Splicing, capping, and polyadenylation are three major steps in processing pre-messenger RNA (pre-mRNA) to mRNA . Poliadenylacja (poli(A)) polega na endonukleolitycznym rozszczepieniu pre-mRNA i dodaniu ogona poli(A) w miejscu rozszczepienia. Poszczególne pre-mRNA posiada zwykle kilka miejsc rozszczepienia/poliadenylacji (C/P) (miejsca poli-A lub pA). Alternatywna poliadenylacja (APA) może ostatecznie wytworzyć kilka izoform poliadenylacji mRNA .

Zgodnie z obecnym rozumieniem, APA jest kompleksowym procesem realizowanym poprzez skoordynowane działania kilku małych cząsteczek. Czynniki przetwarzające 3′ są głównymi celami regulacji APA. Typowe przetwarzanie APA obejmuje następujące etapy: (1) CFIm (cleavage factor I) wiąże się do pola UGUA pre-mRNA przed miejscem pA i przyciąga CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) i CSTF (cleavage stimulation factor) do złożenia się na końcu polimerazy RNA II; (2) w miarę postępu polimerazy RNA II, CPSF wiąże się do sekwencji sygnałowej pA (np. AAUAAA), a CSTF przenosi się do nowego prekursora mRNA, wiążąc się z sekwencją bogatą w GU lub U; (3) CPSF i CSTF inicjują rozszczepienie ~ 35 nukleozydów po sekwencji sygnałowej pA, a białko wiążące poliadenylację (PABPN1) w jądrze wiąże się do sekwencji ogona poliadenylacji, aby rozpocząć proces PAP; (4) podczas kontynuacji poliadenylacji wspomaganej przez PAP, przygotowywane są ogony adenozyny o długości ~ 50-250 nukleotydów (nt) (w zależności od gatunku organizmu), a CPSF dysocjuje ze swojej sekwencji wiążącej; (5) PABPN1 działa jak molekularny władca podczas tej progresji APA, określając, kiedy proces poliadenylacji powinien się zatrzymać; (6) PAP zaczyna dysocjować, chociaż PABPN1 nadal utrzymuje swój status wiążący. Kombinacja powyższych 6 kroków w połączeniu z procesem 5′-kapsułkowania promuje dojrzewanie mRNA i ostateczny eksport z jądra do cytoplazmy.

Prawie 50 ~ 80% transkryptów pre-mRNA ssaków ma więcej niż jedno miejsce pA. W 3′-UTR mRNA znajdują się kluczowe elementy regulatorowe RNA, które określają kiedy, gdzie i ile transkryptu mRNA zostanie przetłumaczone. APA jest kluczowym mechanizmem regulacji posttranskrypcyjnej 3′-UTR. Izoformy 3′-UTR APA odgrywają różne role w określaniu stabilności mRNA, jego lokalizacji, czasu półtrwania i funkcji. Co więcej, wcześniejsze badania wykazały, że APA jest zaangażowana w progresję choroby i wrażliwość na leki, szczególnie w przypadku leków ukierunkowanych na modyfikatory chromatyny. Chociaż badania nad APA są wciąż na wczesnym etapie, jego unikalny posttranskrypcyjny efekt regulacyjny czyni go potencjalnie zarówno biomarkerem dla prognozy i diagnostyki nowotworów, jak i celem dla rozwoju nowych terapii celowanych.

Jak APA moduluje pre-mRNA

Based on the locations of pAs, APA can be classified into two major categories: UTR-APA (Ryc. 1a) i region kodujący-APA (CR-APA) (Ryc. 1b-d). W przypadku CR-APA, alternatywne pA zlokalizowane są w eksonach lub intronach. Dlatego CR-APA oddziałuje na regiony kodujące poprzez alternatywny splicing (AS), prowadząc do powstania izoform białkowych o różnych C-końcach. W przypadku UTR-APA, alternatywne pA są zlokalizowane w 3′-UTR, co prowadzi do powstania produktów transkrypcji zawierających tę samą ramkę kodującą, ale zmienne 3′-UTR. Wcześniejsze badania sugerowały, że globalne zdarzenia UTR-APA są specyficzne tkankowo, przy czym skracanie 3′-UTR pozytywnie koreluje z proliferacją komórek i negatywnie z ich różnicowaniem .

