Abstract

Niewiele badań przeprowadzono na florze medycznej Półwyspu Jukatan w Meksyku w poszukiwaniu nowych środków terapeutycznych, w szczególności przeciwko nowotworom. W niniejszej pracy ocenialiśmy potencjał cytotoksyczny ekstraktu z Bonellia albiflora, rośliny wykorzystywanej w tradycyjnej medycynie Majów do leczenia przewlekłych urazów jamy ustnej. Wykonaliśmy ekstrakty metanolowe z różnych części rośliny metodą ekstrakcji przy użyciu aparatu Soxhleta. Przeprowadziliśmy frakcje ciecz-ciecz na każdym ekstrakcie z rozpuszczalników o rosnącej polarności. Wszystkie ekstrakty i frakcje zostały ocenione pod względem aktywności cytotoksycznej w stosunku do czterech ludzkich linii komórkowych nowotworowych i jednej normalnej linii komórkowej za pomocą testu redukcji barwnika tetrazolowego (MTT) w 96-dołkowych płytkach do hodowli komórkowych. Metanolowy ekstrakt z kory korzenia posiadał znacznie większą aktywność cytotoksyczną w ludzkiej linii komórkowej raka gardła (KB); jego frakcja heksanowa koncentrowała aktywne metabolity i indukowała apoptozę z aktywacją kaspaz 3 i 8. Wyniki wskazują na potencjał cytotoksyczny frakcji heksanowej B. albiflora i uzasadniają znaczenie badań nad tradycyjnymi roślinami leczniczymi Majów.

1. Wstęp

Medycyna tradycyjna to praktyka stosowana od starożytności do czasów nam współczesnych przez mieszkańców rdzennych pueblos Meksyku, do których zalicza się ludność Majów zamieszkującą Półwysep Jukatan w Meksyku. W tradycyjnej medycynie Majów rośliny mają ogromne znaczenie, co można uznać za dowód ich skuteczności w zwalczaniu wielu rodzajów chorób. Stanowią one również jedną z najważniejszych alternatyw dla opieki zdrowotnej, przede wszystkim w społecznościach, w których podstawowa opieka zdrowotna jest niedostępna. Ponadto można je szeroko wykorzystywać jako naturalny zasób odnawialny. Wraz z tym, co zostało wcześniej opisane, tradycyjna medycyna rdzennych mieszkańców pueblos została uznana przez Światową Organizację Zdrowia (WHO), co spowodowało silny impuls do badań nad roślinami leczniczymi.

Piśmiennictwo etnobotaniczne Majów w swej większości składa się z opracowań historycznych lub opisowych, w których treści przeważa kompendium chorób i sposobów leczenia znanych majańskim uzdrowicielom z różnych epok. Majowie znali i leczyli różne choroby, w tym te pochodzenia zakaźnego (infekcje jelitowe, zakaźne zapalenie skóry, infekcje dróg oddechowych), choroby przewlekłe (astma, zmęczenie, zapalenie nerek, nadciśnienie) oraz choroby o podłożu psychologicznym (bezsenność, nerwowość, histeria). Ponadto, leczyli inne choroby, takie jak następujące: ropnie; modzele; nagniotki, twarde wypukłości; polipy; guzy; i brodawki lub owrzodzenia, ogólnie rzecz biorąc, namacalne lub widoczne na skórze .

W tradycyjnej medycynie Majów z Półwyspu Jukatan, „rak” jest znany jako choroba lub zestaw chorób, które mogą objawiać się jako afekt skóry lub subadjacent masy mięśniowej, lub afekt w postaci bólu w niektórych narządów wewnętrznych. Termin ten odnosi się do choroby trudnej do wyleczenia lub o nieprzyjemnym wyglądzie (gdy dotyczy skóry); jeśli jest to nowotwór wewnętrzny, wygląd pacjenta zdradza chorobę. Starzy mieszkańcy przypisali nazwy w języku Majów do tego zestawu objawów; w języku Majów „rak” jest znany jako „tsunuz” lub „tsunuztacan”, a twarde wypukłości lub guzy są znane jako „chu’uchum” .

