim poziomem glukozy ludzkich komórek mięśni gładkich aorty (HASMC) in vitro, Chlorek chromu został wprowadzony do wnętrza CPMV poprzez infuzję, a powstałe w ten sposób cząstki CPMV z ładunkiem CrCl3 (CPMV-Cr) znacząco zmniejszyły proliferację HASMC indukowaną glukozą i wykazały działanie przeciwmiażdżycowe w warunkach hiperglikemii (Ganguly i in., 2016).