Aminoglikozydy: Perspectives on Mechanisms of Action and Resistance and Strategies to Counter Resistance
STRUKTURALNE PODSTAWY MECHANIZMU DZIAŁANIA
Struktura 16S rRNA z Escherichia coli jest dobrze zbadana wśród podjednostek rRNA, a w szczególności przeanalizowano interakcje różnych antybiotyków aminoglikozydowych z 16S rRNA i ich wpływ na proces translacji mRNA do polipeptydu (35). Podobne struktury rRNA występują u innych organizmów, takich jak drożdże i Tetrahymena (33). Traktowanie rRNA aminoglikozydem chroni kilka zasad nukleinowych w rRNA przed chemiczną modyfikacją, co sugeruje, że cząsteczki te mają wysokie powinowactwo do pewnych miejsc w rRNA. Ten sposób wiązania został porównany przez Nollera (35) do inhibitorów enzymów, które zwykle wiążą się z miejscami aktywnymi enzymów i zakłócają ich aktywność. Różne klasy antybiotyków aminoglikozydowych wiążą się do różnych miejsc na rRNA, w zależności od strukturalnej komplementarności między nimi. Na przykład, uważa się, że neomycyna, paromomycyna (ryc. 1), gentamycyna i kanamycyna wiążą się do miejsca A na 16S rRNA w E. coli w podobny sposób i wykazano, że chronią one zasady A1408 i G1494 w doświadczeniach z chemicznym oznaczaniem śladów (ryc. 2) (33). Cztery zasady, A1408, A1492, A1493 i G1494, w miejscu A rRNA oddziałują z tRNA, chociaż z różnym powinowactwem. Wiązanie się wyżej wymienionych aminoglikozydów z miejscem A w regionie dekodującym (tj. miejscem rozpoznawania kodonów i antykodonów) zakłóca dokładne rozpoznawanie tRNA przez rRNA podczas translacji (35). Uważa się, że te interakcje zakłócają również translokację tRNA z miejsca A do miejsca peptydylo-tRNA (miejsce P).
(A) Widok stereoskopowy częściowej struktury 70S rRNA skompleksowanego z trzema cząsteczkami tRNA (kod Protein Databank, 486D). Region miejsca A na 16S rRNA jest pokazany na biało, gdzie aminoacylo tRNA „A” (na żółto) jest związany w pobliżu miejsca A rRNA. Pokazane są również dwa inne tRNA, peptydowy i wyprowadzający, odpowiednio „P” (na czerwono) i „E” (na zielono). Szkielet przedostatniego pnia cząsteczki 16S rRNA i pętla 900 są pokazane na fioletowo. Miejsce wiązania paromomycyny w miejscu A jest zaznaczone białą strzałką. (B) Widok stereo struktury roztworu szablonu miejsca A RNA związanego przez paromomycynę, który w przybliżeniu odpowiada regionowi miejsca A na 16S rRNA zaznaczonemu na biało w panelu A. Powierzchnia Connolly’ego miejsca A RNA jest odwzorowana zgodnie z potencjałem elektrostatycznym przy użyciu programu MOLCAD (Tripos, Inc., St. Louis, Mo.), a aminoglikozyd jest przedstawiony w postaci kulki i patyczka. Najbardziej elektronegatywny potencjał jest przedstawiony w kolorze niebieskim, a najbardziej elektropozytywny potencjał na powierzchni jest przedstawiony w kolorze czerwonym; wszystkie inne kolory pokazują potencjały pomiędzy niebieskim a czerwonym. Strzałka w kolorze białym pokazuje załamanie generowane przez A1492, który nie posiada partnera do parowania zasad. Strzałka w kolorze żółtym pokazuje kieszeń generowaną przez parę zasad A1408 – A1493 i A1492. Strzałka w kolorze czerwonym pokazuje lokalizację 3-aminy na pierścieniu II, miejsce acetylacji przez AAC(3).
Puglisi i współpracownicy (12-14, 39) dostarczyli ostatnio strukturalnych dowodów na sposób oddziaływania paromomycyny, reprezentatywnego aminoglikozydu z klasy neomycyny, z 27-nukleotydowym szablonem RNA, który został zaprojektowany tak, aby naśladować region miejsca A 16S rRNA w E. coli (Rys.3A). Projekt szablonu RNA był oparty na wcześniejszej wiedzy, że paromomycyna oddziałuje z parą zasad C1407 – G1494, A1408, A1493 i U1495 i że te zasady są absolutnie niezbędne do wiązania o wysokim powinowactwie (39) (zaznaczone na szaro na Rys. 3A). Istotne są również dodatkowe cechy strukturalne, takie jak kieszeń utworzona przez asymetrię w regionie wewnętrznej pętli spowodowaną obecnością A1492 i parą zasad C1409 – G1491 w regionie dolnego trzonu. Te cechy strukturalne wspólnie tworzą kieszeń optymalną dla wiązania paromomycyny (patrz niżej).
