Biochemia strukturalna/Białka/Krystalografia rentgenowska
Interakcja promieniowania rentgenowskiego z elektronami w krysztale powoduje powstanie wzoru dyfrakcyjnego, który matematycznie jest transformatą Fouriera rozkładu gęstości elektronowej. Detektory używane do pomiaru promieniowania rentgenowskiego mogą jednak mierzyć tylko amplitudę rozproszonego promieniowania rentgenowskiego; przesunięcia fazowe, które są wymagane do zastosowania transformaty Fouriera i znalezienia rozkładu gęstości elektronowej, nie są mierzalne bezpośrednio za pomocą tej metody. Jest to znane w środowisku fizyków jako „problem fazowy”. Mówiąc prościej, fazy nie mogą być znalezione na podstawie zmierzonych amplitud promieniowania rentgenowskiego. Należy dokonać innych ekstrapolacji i przeprowadzić dodatkowe eksperymenty, aby otrzymać mapę gęstości elektronowej. Wiele razy, istniejące dane na temat właściwości fizycznych i chemicznych związku może pomóc, gdy jest słaba mapa gęstości. Inna metoda znana jako Synteza Pattersona jest bardzo przydatna do znalezienia wstępnego oszacowania faz i jest bardzo przydatna w początkowych etapach określania struktury białek, gdy fazy nie są znane. Problem może być uproszczony przez znalezienie atomu, zwykle metalu ciężkiego, za pomocą Syntezy Pattersona, a następnie wykorzystanie pozycji tego atomu do oszacowania początkowych faz i obliczenia początkowej mapy gęstości elektronowej, która może dalej pomóc w modelowaniu pozycji innych atomów i poprawić oszacowanie faz jeszcze bardziej. Inna metoda nosi nazwę Molecular Replacement; lokalizuje ona położenie struktury białkowej w komórce. Oprócz metody zastąpienia molekularnego, problem fazowy może być również rozwiązany przez metodę zastąpienia izomorficznego, metodę dyfrakcji anomalnej o wielu długościach fali, metodę dyfrakcji anomalnej o jednej długości fali i metody bezpośrednie.
Zastąpienie molekularneEdit
Problem fazowy może być rozwiązany przez posiadanie modelu atomowego, który może obliczyć fazy. Model może być uzyskane, jeśli powiązana struktura białka jest znana. Jednakże, aby zbudować taki model atomowy, należy określić orientację i położenie modelu w nowej komórce jednostkowej. To jest, gdy technika, molekularne zastąpienie (lub MR) przychodzi w.
Molecular Replacement, znany również jako MR, jest metodą rozwiązywania problemów fazowych w krystalografii rentgenowskiej. MR lokalizuje orientację i położenie struktury białkowej z jej komórką jednostkową, której struktura białkowa jest homologiczna do nieznanej struktury białkowej, która musi być określona. Uzyskane fazy mogą pomóc w generowaniu map gęstości elektronowej i pomóc w wytworzeniu obliczonych intensywności położenia modelu struktury białkowej do obserwowanych struktur z eksperymentu krystalografii rentgenowskiej.
Metoda MR jest również skuteczna w rozwiązywaniu makrocząsteczkowych struktur krystalicznych. Metoda ta wymaga mniej czasu i wysiłku przy określaniu struktury, ponieważ nie trzeba przygotowywać pochodnych ciężkich atomów i zbierać danych. Metoda jest prosta, a budowa modelu jest uproszczona, ponieważ nie wymaga śledzenia łańcucha.