Kompleks 3′-processing pre-mRNA jest tworzony przez kilka elementów, w tym kanoniczną sekwencję sygnałową poli(A) AAUAA lub jej bliskie warianty (np.AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAAA, AAAAAG), które są wykorzystywane z różną częstotliwością w całym genomie, zwykle w odległości 15-50 ntów od miejsca pA. Elementy UGUA często znajdują się przed miejscem pA, elementy bogate w U znajdują się w pobliżu miejsca pA, a elementy bogate w U/GU znajdują się w odległości ~ 100 ntów od miejsca pA. Jednakże, ~ 20% ludzkich sygnałów poli(A) nie jest otoczonych regionami bogatymi w U-/GU .

Z 80 czynników rdzeniowych w komórkach ssaków, około 20 z nich jest zaangażowanych w maszynerię C/P . Ogólnie, te czynniki rdzeniowe można podzielić na cztery elementy, jak poniżej (Rys. 2) :

CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) składa się z CPSF1-CPSF4 (znanego również jako CPSF160, CPSF100, CPSF73 i CPSF30), WDR33 i FIP1L1 (znanego również jako Fip1). Obecnie uważa się, że WDR33 i CPSF4 bezpośrednio oddziałują z pAs, a CPSF3 przeprowadza rozszczepienie endonukleolityczne. Działając jako kompleks, CPSF rozpoznaje sekwencję sygnału poliadenylacji AAUAA i rozszczepia pre-mRNA. Zapewnia to specyficzność sekwencji, która może odgrywać istotną rolę w regulacji wyboru miejsca pA, ekspresji genów, migracji komórek nowotworowych, przerzutów i ostatecznie wyniku choroby. Jako część kompleksu CPSF, CPSF73 jest endonukleazą, która rozszczepia pre-mRNA w miejscu pA. Jednakże, w warunkach stresu oksydacyjnego, CPSF73 ulega translokacji z jądra do cytozolu i powoduje znaczne zahamowanie aktywności poliadenylacji w rakach prostaty. Co więcej, Fip1, członek kompleksu CPSF, potencjalnie służy jako regulator samoodnowy komórkowej. Istotnie, pozbawienie Fip1 w mysich embrionalnych komórkach macierzystych (ESCs) powoduje utratę komórkowych stanów niezróżnicowanych i zdolności do samoodnowy z powodu wykorzystania preferowanego dystalnego miejsca poli(A) (dpA), co ostatecznie prowadzi do wydłużenia 3′-UTR wybranych genów, które determinują los komórek.

CSTF (cleavage stimulation factor) składa się z CSTF1, CSTF2, i CSTF3 (50 kDa, 64 kDa, i 77 kDa, odpowiednio), i odgrywa kluczową rolę w reakcji rozszczepiania. Kompleks CSTF może wiązać się z bogatym w U lub GU polem poniżej miejsca rozszczepienia w celu przyspieszenia rozszczepienia. Na przykład CSTF2, znany również jako CSTF64, bezpośrednio oddziałuje z regionem bogatym w U/GU, aby modulować wydajność 3′-końcowego przetwarzania. Niektóre badania donoszą, że CSTF nie tylko promuje wykorzystanie pAs, ale także wpływa na proliferację komórek i potencjalnie działa jako biomarker inwazji nowotworowej i prognozy. CSTF64 działa jako istotny czynnik poliadenylacji i główny regulator skracania 3′-UTR w wielu typach nowotworów. Stwierdzono, że ekspresja CSTF64 jest związana ze złym rokowaniem w raku płuca, a nadekspresja CSTF64 promowała proliferację komórek raka płuca i inwazję.

CFI i CFII (czynniki rozszczepiające I i II) składają się z CFIm25 (znanego również jako NUDT21/nudix hydrolase 21/CPSF5), CFIm59 i CFIm68, z których wszystkie wiążą się przed konserwowanym motywem UGUA, aby pośredniczyć w reakcji rozszczepienia. Wiązanie CFIm może funkcjonować jako główny wyznacznik miejsc pA poprzez zapętlenie całego regionu pA i tym samym indukowanie wyboru miejsca APA. Inne białka, w tym symplekin, polimeraza poli(A) (PAP) i białko wiążące poli(A) (PAB), również mogą regulować wybór miejsca APA. PABs (PABII, RBBP6, PABPN1) wiążą się do rosnącego ogona poli(A), zapobiegając interakcji pomiędzy CPSF a polimerazą poli(A). Działania te występują głównie, gdy ogon wynosi ~ 250 nts, a ich celem jest kontrola długości ogona poli(A) podczas progresji APA .