Poprzednie badania wykazały, że wyciągi z roślin wykorzystywane w tradycyjnej medycynie Majów do leczenia oznak i objawów sugerujących raka posiadają aktywność cytotoksyczną . Podobnie, dwa badania przeprowadzone na dwóch gatunkach rodzaju Bonellia (Bonellia macrocarpa i Bonellia flammea) z Półwyspu Jukatan ujawniają obecność nowych związków, takich jak substancje czynne o działaniu antyrakotwórczym. W tym kontekście na Półwyspie Jukatan występuje pięć gatunków z rodzaju Bonellia, wśród których gatunki B. macrocarpa, B. flammea i B. albiflora są wykorzystywane w tradycyjnej medycynie Majów do leczenia schorzeń dermatologicznych. Spośród tych trzech gatunków tylko B. albiflora nie była przedmiotem żadnych badań fitochemicznych ani aktywności biologicznej. B. albiflora jest określana jako „Si’ik” w tradycyjnej medycynie Majów i jest stosowana jako środek przeciwkaszlowy w leczeniu ran skóry i jamy ustnej oraz do uśmierzania bólu zębów. W niniejszej pracy zaproponowaliśmy ocenę potencjału cytotoksycznego organicznych ekstraktów z B. albiflora.

2. Materiały i Metody

2.1. Materiał roślinny

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl i Källersjö został zebrany z różnych miejscowości w stanie Jukatan, Meksyk, latem 2010 roku. Materiał roślinny został zidentyfikowany i uwierzytelniony przez taksonomów z Departamentu Zasobów Naturalnych Centrum Badań Naukowych Jukatanu (CICY).

2.2. Substancje chemiczne

Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM), heat-inactivated fetal bovine serum (FBS), and penicillin and streptomycin (PS) were purchased from Gibco, Carlsbad, CA, USA. Bromek 3-(4-5-dimetylotiazol-2-ylo)-2,5-difenylo tetrazoliowy (MTT), dimetylosulfotlenek (DMSO) i etopozyd zakupiono w firmie Sigma, St. Louis, MO, USA. Zestawy do oznaczania kaspazy i zestaw do ladderyzacji apoptotycznego DNA zakupiono od BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USA.

2.3. Ekstrakcja i frakcjonowanie

Każda część roślinna została oddzielona, wysuszona i sproszkowana. Wysuszony proszek z oddzielonego materiału roślinnego (100 g) poddano wyczerpującej ekstrakcji przy użyciu aparatu Soxhleta w temperaturze 60°C metanolem (500 mL). Supernatanty filtrowano i odparowywano pod próżnią za pomocą rotametru w celu uzyskania suchego ekstraktu. Metanolowy ekstrakt z każdego materiału roślinnego (10 mg) zawieszano w 20 mL metanolu : wody (1 : 3) i ekstrahowano kolejno przy użyciu 50 mL rozpuszczalników o wzrastającej polarności: heksanu, dichlorometanu i octanu etylu, tak aby końcowym ekstraktem pozostałości była frakcja wodna. Odcisk palca aktywnego ekstraktu heksanowego (5 mg) uzyskano do chromatografii gazowej ze spektrometrią mas (GC-MS).

2.4. Linie komórkowe i hodowla

Linie komórkowe raka ustno-gardłowego (KB ATCC-CCL-17), raka krtani (Hep-2), gruczolakoraka szyjki macicy (HeLa ATCC-CCL-2) i raka płaskonabłonkowego szyjki macicy (SiHa ATCC-CCL-35), jak również jedna normalna linia komórkowa, canine cell kidney (MDCK ATCC-CCL-34), z American Type Culture Collection (ATCC), zostały uprzejmie dostarczone przez Veronicę Vallejo-Ruíz z East Biomedical Research Center-IMSS. Komórki hodowano w podłożu DMEM, zawierającym 10% SFB uzupełnionym 100 jednostkami/mL penicyliny G i 100 μg/mL streptomycyny w 5% CO2-95% nawilżonym powietrzu w temperaturze 37°C.

