PCR genu mecA

Fragment 188-bp w obrębie genu mecA oraz fragment 178-bp w obrębie specyficznego dla S. aureus specyficznego genu Sa442 amplifikowano dla izolatów 1 i 2 w oddzielnych reakcjach na LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Niemcy) z użyciem zieleni SYBR ze starterami Mec-S i Mec-A lub Sa442-F i Sa442-RS, odpowiednio, jak opisano wcześniej (5). Izolaty mecA-dodatnie generują temperatury topnienia zieleni SYBR 79°C. Izolaty Sa442-dodatnie również generują temperaturę topnienia SYBR green wynoszącą 79°C. S. aureus ATCC 29213 (wrażliwy na oksacylinę) i S. aureus ATCC 43300 (oporny na oksacylinę) były używane jako kontrole dla genu Sa442 oraz jako kontrole negatywne i pozytywne, odpowiednio, dla genu mecA. W przeciwieństwie do kontroli, dla izolatów 1 i 2 nie wygenerowano produktu mecA ani Sa442. Przeprowadzono dodatkową PCR w celu wykrycia większego, 533-bp fragmentu genu mecA (4). W przypadku izolatów 1 i 2 oraz S. aureus ATCC 29213 nie wygenerowano żadnego produktu, natomiast produkt o oczekiwanej wielkości został wygenerowany z S. aureus ATCC 43300. Gen 16S rRNA, używany jako kontrola pozytywna, został amplifikowany ze wszystkich szczepów (dane nie pokazane).

Dokładne i terminowe wykrywanie oporności na metycylinę u S. aureus jest ważną funkcją klinicznego laboratorium mikrobiologicznego (20). Podczas gdy wykrywanie genu mecA metodą PCR jest złotym standardem, wykazano, że test aglutynacji lateksowej PBP2a jest prostym i szybkim testem, o dobrej charakterystyce działania, umożliwiającym wykrywanie oporności na metycylinę zarówno u S. aureus, jak i u koagulazoujemnych gatunków gronkowców, niezależnie od potrzeby wcześniejszej indukcji w niektórych przypadkach (1, 21). Test PBP2a wykorzystuje cząsteczki lateksu uczulone przeciwciałami monoklonalnymi podniesionymi przeciwko PBP2a (11). Swoistość tego testu podobno zbliża się do 100% (18, 19). Chociaż nie ma doniesień dotyczących wyników testów aglutynacji lateksowej PBP2a dla izolatów S. intermedius, fałszywie dodatnie wyniki PBP2a odnotowano w przypadku dwóch izolatów S. warneri, jednego w 1 minucie, a drugiego w 6 minucie, które były ujemne pod względem mecA PCR, a MIC oksacyliny wynosiło ≤0,5 μg/ml (21). Zgodnie z ulotką dołączoną do opakowania przez producenta, reakcje fałszywie dodatnie są zazwyczaj słabymi aglutynacjami, które są często ujemne przy powtórnym badaniu ze świeżą kulturą. Jednakże stwierdziliśmy, że nasze dwa izolaty były wielokrotnie dodatnie po wielokrotnych podhodowlach, przy czym jeden z nich był silnie dodatni. Szczep S. intermedius ATCC 29663 był w rzeczywistości ujemny w teście PBP2a, ale był również fenotypowo różny od dwóch szczepów klinicznych w odniesieniu do pozytywnej fermentacji mannitolu, negatywności dla β-laktamaz i wrażliwości na penicylinę (wyniki nie pokazane).

Dodatniość na koagulazę jest powszechnie stosowana do przypisywania znaczenia klinicznego i patogenności izolatom Staphylococcus spp. Podczas gdy S. aureus jest najczęstszym gronkowcem koagulazododatnim izolowanym w laboratorium klinicznym, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae i niektóre szczepy S. hyicus są również koagulazododatnie (1). Laboratoria często stosują kombinację testów do wykrywania wolnej koagulazy lub czynnika krzepnięcia z lub bez białka A w celu identyfikacji gronkowców koagulazo-dodatnich. Izolaty S. intermedius są pozytywne dla wolnej koagulazy, ale są negatywne dla białka A, a 14% izolatów ma czynnik zlepiający, co tłumaczyłoby pozytywną koagulazę ślizgową i słabo pozytywny BACTi Staph latex dla izolatu 1 (6). Jak opisano wcześniej, stwierdziliśmy, że pozytywność pirolidonylo arylamidazy jest szybkim sposobem określenia, że koagulazo-dodatni gronkowiec nie jest S. aureus (10). Uważamy, że nasze przypadki sugerują, że prawdziwa częstość występowania S. intermedius w infekcjach ran u ludzi jest prawdopodobnie niedoszacowana, ponieważ wszystkie gronkowce koagulazododatnie są często zaliczane do S. aureus (17). Wobec braku możliwości ostatecznej identyfikacji S. intermedius metodami fenotypowymi lub biochemicznymi, sekwencjonowanie genu 16S rRNA okazało się przydatne do klasyfikacji taksonomicznej gatunków Staphylococcus i Macrococcus (8).