Czynniki zaangażowane w maszynerię C/P zwykle uczestniczą w regulacji APA. Wśród nich, CFIm25 został zidentyfikowany jako główny globalny regulator APA, którego knockdown nie tylko indukuje globalny przełącznik do korzystania z proksymalnego sygnału poli(A), ale także zwiększa stabilność i ekspresję genów docelowych. Huang i wsp. donoszą, że deplecja CFIm25 znacząco zwiększa poziom transkryptu CCND1 i GSK3β, a także zmniejsza wykorzystanie dPAS przez kilka onkogenów (IGF1R, CCND1 i GSK3β). Ponadto, analizy ontologii genów (GO) wykazały, że CFIm25 nie tylko moduluje APA poprzez szlaki sygnalizacyjne MAPK, ale jest również powiązany ze szlakami sygnalizacyjnymi związanymi z nowotworami i ubikwitynacją białek. Co więcej, pozbawienie CFIm25 i CFIm68, ale nie CFIm59, prowadzi do selekcji proksymalnych miejsc poliadenylacji w komórkach HEK293. Jednak Xia i wsp. donoszą, że nie ma różnic w ekspresji CFIm25 między tkanką nowotworową a zdrową. Kubo i wsp. również stwierdzili, że CFIm może nie odgrywać roli w selekcji miejsc poli-(A). Ponadto Takagaki i wsp. wykazali, że CSTF64 jest pierwszym czynnikiem w przetwarzaniu 3′-końca APA i że IgM może wykorzystywać APA do aktywacji mysich komórek B. Chociaż wydaje się, że CFIm odgrywa kluczową rolę w regulacji APA, jego dokładna rola nadal pozostaje niejasna.

Białka wiążące RNA (RBPs) mogą również wpływać na zdolność APA do ukierunkowania mRNA poprzez konkurowanie z białkami maszynerii poliadenylacji lub wzmacnianie ich wiązania do miejsc docelowych. Xiang i wsp. przeanalizowali globalne profile APA z dużej bazy danych różnych typów nowotworów i zasugerowali, że PABPN1 jest głównym regulatorem profilowania APA w różnych typach nowotworów. Zestaw danych CTRP wykazał, że ekspresja PABPN1 jest statystycznie skorelowana z wrażliwością na 31 leków. RBPs mogą działać samodzielnie, aby zapobiec wiązaniu innych czynników APA do proksymalnych miejsc poli(A) lub wpływać na selekcję APA poprzez swoją rolę w utrzymaniu stabilności RNA. Ponadto RBPs mogą regulować dynamiczny profil APA i promować przejście od mitozy do mejozy.

Jak regulowana jest APA

APA jest bardzo kompleksowym molekularnym procesem biologicznym, obejmującym liczne elementy komórkowe. Obecnie wciąż niewiele wiemy o tym unikalnym procesie biologicznym. Sytuacja uległa jednak gwałtownej poprawie w bardzo krótkim czasie po tym, jak społeczność naukowa dostrzegła znaczenie APA w biologii komórkowej i jego potencjalną rolę jako nowego celu terapii przeciwnowotworowej. APA jest dynamicznie i przestrzenno-czasowo koordynowanym procesem, w którym biorą udział liczne czynniki podstawowe. Na przykład, CFIm może wiązać się ze specyficzną sekwencją RNA w pre-mRNA, a następnie rekrutuje czynnik rdzeniowy CPSF poprzez interakcję z podjednostką CPSF, hFip15 . CSTF-64 może oddziaływać z CPSF73, ale nie z CFIm25. Zaobserwowano, że zarówno poziom CSTF64 jak i CPSF73 jest podwyższony w komórkach migrujących do zdrowej tkanki, ale nie dla poziomu CFIm25. CFIm bierze udział we wczesnym etapie tworzenia kompleksu 3′-przetwarzania pre-mRNA poprzez alternatywne stymulowanie lub tłumienie rozszczepiania i dodawania poli(A) w zależności od poziomów własnych lub innych czynników rdzeniowych oraz sekwencji RNA otaczającej potencjalne miejsca rozszczepiania.