2.5. Badanie cytotoksyczności

Cytotoksyczność oznaczano testem MTT zgodnie z metodą opisaną przez Denizota i Langa z pewnymi modyfikacjami. Krótko mówiąc, zdolne do życia komórki z każdej linii komórkowej były wysiewane na płytkę 96-dołkową i inkubowane przez 24-48 h. Gdy komórki osiągnęły >70% konfluencji, pożywka była wymieniana i komórki były traktowane ekstraktem rozpuszczonym w DMSO (maksymalne stężenie 0,05%) w stężeniu od 2,34 do 300 g/mL. Po 48 h inkubacji do każdego dołka dodawano 10 μL MTT (5 mg/mL) i inkubowano w temperaturze 37°C przez 4 h. Pożywkę usuwano, a osad formazanu rozpuszczano w 100 μL zakwaszonego izopropanolu (0,4 N HCl). Gęstość optyczną oznaczano za pomocą spektrofotometru przy długości fali 540 nm. Komórki traktowane 0,05% DMSO i docetakselem stosowano odpowiednio jako kontrolę negatywną i pozytywną. Stężenie ekstraktu, które zabijało 50% komórek (CC50) obliczano za pomocą programu GraphPad Prism 4.00. Wszystkie oznaczenia wykonywano w trzech powtórzeniach. Linia komórkowa MDCK została użyta do oceny selektywnego indeksu (SI) ekstraktów. SI jest zdefiniowany jako stosunek aktywności cytotoksycznej z komórek prawidłowych i linii komórek nowotworowych.

2.6. Analiza GC-MS

Rozdzielanie chromatograficzne przeprowadzono metodą analizy GC-MS na chromatografie gazowym Agilent, model 6890N, sprzężonym z detektorem selektywnym masowym, model 5975B. Związki rozdzielano na kolumnie kapilarnej DB-5 ms (30 m × 0,32 mm i.d., grubość warstwy 0,25 μm) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA). Jeden mikrolitr próbki wstrzykiwano do GC-MS stosując tryb rozdzielony (50 : 1). Temperatura iniektora wynosiła 250°C. Temperaturę kolumny programowano w następujący sposób: temperatura początkowa 160°C przez 3 min, 10°C/min do 240°C, 240°C przez 2 min, 5°C/min do 250°C, 250°C przez 10 min, 5°C/min do 300°C i 300°C przez 10 min. Warunki pracy detektora mas były następujące: tryb elektronicznego oddziaływania (EI) przy 70 eV; temperatura źródła: 230°C; szybkość skanowania: 1 skan/s; zakres akwizycji mas: 20-600 amu; opóźnienie rozpuszczalnika, 4 min. Gazem nośnym był hel w tempie 1 mL/min. Składniki lotne zidentyfikowano wstępnie poprzez porównanie ich widm masowych przy użyciu bazy danych NIST Standard Reference Database Version NIST 05 for Windows. Autentyczny wzorzec związku bonediolu został uprzejmie dostarczony przez Dr. Peraza-Sánchez z CICY.

2.7. Analiza fragmentacji DNA

Fragmentację DNA oznaczano zgodnie z metodą opisaną przez Tonga i wsp. W skrócie, komórki traktowano ekstraktem w stężeniu 10 i 50 μg/mL i inkubowano przez 6, 12 i 24 h. Po inkubacji, komórki zbierano przez odwirowanie i płukano dwukrotnie w lodowatym PBS. Do izolacji DNA użyto zestawu do drabinowania apoptotycznego DNA (BioVision apoptotic DNA ladder extraction kit) zgodnie z protokołem producenta; DNA w próbkach rozdzielono na 1,5% żelu agarozowym zawierającym 1 μg/mL bromku etydyny. Pasma DNA były wizualizowane w świetle ultrafioletowym i fotografowane.