(A) Model szablonu A-site RNA używany do badania oddziaływań paromomycyny. Ramka reprezentuje część rRNA, która jest homologiczna do miejsca A. (B) Szablon aptameru RNA używany do badania interakcji tobramycyny.
W natywnym szablonie RNA miejsca A, rdzeń ma interakcje parowania zasad na U1406 – U1495 (niekanoniczne) i C1407 – G1494 (Fig 3A). Po związaniu paromomycyny, odrębna struktura utworzona przez A1408, A1492 i A1493 jest stabilizowana (Rys. 2B), a zasady A1408 i A1493 tworzą niekanoniczną parę zasad (12, 39). Nukleotyd A1492, który nie posiada żadnych oddziaływań typu base-pairing, tworzy załamanie w strukturze RNA, a łączne działanie A1492 i pary zasad A1408 – A1493 tworzy wybrzuszenie w miejscu A, gdzie wiąże się paromomycyna i jeszcze bardziej rozszerza kąt załamania (Rys.2B). Grupy funkcyjne na paromomycynie, takie jak grupy hydroksylowe i aminowe, uczestniczą w specyficznych interakcjach z cząsteczką RNA (patrz poniżej).
Kieszonka utworzona przez A1492 i parę zasad A1408 – A1493 jest zajęta przez pierścień II paromomycyny, a pierścień ten układa się ponad bazą G1491 (pokazaną żółtą strzałką na Rys. 2B) (12). Pierścień I paromomycyny nawiązuje specyficzne kontakty z „uniwersalnie” konserwowanymi parami zasad U1406 – U1495 i C1407 – G1494 w rRNA. Warto zauważyć, że pierścień I jest absolutnie niezbędny do specyficznego wiązania antybiotyków aminoglikozydowych do rRNA. Pierścienie III i IV paromomycyny rozszerzają te oddziaływania dalej w głąb głównego rowka rRNA. Część aminowa i hydroksylowa w większości przyczyniają się do niespecyficznych oddziaływań paromomycyny z rRNA; nie są to więc oddziaływania zależne od sekwencji. Innym ważnym punktem jest to, że para zasad C1409 – G1491 stanowi miejsce wiązania aminoglikozydu w kieszeni, a niedopasowana para zasad w tej pozycji powoduje utratę wiązania (12). Ogólnie rzecz biorąc, aminoglikozydy, które mają wspólne cechy strukturalne z paromomycyną, wiążą się do rRNA w podobny sposób (13). Jednakże wydaje się, że różne antybiotyki aminoglikozydowe wiążą się do tego samego miejsca wiązania w więcej niż jednej konformacji (28). W istocie, konformacja aminoglikozydu, która wiąże się z RNA musi spełniać elektroniczne i steryczne ograniczenia miejsca wiązania. W innym badaniu nad kompleksem gentamycyny Cla i wzorca RNA w miejscu A, pierścienie I i II gentamycyny Cla (które są podobne do pierścieni paromomycyny) wykazywały interakcje wiążące podobne do tych w kompleksie paromomycyny i wzorca RNA w miejscu A (57). Jednakże, pierścień III w gentamycynie Cla oddziałuje z parami zasad U1406 – U1495 i G1405 – C1496 w górnym regionie rdzeniowym (Rys. 3A). Na podstawie tych obserwacji Puglisi i współpracownicy (57) zaproponowali, że wszystkie aminoglikozydy, które celują w miejsce A 16S rRNA, wiążą się we wspólny sposób, podobny do pierścieni I i II w paromomycynie i gentamycynie.
Inne badanie strukturalne przeprowadzono na wiązaniu tobramycyny (Rys.1) z aptamerem RNA (23). RNA aptamer, który został użyty w tym badaniu był 26-nukleotydowym stem-loop RNA (Rys. 3B). Istnieją cztery pary niedopasowania, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 i U11 – U16, w tym aptamerze RNA, które są częścią pętli spinki do włosów z zamkiem błyskawicznym. Tobramycyna wiąże się w tym rowku częściowo otoczona przez powierzchnię głębokiego rowka i bazę guaninową reszty G15 (Rys. 4). W tym kompleksie pierścień I tobramycyny znajduje się na dnie głębokiego rowka. Jedna z grup aminowych na pierścieniu II tobramycyny oddziałuje z szkieletem fosforanowym w głębokim rowku, a druga grupa aminowa jest wystawiona na działanie rozpuszczalnika. Pierścień III jest umieszczony w centrum głębokiego rowka, z grupami hydroksylowymi skierowanymi w stronę dna rowka. Sugerowano, że konformacja opisanego powyżej aptameru RNA jest podobna do konformacji pętli szpilki do włosów w tRNA i rRNA (23).