Poza czynnikami rdzeniowymi, w regulacji APA bierze udział szereg warunków fizjologicznych, takich jak lokalna struktura chromatyny, pozycjonowanie nukleosomów, metylacja DNA i modyfikacje histonów. Co ciekawe, niektóre czynniki uczestniczące w 5′-końcowym cappingu mogą również wpływać na efektywność zarówno rozszczepiania, jak i poliadenylacji .

Dodatkowo, APA może być regulowana na poziomie transkrypcji. Mechanizm transkrypcji, taki jak inicjacja transkrypcji, progresja i splicing, prawdopodobnie wpływa na wydajność i specyficzność poliadenylacji . Dlatego też zbadanie związku między specyficznymi elementami sekwencji w regionie promotora a selekcją miejsc poli-(A) znacznie pomoże nam w odkryciu mechanizmu stojącego za tym interesującym zjawiskiem, co może potencjalnie pomóc w opracowaniu nowej strategii terapii nowotworów.

Jak metodologicznie analizuje się APA

Odkąd w 1980 roku zaobserwowano wpływ pAs na kodowanie genów IgM i reduktazy dihydrofolianowej (DHFR), opracowano szereg rygorystycznych metod i strategii badawczych w celu identyfikacji i badania APA, takich jak technologia sekwencjonowania następnej generacji (NGS) Poly(A)-ClickSeq . Dzięki wsparciu tych nowatorskich metodologii, a zwłaszcza dzięki postępowi technologii NGS i szybkiemu gromadzeniu danych sekwencjonowania tych wariantów ekspresji genów, eksperymentalnie określone genetyczne bazy danych pA stale się rozszerzają.

Based on 3′-enriched RNA-seq protocols, APA analysis methods can be classified mainly into two categories: oligo (dT) priming-based methods and RNA manipulation-based methods . Ponieważ tylko odczyty zmapowane do 3′ -termini mRNA są użyteczne do odkrycia APA, liczba odczytów ogranicza te metody. Jeśli pokrycie odczytów do 5′- i 3′-końca jest niskie, RNA-seq nie będzie odpowiedni do precyzyjnego i szerokiego identyfikowania pA. Ponadto, kolejnym wyzwaniem jest rozwiązanie niejednoznaczności mapowania odczytów z powodu nakładania się izoform transkryptów. Mimo ograniczenia długości odczytu, opracowano szereg algorytmów RNA-seq do ilościowego określania względnych zmian w długości 3′-UTR, a więc do przewidywania zdarzeń APA. W ciągu ostatnich kilku lat opracowano również kilka metod i algorytmów wykrywania pA i analizy APA, takich jak dynamiczna analiza alternatywnej adenylacji poliA (DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA i Change Points . Przegląd z 2019 r. przez Grubera i Zavolaneloquently porównał te metody .

DaPars jest najpopularniejszą metodą analizy danych wśród nich, chociaż QAPA jest bardziej wydajny i czuły . DaPars identyfikuje dystalne pAs na podstawie danych RNA-seq, a następnie wykorzystuje model regresji do identyfikacji de novo i kwantyfikacji dynamicznych zdarzeń APA pomiędzy dwoma warunkami, niezależnie od wcześniejszej anotacji APA. Prawdopodobieństwo uzyskania sekwencjonowanych odczytów jest ujednolicone dla poszczególnych izoform. PAs występują w pozycjach wzdłuż lokalizacji genów, które wykazują wyraźny spadek pokrycia odczytów RNA-seq . Po skorygowaniu potencjalnej nierównomierności RNA-seq wzdłuż ciała genu, można zidentyfikować dokładną lokalizację proksymalnego miejsca APA, a następnie wykryć statystycznie istotne dynamiczne APA i ich aktywność. Kluczową innowacją metodologiczną DaPars jest bezpośrednie wnioskowanie o zdarzeniach APA de novo z istniejących danych RNA-seq bez konieczności przeprowadzania dodatkowych eksperymentów. Kolejną zaletą DaPars jest to, że może rozwiązać problem nakładania się sąsiadujących genów, który może dawać fałszywie pozytywne wyniki poprzez zwiększenie wartości odcięcia. Jednakże, ze względu na niejednolite pokrycie odczytów wzdłuż loci, metoda ta ogranicza dokładność wykrywania miejsc de novo poli(A) poprzez zwiększenie odsetka wyników fałszywie dodatnich.