2.8. Assays of Caspases Activities

Aktywność kaspaz 3, 8, i 9 wykonano przy użyciu zestawu FLICE/Caspase Colorimetric assay kit, zgodnie z protokołami producenta. Krótko mówiąc, komórki traktowane 10 lub 50 μg/mL ekstraktu przez 6, 12 lub 24 h były zbierane, przemywane PBS i odwirowywane przy 800 ×g przez 10 min w 4°C. Osad komórkowy zawieszano ponownie w 50 μL buforu do lizy i inkubowano na lodzie przez 10 min przed odwirowaniem przy 10 000 ×g przez 1 min. Supernatant zbierano do probówki o pojemności 1,5 mL i przechowywano w lodzie. Po zmierzeniu stężenia białka, 200 μg białka rozpuszczono w 50 μL buforu do lizy komórek. Do każdej próbki dodawano bufor reakcyjny z 10 mM DDT. Na koniec do próbek dodawano specyficzny substrat dla każdej kaspazy (DEVD-ρNA, IETD-ρNA i LEHD-ρNA), inkubowano w temperaturze 37°C przez 1 h i odczytywano przy długości fali 405 nm. Aktywność enzymu została wyrażona jako fold w stosunku do próbki kontrolnej.

3. Wyniki i Dyskusja

3.1. Cytotoksyczna aktywność ekstraktów metanolowych

Wyniki cytotoksyczności ekstraktów metanolowych z różnych części B. albiflora są podsumowane w tabeli 1. Ekstrakt metanolowy z kory korzenia wykazał najbardziej interesującą aktywność cytotoksyczną w porównaniu z ekstraktami z liści i kory łodygi B. albiflora, z CC50 12-31 μg/mL na czterech ludzkich liniach komórkowych raka. Linia komórkowa KB wykazała większą wrażliwość na ekstrakt z CC50 wynoszącym 12,64 μg/mL. Nienowotworowa linia komórkowa nerki psiej MDCK była mniej wrażliwa na działanie ekstraktu z SI wynoszącym >5 w ocenianych liniach komórkowych (Tabela 1). US National Cancer Institute (NCI) zaproponował, że surowe ekstrakty o potencjalnej aktywności cytotoksycznej to te, które prezentują CC50 ≤30 μg/mL; dlatego ten ekstrakt został zidentyfikowany jako ważny dla przyszłych badań. Dane te są podobne do tych uzyskanych w aktywnych ekstraktach metanolowych z korzeni B. macrocarpa na ludzkich liniach komórkowych: KB, gruczolakoraka prostaty (PC3), raka płaskonabłonkowego szyjki macicy (SiHa), gruczolakoraka piersi (MCF-7), gruczolakoraka szyjki macicy (HeLa) i raka krtani (Hep-2) .

Ekstrakt z liści był drugi pod względem największej aktywności, tylko na linii komórkowej KB z CC50 wynoszącym 23.85 μg/mL wg kryteriów NCI, a następnie ekstrakt z kory łodygi, który był mniej cytotoksyczny dla linii komórkowych KB i Hep-2.

3.2. Cytotoksyczna aktywność frakcji

Metanolowe ekstrakty z różnych części rośliny były frakcjonowane rozpuszczalnikami o wzrastającej polarności do późniejszych badań cytotoksyczności w liniach komórkowych. Frakcja heksanowa otrzymana w wyniku podziału ciecz-ciecz ekstraktu metanolowego z kory korzenia (HFBa) wykazywała lepsze działanie cytotoksyczne w porównaniu z ekstraktem oryginalnym, z CC50 pomiędzy 2 a 27 μg/mL w różnych liniach komórkowych (Tabela 2). SI frakcji heksanowej również poprawiło się w porównaniu do oryginalnego ekstraktu w ocenianych liniach komórkowych (SI = 5-54). Frakcje metanolowe ekstraktów z kory i liści nie były aktywne w stężeniach >200 μg/mL (dane nie pokazane).

Poprzednio przeprowadziliśmy badania bioguidalne w celu oceny aktywności antyproliferacyjnej B. macrocarpa, uzyskując izolację związku bonediol, który wykazał umiarkowaną aktywność w nowotworowych liniach komórkowych . Jednakże w obecnym badaniu nie wykazano działania cytotoksycznego HFBa porównywalnego z oryginalnym ekstraktem metanolowym w ocenianych liniach komórkowych (Tabela 2). Wyjaśnieniem tych wyników może być to, że bonediol hamuje pewien punkt proliferacji komórkowej (cykl komórkowy lub replikację DNA), podczas gdy efekty, które są obserwowane w badaniu cytotoksycznym to uszkodzenia lub ogólna toksyczność (apoptoza lub nekroza) .

