Terapia genowa zaburzeń niedziedzicznych

W ostatnich latach dokonano wielu postępów w identyfikacji mechanizmów związanych z przewlekłym uszkodzeniem narządów, co otworzyło drogę do badań nad terapią genową. Podczas gdy wiele badań przedklinicznych i klinicznych w ciągu ostatnich kilku dekad koncentrowało się na rozwoju terapii genowej dla zaburzeń dziedzicznych, pomimo kilku badań przedklinicznych na modelach zwierzęcych, było tylko kilka prób klinicznych, które zostały podjęte w celu zbadania skuteczności terapeutycznej terapii genowej dla chorób niedziedzicznych. Ostatnie badania wykazały, że ekspresja telomerazy przy użyciu wektorów AAV9 wywiera efekty terapeutyczne w mysim modelu zwłóknienia płuc. Terapia ta była ukierunkowana na idiopatyczne zwłóknienie płuc. Wiadomo, że telomery działają jako struktury ochronne na końcach chromosomów, a obecność krótkich telomerów jest jedną z przyczyn rozwoju chorób. W tym schorzeniu telomery stają się zbyt krótkie, co powoduje zaprzestanie podziałów komórkowych, co z kolei prowadzi do apoptozy komórek. Telomeraza jest enzymem, który może zrestrukturyzować długość telomerów, a Povedano i współpracownicy opracowali metodę leczenia wykorzystującą AAV serotyp 9 do dostarczania telomerazy w celu skorygowania krótkich telomerów. Ponieważ AAV9 preferencyjnie celuje w regenerujące się komórki pęcherzyków płucnych typu II (ATII), myszy leczone AAV9-Tert wykazują lepszą funkcję płuc ze zmniejszonym stanem zapalnym i zwłóknieniem w 1-3 tygodnie po leczeniu wektorem. Interesujące jest to, że włóknienie płuc albo poprawiło się albo zniknęło w 8 tygodniu terapii genowej. Leczenie AAV9-Tert prowadzi do dłuższych telomerów i zwiększonej proliferacji komórek ATII, jak również niższych uszkodzeń DNA, apoptozy i starości.

Terapia genowa serca oparta na wektorze AAV wyłania się jako całkowicie nowa platforma leczenia zaburzeń serca. Terapia genowa AAV w niewydolności serca została zatwierdzona w badaniach przedklinicznych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych, a zdecydowana większość z tych podejść została podjęta w celu poprawy obsługi wapnia przez kardiomiocyty. Białkiem terapeutycznym stosowanym w większości tych badań była sarkoplazmatyczna ATPaza wapniowa (SERCA2a). Na podstawie pozytywnych wyników badań przedklinicznych przeprowadzono pierwsze badanie kliniczne (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422), którego celem było dostarczenie SERCA2a za pomocą wektora AAV serotypu 1 do leczenia pacjentów z zaawansowaną niewydolnością serca. Wyniki tego badania fazy 1 zakończyły się sukcesem bez zdarzeń niepożądanych i zostały przeniesione do badania fazy 2a, zapewniając obiecujące wyniki przy znacząco niskim wskaźniku zdarzeń niepożądanych. Jednak wyniki badania klinicznego fazy 2b (badanie CUPID2b, NCT01643330) z użyciem tego samego wektora były rozczarowujące i nie wykazały znaczącej zmiany pomiędzy grupą leczoną a grupą placebo. Doprowadziło to do zaprzestania rekrutacji pacjentów do dwóch dodatkowych badań z użyciem AAV1.SERCA2a. Co ciekawe, w przygotowaniu są dwa nowe badania mające na celu dostarczenie S100A1 za pomocą wektora AAV9 oraz konstytutywnie aktywnej formy inhibitorów fosfatazy białkowej 1, I1c, za pomocą chimerycznego kapsydu z serotypami AAV2 i AAV8. Ponadto serotypy AAV1, AAV6 i AAV9 okazały się najbardziej obiecującymi serotypami AAV do transferu genów sercowych, co daje nadzieję na udane podejścia do terapii genowej w leczeniu niewydolności serca w przyszłości.