QAPA ilościowo wnioskuje o APA z konwencjonalnych danych RNA-seq poprzez bezpośrednie oszacowanie bezwzględnej ekspresji alternatywnych izoform 3′-UTR. Następnie oblicza względną ekspresję każdej izoformy wśród wszystkich izoform, aby ocenić APA. Ograniczeniem QAPA jest to, że wymaga ona wcześniej zdefiniowanych pAs. Problem ten może być jednak złagodzony przez wygenerowanie rozszerzonego zasobu anotowanych pAs, które zawierają dane z 3′-UTR RNA-seq i innych zasobów. Z powodu błędów pokrycia odczytu na 3′-końcu transkryptów, niskiej wydajności odczytów zawierających nie szablonowane ogony poli(A) oraz niejednoznaczności mapowania odczytów w nakładających się izoformach transkryptów, metody oparte na kanonicznych danych RNA-seq są ograniczone przy próbie precyzyjnego mapowania pAs. Jednakże, wraz z postępem technologii molekularnej, metody badania APA stale się rozwijają. Wang i wsp. wykorzystali metodologię CRISPR/Cas9 do badania biologicznej funkcji APA poprzez edycję słabego sygnału poli(A) do kanonicznego sygnału poli(A) i kierowanie sygnałów do docelowych, specyficznych miejsc poli(A) .

W skrócie, każda z obecnie dostępnych metod analitycznych APA ma swoje zalety i ograniczenia. Strategie analityczne oparte na kanonicznych danych RNA-seq są najczęściej wykorzystywane w społeczności badawczej APA.

Badania na poziomie pojedynczych komórek Zaletą podejścia opartego na pojedynczych komórkach jest to, że może ono znacznie zmniejszyć szum tła z komórek zbiorczych, które zawierają mieszaninę materiału RNA wyekstrahowanego z komórek pochodzących z różnych tkanek lub zróżnicowania.

Wraz z rozwojem technologii analizy pojedynczych komórek, zmienność APA wśród komórek została ostatnio zbadana. Chociaż badania APA pojedynczych komórek rzadko były prowadzone na dużą skalę, technika ta działa na dużej głębokości i pełnej długości jednokomórkowego RNA-seq (scRNA-seq), co czyni ją możliwym narzędziem do dokładnej analizy APA. Jingle Bells i scRNA-SeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/) wykorzystały zestawy danych scRNA-seq do badania różnych typów nowotworów. Ye i wsp. zgłosili wykorzystanie danych scRNA-seq do zbadania dynamicznych zmian w wykorzystaniu APA w różnych typach komórek jednojądrowych szpiku kostnego pochodzących z dużej kolekcji próbek zawierających zarówno zdrowe kontrole, jak i pacjentów z AML. Stwierdzili oni, że w porównaniu z osobami zdrowymi, pacjenci z AML wydają się mieć mniejszą różnorodność APA wśród ośmiu różnych typów komórek. Ujawnili również szerokie zaangażowanie regulacji APA w erytropoezę podczas progresji białaczki na poziomie pojedynczej komórki. Analizując 515 zestawów danych scRNA-seq pobranych od 11 pacjentów z rakiem piersi, Kim i wsp. wykazali, że APA specyficzne dla typu komórkowego mogą być zidentyfikowane na poziomie pojedynczej komórki na podstawie zmienności długości 3′-UTR w połączeniu z poziomem ekspresji genów i wzorcami APA. Ponadto wykazali, że immunospecyficzne sygnatury APA w raku piersi mogą być potencjalnie wykorzystane jako marker prognostyczny dla wczesnego stadium raka piersi.