HFBa prezentował lepsze efekty cytotoksyczne w porównaniu do bonediolu i był bardziej selektywny w kierunku guza niż w kierunku normalnych komórek; SI jest uważany za wskaźnik aktywności biologicznej i nie jest związany z cytotoksycznością, jeśli SI jest >10 . W tym względzie tylko HFBa spełniał te kryteria i był silniejszy w linii komórkowej KB z CC50 wynoszącym 2,73 μg/mL; ta linia komórkowa jest związana z rakiem jamy ustnej i jest zgodna z zastosowaniem rośliny w tradycyjnej medycynie Majów do przewlekłych zmian w jamie ustnej, termin, który może być związany z rakiem.

3.3. Analiza GC-MS

Identyfikacja i analiza chemiczna bioaktywnej frakcji heksanowej metodą GC-MS została przedstawiona w Tabeli 3. Chromatogram ujawnił w sumie osiem pików, z których sześć zostało zidentyfikowanych przez bazę danych: kwas dodekanowy; kwas tridekanowy; kwas 2-nonyl-malonowy, ester dimetylowy; stigmasta-7,16-dien-3-ol; 9,19-cyklo-lanost-24-en-3-ol; i bonediol. Ten ostatni został zidentyfikowany na podstawie czasu retencji i porównania widma masowego z autentycznym wzorcem wcześniej wyizolowanym z B. macrocarpa. Główne znalezione składniki były następujące: kwas 2-nonylo-malonowy, ester dimetylowy (37,39%), a następnie stigmasta-7,16-dien-3-ol (13,63%), kwas dodekanowy (13,22%), 9,19-cyklo-lanost-24-en-3-ol (9,90%) i bonediol (8,98%). Niezidentyfikowane składniki o czasach retencji 8,092 (6,22%) i 14,207 (5,38%), a także kwas n-tridekanowy (5,25%), były związkami o mniejszym znaczeniu w HFBa (Rysunek 1).

Peak no. Czas retencji (min) Peak relative (%) (relative abundance %) Component 1 5.802 13.221 200 (10), 171 (10), 157 (30), 143 (10), 129 (40), 115 (20), 101 (15), 85 (30), 73 (100), 60 (85), 43 (70), 29 (40). Kwas dodekanowy 2 7.012 5.256 214 (10), 185 (10), 171 (35), 157 (5), 143 (5), 129 (40), 115 (25), 97 (15), 85 (20), 73 (95), 60 (85), 43 (70), 29 (35). Kwas tridekanowy 3 8.091 6.222 208 (19), 166 (13), 152 (100), 137 (18), 121 (6), 107 (5), 91 (13), 77 (13), 55 (5), 41 (13), 28 (19). Niezidentyfikowany 4 9.826 37.396 259 (5), 156 (7), 145 (70), 132 (100), 113 (13), 100 (20), 87 (18), 69 (16), 55 (33), 41 (31), 29 (13). Kwas 2-nylomalonowy, ester dimetylowy 5 14.1927 5.381 350 (100), 209 (80), 195 (24), 179 (48), 164 (12), 151 (16), 136 (2), 75 (8), 57 (8), 43 (20), 28 (26). Niezidentyfikowany 6 16.389 8.983 294 (70), 209 (13), 179 (10), 153 (100), 139 (5), 123 (20), 77 (9), 41 (20). Bonediol 7 37.548 13.634 412 (22), 369 (10), 341 (10), 300 (15), 271 (80), 246 (20), 207 (90), 173 (10), 147 (40), 107 (43), 81 (75), 55 (80), 43 (100), 28 (40). Stigmasta-7,16-dien-3-ol 8 39.632 9.907 426 (25), 411 (100), 393 (45), 259 (10), 215 (10), 187 (15), 173 (15), 161 (15), 135 (25), 109 (40), 69 (90), 55 (40), 41 (45). 9,19-Cyklo-lanost-24-en-3-ol

Tabela 3

Skład chemiczny heksanowej frakcji B. albiflora.

Rysunek 1

Chromatografia gazowa HFBa.