Metoda ta składa się z dwóch kroków:
- poszukiwanie rotacyjne w celu zorientowania modelu homologicznego w komórce jednostkowej lub celu
- cel translacyjny, w którym nowy zorientowany model jest pozycjonowany w komórce jednostkowej
Patterson-based (Molecular Replacement)Edit
Mapy Pattersona są wektorowymi mapami międzyatomowymi, które zawierają piki dla każdego powiązanego atomu w komórce jednostkowej. Jeśli mapy Pattersona zostały wygenerowane na podstawie danych pochodzących z map gęstości elektronowej, dwie mapy Pattersona powinny być ze sobą ściśle powiązane tylko wtedy, gdy model jest prawidłowo zorientowany i umieszczony w odpowiedniej pozycji. Pozwoli to na wywnioskowanie informacji o położeniu nieznanej struktury białkowej wraz z jej komórką. Z wymianą molekularną jest jednak pewien problem, ma ona sześć wymiarów, trzy parametry określające orientację i położenie. Dzięki mapom Pattersona można ją podzielić na podzbiory parametrów, aby przyjrzeć się każdej części osobno.
Funkcja rotacjiEdit
Funkcja rotacji ma wektory wewnątrzcząsteczkowe, które zależą tylko od orientacji cząsteczki, a nie od jej położenia, ponieważ nawet gdy cząsteczka jest translokowana w komórce jednostkowej, wszystkie atomy są przesunięte o tę samą wartość, ale wektory między atomami są takie same. Mapa Pattersona dla nieznanej struktury białka jest porównywana z homologiczną znaną strukturą białka w różnych orientacjach
To jest mapa Pattersona powyższej struktury. Wektory wewnątrzcząsteczkowe są zaznaczone na czerwono.
Klasyczna funkcja rotacjiEdit
Aby znaleźć orientację, należy określić oś obrotu i kąt obrotu wokół tej osi. Do zdefiniowania osi (wektora od środka sfery do punktu na powierzchni sfery) potrzebne będą dwa parametry. Oś obrotu zaczyna się równolegle do osi z i jest obracana wokół osi y o kąt ᶱ, następnie obiekt obraca się wokół osi z o kąt ᶲ, a na końcu obraca się wokół osi obrotu o kąt ᵠ. Określają one punkt na powierzchni sfery jednostkowej.
Opis ĸ/ᵠ/ɸ jest przydatny, jeśli szukamy rotacji o określonym kącie obrotu (ĸ). Na przykład, 2-krotna rotacja będzie miała ĸ=180°, podczas gdy 6-krotna rotacja będzie miała ĸ=60°
Szybka funkcja rotacjiEdit
Funkcję rotacji można obliczyć porównując dwie mapy Pattersona lub szczyty w tych Pattersonach. Funkcja rotacji może być obliczona znacznie szybciej za pomocą transformaty Fouriera tylko wtedy, gdy Pattersony były wyrażone w kategoriach harmonicznych sferycznych.
Direct Rotation FunctionEdit
W bezpośredniej funkcji rotacji, struktura białkowa może być umieszczona w komórce jednostkowej nieznanej struktury, a Patterson dla zorientowanej cząsteczki jest porównywany z całym Pattersonem nieznanej struktury.
Funkcja translacjiEdit
Po poznaniu orientacji znanej struktury jej model (mapa gęstości elektronowej) może być zorientowany w celu obliczenia współczynników struktury, gdzie funkcja korelacji jest używana do wyznaczenia wektora do translacji modelu na wierzchołek modelu homologicznego w obrębie jednostki asymetrycznej.
Przy prawidłowo zorientowanych i przetłumaczonych modelach fazowych struktury białkowej, jest ona wystarczająco dokładna, aby wyprowadzić mapy gęstości elektronowej z wyprowadzonych faz. Mapy gęstości elektronowej mogą być wykorzystane do budowy i udoskonalenia modelu nieznanej struktury.
Dyfrakcja anomalna o wielu długościach faliEdit
Promienie X są generowane w dużych maszynach zwanych synchrotronami. Synchotrony przyspieszają elektrony do prędkości bliskiej prędkości światła i przemieszczają je przez duży, pusty, metalowy pierścień w kształcie wielokąta. W każdym rogu magnesy uginają strumień elektronów, powodując emisję energii w postaci promieniowania elektromagnetycznego. Ponieważ elektrony poruszają się z prędkością światła, emitują one wysokoenergetyczne promieniowanie X.