APA i alternatywne splicing: Chociaż istnieją znaczące różnice między APA a alternatywnym splicingiem (AS), zarówno APA, jak i AS mogą generować różne izoformy, nawet oddziałując ze sobą podczas procesu pre-mRNA. Dodatkowo, podczas gdy APA ma cztery typowe izoformy, AS ma ich sześć (Rys. 2). Kilka dogłębnych analiz danych transkryptomicznych z różnych tkanek ludzkich i linii komórkowych wykazało silną korelację pomiędzy APA i AS. Jeśli pA znajduje się w obrębie końcowego eksonu, APA może działać jak specjalny typ AS, nazwany CR-APA, który nie może posiadać kodonu stop in-frame lub 3′-UTR i prawdopodobnie będzie szybko degradowany w procesie rozpadu mRNA z udziałem kodu non-stop (ryc. 1b). Shen i wsp. stwierdzili, że APA i czynnik splicingowy SRSF3 współdziałają w modulowaniu procesu starzenia się komórek. Chociaż APA może odgrywać rolę w niektórych splicing factor-mediated AS, czynniki splicingowe mogą również współpracować z elementami APA, aby pomóc w tym procesie. Na przykład, U2AF2 i RBPs są zdolne do interakcji i rekrutacji CFI w celu ułatwienia tworzenia 3′-końca w pobliżu traktów polipirymidynowych. Ponadto, kompleks CPSF może oddziaływać z czynnikiem splicingowym TFIID (czynnik transkrypcyjny II D) w regulacji polimerazy RNA II. Zaobserwowano również, że U1 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) może działać w obrębie intronów poprzez hamowanie przedwczesnego rozszczepiania i poliadenylacji. Deplecja U1 prowadzi również do aktywacji sygnałów poli-(A) intronów i powoduje APA w całym genomie .

AS i APA konkurują ze sobą również w CR-APA. Na przykład, ablacja czynnika splicingowego 3B subunit1 (składnik U2 snRNP, zwany również SF3b1) może aktywować intronową PAS. U1 snRNP może również niezależnie wpływać na aktywność splicingową APA. Ponieważ U1 snRNP może wiązać się do 5′-końcowego regionu transkryptu i blokować potencjalne rozpoznanie czynnika rozszczepiającego, nokaut U1 snRNP zwiększa wykorzystanie miejsc pA w intronach w pobliżu tego obszaru transkryptu. Movassat i wsp. wykazali jednak, że związek między APA i AS jest ograniczony do intronów terminalnych. Wykazali również, że wyłączenie CstF64 może pośrednio wpływać na AS hnRNP A2/B1, ale nie APA, w komórkach HeLa.

Jak APA reguluje cykl komórkowy

Istnieje wiele genów, w tym TP53, CDC6 (cykl podziału komórkowego 6), CyclinD1 (CCND1) i CDK (kinaza zależna od cyklin), związanych z punktami kontrolnymi cyklu komórkowego i regulujących progresję cyklu komórkowego. Ponieważ pre-mRNA zazwyczaj posiada więcej niż jedno miejsce pA, produkty genowe istotne dla cyklu komórkowego są modulowane przez mechanizm APA i generują różne izomery. Skrócenie 3′-UTR CDC6, głównego regulatora replikacji DNA, jest związane z wyższym poziomem białka CDC6 i zwiększonym wejściem w fazę S w komórkach raka piersi. Cyklina D1, która odgrywa krytyczną rolę w promowaniu przejścia w fazę G1-S w wielu typach komórek, podlega regulacji APA poprzez mechanizmy UTR-APA i CR-APA. Ponadto Xiang i wsp. zbadali 10% wszystkich 20 532 genów związanych ze zdarzeniami APA i zaobserwowali, że większość z tych genów uczestniczy w działaniach związanych ze strukturą chromatyny, co sugeruje związek między przetwarzaniem APA a modyfikacją struktury chromatyny. Mitra i wsp. stwierdzili, że APA działa jako łącznik między cyklem komórkowym a migracją tkanek, analizując rany po wycięciu skóry u myszy. Wykazali, że proliferujące komórki przylegające do rany wykazują wyższy poziom czynników APA niż fibroblasty znajdujące się w stanie spoczynku w niezranionej skórze. PIGN, który reguluje cykl komórkowy poprzez oddziaływanie z białkami punktu kontrolnego wrzeciona, posiada 6 miejsc pA w swoim 3′-UTR (Ryc. 3) .