Bonediol został wyizolowany z metanolowego ekstraktu korzeni B. macrocarpa jako składnik bioaktywny. W niniejszej pracy wykryto obecność tego związku w niskim stężeniu, co może być określane jako możliwy marker chemotaksonomiczny. Ponadto, w innych gatunkach, takich jak B. pungens, wyizolowano triterpen, a z B. ruscifolia dwa triterpeny, bez doniesień o aktywności biologicznej. W niniejszej pracy znaleźliśmy jedynie dowody na obecność triterpenu pochodzącego z lanosterolu w aktywnej frakcji heksanowej. Ponadto, wykryliśmy ubikwitynowany sterol, pochodną stigmasterolu. Według naszej wiedzy, jest to pierwszy przypadek, gdy oba związki zostały zgłoszone w tym rodzaju.

W ostatnich latach nie tylko badania nad medycznie bioaktywnymi związkami z roślin stały się częstsze, ale także badania samych ekstraktów roślinnych lub mieszanin związków, które razem mogłyby dać lepszą aktywność biologiczną niż ta wykazywana przez pojedynczy związek, stały się ponadto częste . W niniejszej pracy składniki te są opisane jako fingerprinting HFBa wykonany metodą GC-MS dla przyszłych standaryzacji.

3.4. Fragmentacja DNA

Zaobserwowaliśmy, że metanolowy ekstrakt z korzeni B. albiflora wykazywał typową morfologię apoptozy (dane nie pokazane) na liniach komórkowych KB. Podobnie, wykazano, że HFBa indukuje morfologię apoptozy na liniach komórkowych KB. Wyniki te skłoniły nas do oceny, czy frakcja heksaniczna, która wykazała największą cytotoksyczność i cechy morfologiczne apoptozy na linii komórkowej KB, może indukować ten proces; oceniliśmy więc fragmentację DNA, typową dla procesu apoptozy. Fragmentację DNA rejestrowano od mniejszej do większej wielkości w zakresie stężeń traktowania 10 lub 50 μg/mL i w zakresie czasu inkubacji 6-24 h. Rycina 2 przedstawia typową fragmentację DNA w komórkach KB po traktowaniu 50 μg/mL HFBa i 18-godzinnym okresie inkubacji. W kilku badaniach wykazano apoptotyczne działanie niektórych roślinnych ekstraktów metanolowych. Jednak niewiele badań dotyczyło charakterystyki chemicznej związków, które mogą posiadać tę aktywność. W tych nielicznych badaniach stwierdzono ogólnie, że nisko polarne frakcje organiczne są odpowiedzialne za efekt apoptotyczny na liniach komórkowych, co pokrywa się z wynikami uzyskanymi w niniejszej pracy .

Rysunek 2

Efekt heksanowego ekstraktu z korzenia Bonellia macrocarpa na fragmentację DNA w komórkach KB. Po traktowaniu komórek stężeniem 50 μg/mL B. macrocarpa przez 12 h, izolowano DNA i rozdzielano na 1,5% żelu agarozowym. DNA barwiono bromkiem etydyny i wizualizowano w świetle UV. Pasy od 1 do 4: pas 1 (kontrola negatywna): DNA zebrane z nietraktowanych komórek KB po 18 h; pas 2 (kontrola pozytywna): DNA zebrane z komórek KB traktowanych 50 μg/mL etopozydu po 18 h; pas 3: DNA zebrane z komórek KB traktowanych 50 μg/mL ekstraktu po 18 h; pas 4: marker masy cząsteczkowej DNA.