Zgłaszano również podejścia do terapii genowej z udziałem AAV w leczeniu bólu neuropatycznego u gryzoni. Fischer i współpracownicy wykazali, że podanie rAAV wyrażającego gen domeny 3 wiążącej kanały Ca2+ (CBD3) znacząco zmniejszyło zachowania bólowe, takie jak hiperalgezja po dotknięciu szpilką lub wrażliwość na stymulację acetonem w zwierzęcych modelach bólu zapalnego i neuropatycznego. Inne badanie z użyciem wektora AAV9 kodującego krótki RNA szpilkowy (shRNA) przeciwko receptorowi waniloidowemu 1 (TRPV1), który jest ważnym genem docelowym dla ostrego bólu, wykazało, że terapia osłabiła wywołaną urazem nerwu alodynię termiczną (zwiększoną odpowiedź neuronów) 10-28 dni po leczeniu w mysim modelu uszkodzenia nerwu oszczędzonego (SNI). Wyniki te dostarczają pozytywnych dowodów zachęcających badaczy zajmujących się terapią genową do opracowania terapii opartej na wektorach AAV dla pacjentów z przewlekłym/cukrzycowym bólem neuropatycznym.

Wyraźny postęp dokonał się w podejściu do terapii genowej w leczeniu przewlekłego zwłóknienia wątroby. Chociaż inhibitory konwertazy angiotensyny (ACE) lub blokery receptora angiotensyny (ARB) są powszechnie stosowane jako leki u pacjentów z nadciśnieniem tętniczym, zostały one wypróbowane u pacjentów z przewlekłą chorobą wątroby; jednak wyniki nie były przekonujące, głównie dlatego, że wywołują one niekorzystne ogólnoustrojowe skutki uboczne. Ze względu na brak możliwości leczenia, przeszczep wątroby stał się nieuchronnie jedyną opcją dla pacjentów ze schyłkową niewydolnością wątroby, wynikającą z przewlekłego włóknienia wątroby i/lub marskości. Co więcej, rosnąca częstość występowania przewlekłej choroby wątroby, brak narządów dawców, powikłania po przeszczepie i wysokie koszty przeszczepu wątroby oznaczają, że istnieje duża potrzeba odkrycia i sformułowania specyficznych, skutecznych, bezpiecznych i niedrogich nowych terapii dla zwłóknienia wątroby/ marskości wątroby.

Jednym z możliwych podejść do obejścia tego problemu jest opracowanie ukierunkowanych narządowo strategii antyfibrotycznych. Badania przeprowadzone w naszym laboratorium sugerują, że jednym z możliwych celów jest „alternatywna oś” układu renina-angiotensyna (RAS), obejmująca kluczowy enzym – enzym konwertujący angiotensynę 2 (ACE2), który rozkłada silny profibrotyczny oktapeptyd – angiotensynę II (Ang II) na antyfibrotyczny heptapeptyd – angiotensynę-(1-7) (Ang-(1-7)). Dowody z badań eksperymentalnych na zwierzętach wykazały, że rekombinowany ludzki ACE2 (rhACE2) jest korzystny w zapobieganiu nadciśnieniu w chorobie sercowo-naczyniowej oraz w poprawie funkcji nerek w nefropatii cukrzycowej. Co ciekawe, rhACE2 był dobrze tolerowany przez grupę zdrowych ochotników w badaniu klinicznym fazy 1, nie wywierając żadnych niepożądanych skutków ubocznych ze strony układu sercowo-naczyniowego. Istnieje jedno badanie, w którym opisano efekty terapeutyczne rekombinowanego ACE2 w eksperymentalnym zwłóknieniu wątroby, w którym uszkodzenie wątroby zostało chirurgicznie wywołane przez cholestazę lub przez hepatotoksyczne wstrzyknięcie czterochlorku węgla. Wykazali oni, że rekombinowany ACE2 znacząco zmniejszył włóknienie wątroby w obu zwierzęcych modelach choroby wątroby. Jednak główną wadą tego systemowego podejścia jest to, że leczenie nieuchronnie wywołuje efekty pozacelowe, które w wielu przypadkach są niepożądane. Tak więc, istnieje kilka wad z systemowego podawania rekombinowanego ACE2. Obejmuje to codzienne wstrzykiwanie ACE2, procedurę, która jest inwazyjna w warunkach klinicznych i kosztowna, z niepożądanym wpływem na regulację ciśnienia krwi. Aby obejść ten problem, idealnym podejściem byłoby zwiększenie poziomu ACE2 specyficznego dla danej tkanki w narządzie docelowym. Dlatego oczekuje się, że specyficzne dla narządu zwiększenie aktywności ACE2 przy użyciu specyficznego dla wątroby rekombinowanego wektora AAV wytworzy efekty terapeutyczne ograniczone do narządu docelowego przy jednoczesnym zminimalizowaniu niepożądanych efektów poza celem.