Jak APA oddziałuje z miRNA w modulacji posttranskrypcyjnej

Ponad 50% konserwowanych mikroRNA (miRNA) kieruje się do miejsc znajdujących się poniżej proksymalnych pA w genach ssaków. W rezultacie, UTR-APA odgrywa kluczową rolę w regulacji interakcji pomiędzy transkryptami i miRNA. APA jest ostatnio identyfikowana jako szeroko rozpowszechniony mechanizm kontrolujący stabilność i ekspresję genów. Miejsca docelowe dla miRNA znajdują się głównie w 3′-UTR. Transkrypty o krótszych długościach 3′-UTR są zwykle bardziej stabilne z powodu utraty miejsc docelowych dla miRNA. Wcześniej wykazano, że APA jest kluczowym mechanizmem regulacyjnym w kilku typach nowotworów, takich jak guz glejaka, rak wątrobowokomórkowy, rak prostaty i rak piersi. Gruber i wsp. wykazali jednak, że skracanie 3′-UTR ma jedynie ograniczony wpływ na proliferację ludzkich i mysich limfocytów T. Wykazali oni również, że nie każda APA ma wpływ na proliferację limfocytów T. Wykazał on również, że nie każde zdarzenie APA odnosi się do wyższych poziomów białka. W kilku badaniach stwierdzono, że wpływ APA na stabilność mRNA i ładowanie rybosomów jest marginalny, zależny od ekspresji miRNA specyficznej dla danego typu komórki i dostępności białek wiążących RNA. Typowym przykładem jest regulacja ekspresji genu PAX3. PAX3 jest głównym regulatorem różnicowania miogennego, którego transkrypt posiada miejsce docelowe dla miR-206 w 3′-UTR. Jednak izoformy PAX3 wykazują wariantowe wzorce różnicowania w różnych typach mięśni .

APA może również modulować cele miRNA, które są zlokalizowane w intronach. Gen ZFR jest ukierunkowany przez intronowe miRNA (miR-579) w linii komórkowej U87. Hinske i wsp. donieśli również, że sygnał APA odgrywa rolę w dostarczaniu negatywnego sprzężenia zwrotnego miRNA do genu ZFP .

APA wpływa na ekspresję genów nie tylko poprzez skracanie 3′-UTR w celu usunięcia miejsc docelowych miRNA, ale również poprzez inne mechanizmy molekularne. Masamha i wsp. podali, że CFIm25 i miR-23 były niezależne w hamowaniu ekspresji 3′-UTR jednej z izoform glutaminazy. Dlatego, chociaż mRNA wymyka się supresji miRNA poprzez skrócenie 3′-UTR w celu usunięcia miejsca docelowego miRNA (kanoniczny mechanizm APA), współistnieją również inne mechanizmy interakcji APA i miRNA.

Perspektywy

APA jest stosunkowo nowym polem badań biomedycznych. Chociaż w ciągu ostatnich kilku lat osiągnęliśmy pewne przełomowe osiągnięcia w badaniach nad APA, wiele pozostaje jeszcze do wyjaśnienia (ryc. 4). W ostatnich kilku latach badania nad APA koncentrowały się na bezpośrednich działaniach różnych czynników trans-aktywujących. Należy mieć nadzieję, że przyszłe badania skoncentrują się na regulacji sygnału tych czynników transaktywujących na poziomie molekularnym i komórkowym. Wiadomo, że APA odgrywa kluczow± rolę w redagowaniu pre-mRNA oraz determinowaniu specyficzno¶ci i stabilno¶ci kolejnych izoform mRNA. APA bierze udział w modulowaniu wrodzonej przeciwwirusowej odpowiedzi immunologicznej, regulacji inicjacji i prognozy nowotworów oraz rozwoju oporności na leki. Tymczasem APA zachowuje się różnie w zależności od indywidualnego genu, typu komórki, rodzaju tkanki, a nawet choroby. Zrozumienie APA i jego kompleksowych mechanizmów regulacyjnych w chorobach człowieka otworzy nowe możliwości dla medycyny precyzyjnej i medycyny spersonalizowanej.

.