Nie wiadomo, czy związki zawarte w HFBa są odpowiedzialne za indukcję apoptozy, ale nie można jej przypisać pojedynczemu związkowi, takiemu jak bonediol, który, choć obecny w ekstrakcie, wymaga wysokich stężeń do indukcji apoptozy (dane nie pokazane), w przeciwieństwie do HFBa, który indukuje fragmentację DNA już przy stężeniu 10 μg/mL. W związku z powyższym, oprócz bonediolu, donosimy o obecności kwasu dodekanowego i pochodnej stigmasterolu jako składników HFBa. Związki te zostały powiązane z aktywnością cytotoksyczną obserwowaną dla heksanowej frakcji Crocus sativus . Ponadto, niektórzy autorzy wykazali, że pochodne stigmasterolu wykazują znaczącą aktywność cytotoksyczną w liniach komórek nowotworowych, która zależała od apoptozy. W szczególności, spinasterol (stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol) wykazał zmniejszenie częstości występowania guzów skóry in vivo . W rzeczywistości, spinasterol i pochodna opisana w tym badaniu różnią się podwójną enlace w pozycji 22 w spinasterolu i pozycji 16 w pochodnej stigmasterolu. Być może, stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol może przyczynić się do aktywności cytotoksycznej obserwowanej w tym badaniu. Ponadto wiadomo, że lanostany to grupa tetracyklicznych triterpenoidów pochodzących od lanosterolu, które wykazują liczne działania wobec komórek nowotworowych, w tym indukcję apoptozy. Możliwe, że związki typu lanostan i stigmasterol odnotowane w aktywnej frakcji heksanowej mają pewien stopień aktywności cytotoksycznej i efekt indukowania apoptozy. Jest prawdopodobne, że kilka związków obecnych we frakcji heksanowej działa synergistycznie w celu indukowania cytotoksyczności i apoptozy.

3.5. Analiza aktywności kaspaz

Aby wiedzieć, czy mechanizm aktywacji fragmentacji DNA był wywołany przez aktywację apoptozy szlakiem intrinsic czy extrinsic, ocenialiśmy aktywność kaspaz charakterystyczną dla każdego z nich. Okresy inkubacji wynosiły 2, 4, 6 i 12 h, aby uzyskać profil aktywacji. Kaspaza 8 została aktywowana po 6 h traktowania 50 μg/mL HFBa; wzrost był trzykrotnie większy w porównaniu do komórek kontrolnych bez traktowania (kontrola negatywna) (Figura 3). Nie zaobserwowano wzrostu aktywacji kaspazy 8 w okresach inkubacji 2, 4 i 12 h. Kaspaza 9 nie była aktywowana w komórkach KB po traktowaniu 50 μg/mL HFBa w czasie 2-12 h, co sugeruje brak aktywacji apoptozy przez szlak wewnątrzpochodny (Figura 4). Aktywność kaspazy 3 wzrosła czterokrotnie w porównaniu z aktywnością kontroli w komórkach traktowanych HFBa, co jest zgodne z aktywacją kaspazy 8 (Figura 5). Wzrost aktywności kaspazy 8 jest typowy dla aktywacji szlaku zewnątrzpochodnego apoptozy, który z kolei aktywuje inne prokaspazy, w tym kaspazę 3, co z kolei prowadzi do degradacji białek jądrowych, takich jak laminina A, fodryna, aktyna i gelsolina. Prowadzi to również do uwolnienia inhibitora białkowego DNaz aktywowanego przez kaspazę (ICAD), przekształcając go w enzym DNazę aktywowaną przez kaspazę (CAD), której celem jest degradacja DNA, jak przedstawiono na rycinie 2. Biorąc pod uwagę, że kaspaza 9 nie została aktywowana, wnioskujemy, że B. albiflora indukuje apoptozę na drodze zewnątrzpochodnej. Świadczy to o dużym potencjale tej frakcji jako alternatywnej lub wspomagającej terapii w leczeniu nowotworów. W literaturze można znaleźć kilka badań dotyczących ekstraktów roślinnych i ich wpływu na indukcję wewnątrzpochodnego szlaku apoptozy. Jednak niewiele badań wykazało aktywację zewnątrzpochodnego szlaku apoptozy przez ekstrakty roślinne; na przykład metanolowy ekstrakt Paeonia suffruticosa indukuje apoptozę w ludzkiej linii komórkowej raka żołądka (AG3), a ekstrakt z korzenia mniszka lekarskiego ma zdolność do indukowania apoptozy w linii komórkowej przewlekłej białaczki mielomonocytowej (CMML) i w lekoopornych komórkach czerniaka. Nie wiadomo, które ze związków obecnych w aktywnej frakcji B. albiflora mogą powodować aktywację zewnątrzpochodnego szlaku apoptozy. Niezależnie od tego, istnieją doniesienia o indukcji apoptozy poprzez aktywację sygnalizacji zewnątrzpochodnej, w której pośredniczą naturalne i syntetyczne triterpenoidy. Dodatkowo, triterpenoid typu lanostanu, kwas poliporenowy C wyizolowany z Poriacocos, indukuje apoptozę indukowaną kaspazą 8 w ludzkim raku płuc. W szczególności wykazano, że β-sitosterol (strukturalny izomer stigmasterolu) indukuje apoptozę poprzez aktywację szlaku zewnątrzpochodnego, aktywując sygnalizację Fas w ludzkich komórkach raka piersi. Może to sugerować, że zarówno składniki triterpenowe, jak i sterolowe ekstraktu zastosowanego w tym badaniu będą odgrywały główną rolę w indukcji apoptozy poprzez aktywację szlaku zewnątrzpochodnego.