W dodatku do użycia specyficznego dla wątroby serotypu kapsydu, specyficzność może być dalej wzmocniona przez inżynierię wektora z genem ACE2 pod transkrypcyjną kontrolą silnego promotora specyficznego dla wątroby, apolipoproteiny E/ludzkiej α1-antytrypsyny. W badaniach opublikowanych przez nasze laboratorium wykorzystano pseudotypowy wektor AAV specyficzny dla wątroby (rAAV2/8) do oceny przedklinicznej i stwierdzono, że nadekspresja wątrobowego genu myszy ACE2 dostarczonego do myszy trwała do 6 miesięcy po pojedynczym wstrzyknięciu dootrzewnowym. Następnie leczyliśmy myszy z szeregiem modeli chorób wątroby, które obejmowały zwłóknienie dróg żółciowych wywołane podwiązaniem dróg żółciowych (BDL), uszkodzenie toksyczne wywołane zastrzykami czterochlorku węgla (CCl4) i zwłóknienie wątroby związane ze stłuszczeniem wątroby wywołane przez karmienie dietą ubogą w metioninę i cholinę (MCD) przy użyciu pojedynczego dootrzewnowego wstrzyknięcia rAAV2/8-ACE2 . Leczenie spowodowało znaczny wzrost ekspresji i aktywności białka ACE2, który był ograniczony do wątroby bez wpływu na inne główne narządy. W przeciwieństwie do zaburzeń dziedzicznych, na przykład hemofilii B, w której stosunkowo niski poziom ekspresji transgenu w wątrobie może być wystarczający do późniejszego niewielkiego wzrostu poziomu FIX we krwi, wielkość ekspresji transgenu wymagana do interwencji terapeutycznej w chorobie niedziedzicznej może być znacznie wyższa. To z kolei może stanowić wyzwanie dla badaczy zajmujących się terapią genową. Co ciekawe jednak, w naszym podejściu terapeutycznym ukierunkowanym na wątrobę z rAAV2/8-ACE2, stwierdziliśmy, że zwiększona wątrobowa ekspresja ACE2 zmniejszyła wątrobowy poziom profibrotycznej Ang II o ponad 50% w porównaniu z osobami leczonymi wektorem kontrolnym przenoszącym ludzką surowiczą albuminę (rAAV2/8-HSA). Zmniejszenie Ang II, któremu towarzyszył wzrost wątrobowego poziomu antyfibrotycznego peptydu Ang-(1-7), spowodowało wyraźne zmniejszenie ekspresji cytokin zapalnych, prowadząc do głębokiego zmniejszenia włóknienia wątroby we wszystkich trzech modelach (Figura 2). Te badania z krótkoterminowymi modelami zwierzęcymi zostały następnie zweryfikowane w celu dostarczenia dowodów, że w długoterminowych zwierzęcych modelach zwłóknienia dróg żółciowych i stłuszczeniowej choroby wątroby, które wytwarzają zmiany wątrobowe bardziej porównywalne do tych obserwowanych u pacjentów z takimi chorobami, pojedyncze dootrzewnowe wstrzyknięcie rAAV2/8-ACE2 spowodowało głęboką redukcję zwłóknienia wątroby (Figura 3). W wyraźnym przeciwieństwie do innych badań z użyciem wektorów AAV , stwierdziliśmy, że rAAV2/8-ACE2 zmniejszył poziom transaminazy alaninowej (ALT) w surowicy chorych zwierząt w porównaniu z tymi, które otrzymały wektor kontrolny (rAAV2/8-HSA), co sugeruje, że sam wektor jest bezpieczny w wątrobie. Ponadto, wektor rAAV2/8-HSA (do 10 dni) lub rAAV2/8-ACE2 (do 24 tygodni) wstrzykiwany zdrowym myszom nie powodował zmian w poziomie ALT w osoczu, co potwierdza, że jest mało prawdopodobne, aby sam wektor powodował uszkodzenie wątroby. Schematyczne przedstawienie mechanizmu molekularnego związanego z terapią genową ACE2 przy użyciu wektora rAAV2/8 w zwłóknieniu wątroby przedstawiono na rycinie 4.