Widok stereo kompleksu tobramycyny związanej z aptamerem RNA. Zielona powierzchnia Connolly reprezentuje część miejsca wiązania aminoglikozydu.
Do umieszczenia powyższej dyskusji w perspektywie pomocna jest struktura rentgenowska o rozdzielczości 7,5Å kompleksu funkcjonalnego T. thermophilus 70S rRNA zawierającego tRNA i mRNA (5). Na podstawie tej struktury można sobie wyobrazić, jak dobrze badania modelowe z mniejszymi szablonami RNA, takimi jak aptamer tobramycyna-RNA i A-site-RNA z paromomycyną (patrz wyżej) pasowałyby do kompletnej struktury rRNA. Miejsce A w 16S rRNA podjednostce 70S rRNA jest widoczne w pobliżu interfejsu tRNA i podjednostki 50S rRNA, w pobliżu pary kodon-antykodon (Rys. 2A). Po porównaniu struktury roztworu szablonu RNA miejsca A z miejscem A w strukturze rentgenowskiej 70S rRNA, struktura rentgenowska okazała się być blisko spokrewniona z szablonem RNA związanym z paromomycyną, ale nie z natywną strukturą roztworu szablonu RNA miejsca A (5). Jest to intrygujące i sugeruje, że być może w formie funkcjonalnej wybrzuszenie lub załamanie w pobliżu zasad A1492 i A1493 zawsze istnieje w 70S rRNA. Gdyby to było prawdą, sugeruje to, że kieszeń wiążąca paromomycynę istnieje już w momencie, gdy 70S rRNA staje się funkcjonalny; stąd jest on predysponowany do hamowania przez paromomycynę. Zaprzecza to twierdzeniu, że wiązanie paromomycyny zwiększa kąt załamania w miejscu wiązania. Dowody na poparcie tej idei pochodzą z ostatnich badań, które sugerują, że powinowactwa różnych aminoglikozydów do miejsca A szablonu RNA są różne, a zdolność tych antybiotyków do hamowania syntezy białka in vitro również jest różna (15). Gentamycyna i kilka innych pokrewnych antybiotyków oddziałuje z RNA w miejscu A ze stałymi dysocjacji (Kd) w zakresie mikromolarnym, ale hamowały one proces translacji in vitro, z 50% stężeniami hamującymi w zakresie nanomolarnym (15). To ostatnie odkrycie zostało wywnioskowane jako wynik wiązania aminoglikozydu do nienaruszonego rRNA w regionie dekodującym (miejsce A), a różnica w wiązaniu do nienaruszonego rRNA w porównaniu z wiązaniem do szablonowego RNA w miejscu A może wynikać z różnic w konformacji tych dwóch RNA, jak omówiono powyżej.
Miejsce A słabo kontaktuje się z mRNA i tRNA, co sugeruje, że region ten odgrywa rolę w rozpoznawaniu odpowiedniego tRNA poprzez subtelne zmiany w energii swobodnej (5). Wiązanie aminoglikozydu w pobliżu tego miejsca może wpływać na delikatny proces interakcji pomiędzy kodonem i antykodonem. Postulowano również, że obecność aminoglikozydu stabilizuje kompleks mRNA i tRNA w miejscu A, co z kolei wpływa na proces translacji (5). Trudno jest przewidzieć wszystkie efekty działania aminoglikozydów na strukturę rRNA, a dalsze badania strukturalne z aminoglikozydami związanymi z kompleksami, takimi jak 70S rRNA, będą pomocne w wyjaśnieniu i zrozumieniu subtelnych zmian, które prowadzą do antybiotycznych działań aminoglikozydów.