Rysunek 3

Traktowanie w ciągu sześciu godzin frakcją heksanową Bonellia macrocarpa indukowało aktywację kaspazy 8. Traktowanie było następujące: DMSO (0,05%), kontrola (brak leczenia), etopozyd (50 μg/mL), i HFBa (50 μg/mL). Każdy symbol oznacza średnią ± SD względnej aktywacji kaspaz z trzech testów, znormalizowaną w stosunku do grupy kontrolnej. One-way ANOVA: , ; test post-hoc Tukeya: versus DMSO i grupa kontrolna; versus DMSO i grupa kontrolna; versus HFBa.

Rycina 4

Traktowanie w ciągu 12 godzin frakcją heksanową Bonellia macrocarpa nie indukowało aktywacji kaspazy 9. Zabiegi były następujące: DMSO (0,05%), kontrola (brak leczenia), etopozyd (50 μg/mL) i HFBa (50 μg/mL). Każdy symbol oznacza średnią ± SD względnej aktywacji kaspaz z trzech testów, znormalizowaną w stosunku do grupy kontrolnej. One-way ANOVA: , ; test post-hoc Tukeya: versus wszystkie grupy.

Rycina 5

Traktowanie w ciągu 12 godzin frakcją heksanową Bonellia macrocarpa indukowało aktywację kaspazy 3. Traktowanie było następujące: DMSO (0,05%), kontrola (brak leczenia), etopozyd (50 μg/mL), i HFBa (50 μg/mL). Każdy symbol oznacza średnią ± SD względnej aktywacji kaspaz z trzech testów, znormalizowaną w stosunku do grupy kontrolnej. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: versus DMSO i grupa kontrolna; versus DMSO i grupa kontrolna.

Według naszej wiedzy, jest to pierwszy raz, kiedy wykazano, że ekstrakt z rośliny stosowanej w tradycyjnej medycynie Majów posiada wpływ na apoptozę. Przyszłe badania będą ukierunkowane na standaryzację ekstraktu i jego ocenę w modelach in vivo. Dodatkowe badania są niezbędne do wyjaśnienia związków odpowiedzialnych za obserwowaną aktywność cytotoksyczną i ich dokładnego mechanizmu apoptozy.

4. Wnioski

Frakcja heksanowa z korzeni B. albiflora wywiera działanie cytotoksyczne i indukuje apoptozę na drodze zewnątrzpochodnej, co sugeruje jej potencjał w leczeniu nowotworów. Sugerujemy pełną izolację składników obecnych we frakcji heksanowej B. albiflora do oceny w teście cytotoksycznym i indukcji apoptozy, w celu wyjaśnienia, które związki są aktywne, jak również zrozumienia mechanizmu działania.

Konflikt interesów

Autorzy deklarują, że nie mają konfliktu interesów ani powiązań finansowych z żadnym podmiotem komercyjnym wymienionym w pracy.

Podziękowania

Ta praca była wspierana przez SEP-CONACYTCB-2010-156755. Autorzy pragną podziękować L. Torres-Tapia z Wydziału Biotechnologii Centrum Badań Naukowych Jukatanu (CICY) za pomoc techniczną podczas analizy GC-MS. Autorzy są ponadto wdzięczni Dr. Glenn Jackson za recenzję pracy w języku angielskim.

.