Korzyści z używania synchrotronów są takie, że naukowcy nie muszą hodować wielu wersji każdej skrystalizowanej cząsteczki, ale zamiast tego hodują tylko jeden typ kryształu, który zawiera selen. Następnie mają możliwość dostrojenia długości fali, aby dopasować właściwości chemiczne selenu. Technika ta znana jest jako dyfrakcja anomalna o wielu długościach fali. Kryształy są następnie bombardowane kilkakrotnie falami o różnej długości, aż w końcu powstaje wzór dyfrakcyjny, który pozwala badaczom określić położenie atomów selenu. Pozycja ta może być użyta jako punkt odniesienia lub marker do określenia reszty struktury. Korzyści z tego pozwalają badaczom zbierać dane znacznie szybciej.
Isomorphous Replacement MethodEdit
Ta metoda porównuje wzorce dyfrakcji rentgenowskiej pomiędzy oryginalnym kryształem białka a tym samym typem kryształu z dodatkiem co najmniej jednego atomu o wysokiej liczbie atomowej. Metoda ta została wykorzystana do określenia struktury małych cząsteczek, a ostatecznie hemoglobiny przez Maxa Ferdinanda Perutza (1914-2002). Z izomorfizmem idealnym mamy do czynienia wtedy, gdy kryształ oryginalny i jego pochodna mają dokładnie taką samą konformację białka, położenie i orientację molekuł oraz parametry komórki jednostkowej. Jedyną różnicą, jaką posiada kryształ i jego pochodna w izomorfizmie idealnym, są różnice intensywności wynikające z dodania ciężkich atomów w pochodnej. Różnice te mogą być zidentyfikowane ręcznie lub za pomocą automatycznej procedury przeszukiwania Pattersona, takiej jak SIR 2002, SHELXD, nB i ACORN, a taka informacja jest istotna dla wyznaczenia kątów fazowych białka. Jednakże, idealny izomorfizm prawie nie występuje z powodu zmiany wymiarów komórki. Dla białka z ciężkim atomem tolerowana zmiana wymiarów komórki wynosi dmin/4, gdyż dmin jest granicą rozdzielczości. Inne czynniki, takie jak rotacja, również przyczyniają się do braku izomorfizmu.
ProceduryEdit
- Przygotuj kilka pochodnych białka w strukturze krystalicznej. Następnie zmierz wymiar komórki, aby sprawdzić izomorfizm.
- Zbierz dane intensywności promieniowania rentgenowskiego oryginalnego białka i jego pochodnej.
- Zastosuj funkcję Pattersona, aby wyznaczyć współrzędne ciężkiego atomu.
- Odszlifuj parametry ciężkiego atomu i oblicz kąt fazowy białka.
- Oblicz gęstość elektronową białka.
Pochodne są wykonane za pomocą dwóch różnych metod. Preferowaną metodą jest moczenie kryształu białka w roztworze, który ma skład identyczny jak ciecz macierzysta, ale z niewielkim wzrostem stężenia substancji strącającej. Inną metodą jest współkrystalizacja, ale nie jest ona powszechnie stosowana, ponieważ kryształ nie będzie rósł lub rósł nieizomorficznie. Procedura namaczania zależy od tego, jak szerokie są pory kryształu. Pory powinny być wystarczająco szerokie, aby odczynnik mógł dyfundować do kryształu i dotrzeć do miejsc reaktywnych na powierzchni wszystkich cząsteczek białka w krysztale.