W szeregu badań wykorzystano sondy syntetyczne w celu zrozumienia interakcji między szablonami RNA a aminoglikozydami. Zasugerowano, że aminoglikozydy wiążą się z więcej niż jednym miejscem docelowym w rybozymie (6, 30). Ostatnio, kilka antybiotyków aminoglikozydowych, takich jak neomycyna B, tobramycyna i kanamycyna A, zostało dimeryzowanych symetrycznie lub asymetrycznie przy użyciu „uwięzi”, a ich powinowactwa wiążące zostały porównane z powinowactwami monomerycznych aminoglikozydów macierzystych (30). Zasugerowano, że jeśli istnieje wiele miejsc wiążących na RNA, dimeryzowane aminoglikozydy powinny wiązać się z wyższym powinowactwem niż antybiotyk macierzysty, pod warunkiem, że wiele miejsc wiążących jest dostępnych. Rzeczywiście zaobserwowano, że dimeryzowane aminoglikozydy wiążą się z rybozymem Tetrahymena 20 do 1200 razy lepiej niż macierzyste aminoglikozydy. Jednym z wyjaśnień wyższego powinowactwa wiązania może być zwiększona liczba dodatnio naładowanych grup aminowych na dimeryzowanym aminoglikozydzie, ale efekt ten wydaje się być synergistyczny z entropową przewagą uzyskaną przez dimeryzację (30). Wskazało to również na obecność wielu miejsc wiążących antybiotyki aminoglikozydowe o wysokim powinowactwie w cząsteczce RNA. W innym badaniu próbowano wykorzystać właściwości wiązania RNA przez paromomycynę i interkalacyjne zachowania niektórych związków, takich jak piren i oranż tiazolowy (48). Strategia ta przewidywała aminoglikozydy jako środek dostarczania czynników interkalujących do RNA. Koniugat paromomycyny z oranżem tiazolowym lub pirenem wykazywał lepsze właściwości wiążące do 27-nukleotydowego szablonu RNA w miejscu A. W rzeczywistości, stała dysocjacji dla koniugatu paromomycyny z oranżem tiazolowym została zmierzona na 46 nM, co zostało zgłoszone jako najwyższe powinowactwo, jakie miejsce A rRNA wykazało dla jakiegokolwiek liganda.
Wymagania strukturalne dla wiązania RNA przez aminoglikozydy wskazały, że wybrzuszenie w sekwencji RNA jest konieczne, aby umożliwić wiązanie aminoglikozydów (7). Wykorzystując specyficzną pochodną pętli łodygi aptamera RNA, przeprowadzono serię badań nad interferencją chemiczną, modyfikacjami chemicznymi i mutacjami, aby zrozumieć wymagania strukturalne dla wiązania tobramycyny do aptamera RNA. Okazało się, że ten aminoglikozyd oddziałuje głównie z zasadami nukleinowymi w aptamerze RNA, ale nie z szkieletem fosforanowym. Obecność wybrzuszenia została jednak uznana za istotną dla wiązania tobramycyny z wysokim powinowactwem w stosunku stechiometrycznym i stwierdzono, że wybrzuszenie tworzy wnękę dla oddziaływań aminoglikozydu i zasady nukleinowej (7). Analogię tę można zastosować do innych miejsc RNA, takich jak region młotkowy i miejsce A, gdzie występuje wgłębienie spowodowane niekanonicznym parowaniem zasad, pętlami lub wybrzuszeniami, które tworzą odpowiednie miejsce dla aminoglikozydów do oddziaływania z anionowymi grupami fosforanowymi i zasadami nukleinowymi. Wzdłuż tych linii, Westhoff i współpracownicy (49) wysunęli propozycję, że interakcja aminoglikozydów z RNA jest prawdopodobnie specyficzna dla kształtu, a nie dla sekwencji.
Zgodnie z tą koncepcją, pola elektrostatyczne w fałdach RNA zostały uznane za siłę kierującą wiązaniem (patrz poniżej). Hermann i Westhoff (20) byli w stanie zidentyfikować potwierdzenia dokowania kilku antybiotyków aminoglikozydowych w różnych szablonach RNA, takich jak aptamery tobramycyna-RNA i region miejsca A w 16S RNA, dla których dostępne były informacje strukturalne. Na podstawie tych obserwacji przewidziano sposób wiązania aminoglikozydów do regionu elementu odpowiedzi aktywującego trans w HIV (20). W innej pracy dotyczącej RRE w HIV, regionu wiążącego białko Rev, Cho i Rando (8) badali rolę wybrzuszenia pojedynczej zasady i wnęki dla wiązania aminoglikozydów. Zgodnie z wcześniejszymi hipotezami, wydedukowano, że rowki w niedupleksowych regionach RNA są ważne dla wiązania aminoglikozydów do RNA z wysokim powinowactwem. W tym przypadku wybrzuszenie pojedynczej zasady nie miało wpływu na wiązanie, ale wgłębienie, region bogaty w G składający się z dwóch niekanonicznych par zasad i jednego pojedynczego wybrzuszonego U, ma wysokie powinowactwo do aminoglikozydów. Uszkodzenie wgłębienia zmniejszyło powinowactwo RRE RNA do aminoglikozydów, wskazując w ten sposób, że niekanoniczne wybrzuszenia zawierające pary zasad są głównymi miejscami wiązania aminoglikozydów w tym szablonie RNA (8).