Dostarczanie genów do wątroby za pomocą wektora rAAV2/8 okazało się być terapeutycznie obiecujące w wątrobie dorosłych, ale ich efekty nie były szeroko badane w niedojrzałej wątrobie. Chociaż rAAV2/8 transdukuje wątrobę myszy noworodków z wysoką wydajnością, wektor nie jest trwały w wątrobie i szybko zmniejsza się wraz z jej wzrostem. Dlatego też skuteczne zastosowanie terapii z udziałem rAAV2/8 w leczeniu chorób wątroby we wczesnym dzieciństwie może wymagać ponownego podania. Zgodnie z tym, w innym badaniu wykazano, że leczenie noworodków myszy z niedoborem transkarbamylazy ornitynowej (OTC) terapią AAV2/8-OTC nie uchroniło myszy przed hiperamonemią w wieku dorosłym. Tak więc, wytwarzanie stabilnej transdukcji w rozwijającej się wątrobie pozostaje jednym z największych wyzwań dla specyficznej dla wątroby terapii genowej rAAV2/8, a ponowne podanie wektorów może być konieczne do utrzymania skuteczności terapeutycznej w wieku dorosłym po wczesnym leczeniu noworodków.

Chociaż wektory AAV stosowane w badaniach przedklinicznych mogą być skuteczne w ludzkiej wątrobie, ważne jest, aby wybrać wektor AAV specyficzny dla ludzkich hepatocytów o zwiększonej wydajności transdukcji. Ostatnio, dwie grupy zaproponowały użycie humanizowanych myszy, takich jak model myszy FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) w celu zidentyfikowania najlepszego serotypu rAAV dla terapii genowej ukierunkowanej na wątrobę. Badania na humanizowanym modelu mysim repopulowanym w ponad 25% ludzkimi hepatocytami pozwoliły badaczom na zidentyfikowanie specyficznych dla ludzkiej wątroby wektorów AAV takich jak LK-03 pochodzących z biblioteki AAV z przemieszanym DNA kapsydu. Biblioteka ta została wygenerowana przy użyciu 10 genów kapsydu AAV. LK-03, który składa się z pięciu różnych rodzicielskich kapsydu AAV, był w stanie transdukować ludzkie pierwotne hepatocyty z wyższą wydajnością in vitro i w modelu ksenograftów raka wątrobowokomórkowego in vivow porównaniu do AAV serotypu 8. Wang i współpracownicy również zgłosili wyższy poziom transdukcji wątroby u myszy FRG przy użyciu kapsydu AAVrh10, kladu E AAV pochodzącego od makaka rhesus, oraz AAV3B i wykazali, że wektory AAV-LK-03 mogą być lepsze od AAV3B lub AAV8 . Oczekuje się, że badacze będą w coraz większym stopniu wykorzystywać humanizowane modele zwierzęce dla chorób innych niż choroby wątroby, co pozwoli im na zidentyfikowanie nowych wariantów zaprojektowanych wektorów AAV, skuteczności transdukcji i reakcji immunologicznych specyficznych dla badanej tkanki ludzkiej. Ponadto doniesiono, że wektor AAV3B-eGFP, który był w stanie spowodować specyficzną dla wątroby silną ekspresję GFP w wątrobach zwierząt naczelnych, jest znacznie lepszy niż AAV8 bez widocznej hepatotoksyczności .

.