Metoda dyfrakcji anomalnej o wielu długościach faliEdit
Dyfrakcja anomalna o wielu długościach fali (w skrócie MAD) jest metodą wykorzystywaną w krystalografii rentgenowskiej, która pozwala nam określić struktury makromolekuł biologicznych, takich jak białka i DNA, w celu rozwiązania problemu fazowego. Wymagania dotyczące struktury obejmują atomy, które powodują znaczne rozpraszanie promieniowania rentgenowskiego; w szczególności siarki lub jonów metali z metaloprotein. Ponieważ selen może zastąpić naturalną siarkę, jest on częściej stosowany. Korzystanie z tej techniki znacznie ułatwia krystalografa z wykorzystaniem metody Multiple Isomorphous Replacement (MIR), ponieważ przygotowanie ciężkich związków jest zbędne.
metoda ta jest używana do rozwiązywania problemów fazowych, gdy nie ma dostępnych danych dotyczących rozproszonej dyfrakcji oprócz amplitud. Ponadto, jest ona stosowana, gdy atom metalu ciężkiego jest już związany wewnątrz białka lub gdy kryształy białka nie są izomorficzne, co jest nieodpowiednie dla metody MIR. Metoda ta była najczęściej stosowana do ciężkiego roztworu metalo, te metaloenzymów zwykle pochodzi z 1 serii przejściowej i ich sąsiadów. ważne jest, aby mieć źródło dla potężnego pola magnetycznego do przeprowadzenia tego eksperymentu, środowisko, takie jak pod ziemią powinny być brane pod uwagę. Akcelerator cząstek zwany synchrotronem jest również wymagany dla tej metody.
Metoda dyfrakcji anomalnej o jednej długości faliEdit
W porównaniu do dyfrakcji anomalnej o wielu długościach fali (MAD), dyfrakcja anomalna o jednej długości fali (SAD) wykorzystuje pojedynczy zestaw danych z jednej długości fali. Główną korzystną różnicą pomiędzy MAD i SAD jest to, że kryształ spędza mniej czasu w wiązce promieniowania rentgenowskiego w SAD, co zmniejsza potencjalne uszkodzenie cząsteczki przez promieniowanie. Ponadto, ponieważ SAD wykorzystuje tylko jedną długość fali, jest bardziej efektywny czasowo niż MAD.
Mapy gęstości elektronowej uzyskane z danych dyfrakcji anomalnej pojedynczej długości fali muszą być poddane modyfikacjom w celu rozwiązania niejednoznaczności fazowych. Powszechną techniką modyfikacji jest spłaszczanie rozpuszczalnikowe, a kiedy SAD jest połączony ze spłaszczaniem rozpuszczalnikowym, mapy gęstości elektronowej, które powstają są porównywalnej jakości do tych, które pochodzą z pełnego MAD fazowania. Spłaszczanie rozpuszczalnika polega na dostosowaniu gęstości elektronowej regionów międzywęzłowych pomiędzy cząsteczkami białka zajętymi przez rozpuszczalnik. Zakłada się, że region rozpuszczalnika jest stosunkowo nieuporządkowany i pozbawiony cech w porównaniu z białkiem. Wygładzenie gęstości elektronowej w regionach rozpuszczalnika zwiększy gęstość elektronową białka w stopniu możliwym do interpretacji. Metoda ta nosi nazwę ISAS, iteracyjne rozpraszanie anomalne pojedynczej długości fali.
Metody bezpośrednieEdit
Metoda bezpośrednia może pomóc w odzyskaniu faz przy użyciu uzyskanych danych. Metoda bezpośrednia szacuje fazę początkową i fazę ekspansji używając potrójnej relacji. Relacja potrójna (trio) jest związkiem intensywności i fazy jednego odbicia z dwoma innymi intensywnościami i fazami. Przy stosowaniu tej metody rozmiar struktury białkowej ma znaczenie, ponieważ rozkład prawdopodobieństwa faz jest odwrotnie proporcjonalny do pierwiastka kwadratowego z liczby atomów. Metoda bezpośrednia jest najbardziej użyteczną techniką do rozwiązywania problemów fazowych.