Wstępne badanie z 1989 roku wykazało, że 72% izolatów S. intermedius pochodzących z dziąseł psów i zakażeń ran spowodowanych przez psy było wrażliwych na penicylinę, a żaden nie był oporny na oksacylinę (16). Nowsze badania wykazały, że oporność na oksacylinę stanowi coraz większy problem wśród izolatów S. intermedius, przy czym w przypadku izolatów z nosa, oczu i ropni psów odnotowano od 60 do 85% wyższy wskaźnik oporności na oksacylinę w porównaniu z izolatami z innych miejsc (7). W pierwszym zakażeniu u człowieka wywołanym przez metycylinooporny S. intermedius, gdzie był on czynnikiem wywołującym zapalenie płuc, MIC oksacyliny wynosił 32 μg/ml (3). Oba nasze izolaty były oporne na penicylinę i były β-laktamazo-dodatnie; MIC oksacyliny dla tych izolatów wynosiło 0,125 μg/ml. Oporność na penicylinę u tych izolatów, przy braku oporności na oksacylinę z ujemnym wynikiem mecA PCR i wrażliwości na kombinacje β-laktamów i inhibitorów β-laktamazy, może być wyjaśniona pozytywnym wynikiem testu na β-laktamazę. Stosując zestaw primerów ukierunkowanych na 533-bp fragment genu mecA, Gortel i wsp. potwierdzili, że gen mecA nadaje oporność na metycylinę u gronkowców izolowanych od psów (4). Badacze ci stwierdzili, że wśród 10 koagulazododatnich szczepów gronkowców będących nosicielami mecA, 9 było S. aureus, a 1 S. intermedius. Wysunęli oni hipotezę, że różnica w częstości występowania oporności na metycylinę u S. intermedius w porównaniu z S. aureus wynikała z różnicy w regulacji mecA między tymi gatunkami lub braku intensywnej presji selekcyjnej antybiotyków na S. intermedius (4). Chociaż nie istnieją specyficzne kryteria interpretacyjne NCCLS dla gronkowców koagulazo-dodatnich innych niż S. aureus, wyniki badania wrażliwości na oksacylinę metodami fenotypowymi i genotypowymi (PCR genu mecA przy użyciu dwóch zestawów primerów ukierunkowanych na fragmenty 188- i 533-bp), w połączeniu z niskimi wartościami MIC oksacyliny w porównaniu z wartościami podawanymi wcześniej dla opornych na oksacylinę izolatów S. intermedius (MIC > 4 μg/ml), ustala, że izolaty 1 i 2 w tym badaniu są wrażliwe na oksacylinę (3, 4).

Przyjęto, że oporność na metycylinę u S. aureus jest głównie spowodowana nabyciem dodatkowego białka wiążącego penicylinę, PBP2a, kodowanego przez gen mecA. Poszukiwania pochodzenia genu mecA doprowadziły do zidentyfikowania możliwego prekursora ewolucyjnego u S. sciuri, komensala zwierząt. Homologiczny gen mecA u S. sciuri wykazał 79,5% podobieństwo sekwencji DNA do genu mecA S. aureus i 88% identyczność aminokwasową z PBP2a. Homolog mecA S. sciuri nie nadaje oporności na metycylinę w naturze. Jednakże Couto i wsp. zidentyfikowali metycylinooporne izolaty S. sciuri od ludzi, u których nadekspresja homologu mecA, wynikająca z insercji elementu IS256 w górę łańcucha genu strukturalnego lub pojedynczych nukleotydów w regionie promotora, powodowała wytwarzanie białka funkcjonalnie przypominającego PBP2a (2). Podobnie jak izolaty S. sciuri, opisane tutaj izolaty S. intermedius mogą zawierać homolog mecA kodujący białko podobne do PBP2a, które reaguje krzyżowo z testem aglutynacji lateksowej PBP2a, ale nie nadaje oporności na metycylinę. Możliwa jest również mimikra antygenowa z zupełnie niespokrewnionym białkiem. W obu przypadkach mamy nadzieję podnieść świadomość w społeczności mikrobiologicznej, że istnieją izolaty kliniczne, które mogą kwestionować swoistość testu aglutynacji lateksowej PBP2a.

W podsumowaniu przedstawiamy pierwsze doniesienie o fałszywie dodatnich wynikach PBP2a dla dwóch szczepów S. intermedius, które w połączeniu z początkowym błędem w interpretacji testów fenotypowych doprowadziły do błędnej identyfikacji jako MRSA. Fałszywie dodatnie wyniki PBP2a mogą prowadzić do błędnie ukierunkowanych prób kontroli zakażeń, niepotrzebnego stosowania antybiotyków, takich jak wankomycyna, oraz ogólnego wzrostu wydatków szpitala (20). Przypadki te podkreślają znaczenie aktywnego poszukiwania rozbieżnych wyników badań laboratoryjnych w celu uniknięcia błędów w sprawozdawczości. Dokładna identyfikacja gatunkowa gronkowców koagulazo-dodatnich jest niezbędna do określenia patogenności, znaczenia klinicznego, wzorów wrażliwości i epidemiologii izolatów klinicznych.

.