Białka muszą oddziaływać z innymi białkami, aby tworzyć funkcjonalne kompleksy. W wielu przypadkach, funkcja białka wewnątrz komórek nie może być zrozumiana bez informacji o strukturze białka i wiedzy o tym, w jakim kompleksie znajduje się białko.1, 2 Jest to, na przykład, niezwykle ważne dla białek, które modulują epigenetyczną informację na DNA. Prawie wszystkie z tych białek modyfikujących chromatynę wymagają intensywnych interakcji z enzymami metabolicznymi, które dostarczają kofaktorów niezbędnych do acetylacji i deacetylacji histonów lub metylacji i demetylacji.3-5 Ukazuje to potrzebę badania złożonego środowiska danego białka w celu analizy jego funkcji i stanu aktywności. Sieciowanie białek, w połączeniu z analizą za pomocą spektrometrii mas (XL-MS), idealnie nadaje się jako metoda pozyskiwania informacji o strukturze białek i składzie kompleksów białkowych.6-9 Do XL-MS potrzebne są specjalistyczne odczynniki chemiczne – crosslinkery, które są w stanie kowalencyjnie połączyć reszty białkowe znajdujące się w bliskim sąsiedztwie, na przykład oddziałujące w kompleksie.10, 11 Charakterystyka usieciowanych peptydów za pomocą spektrometrii mas stanowi jednak ogromne wyzwanie z dwóch powodów. Po pierwsze, identyfikacja wiązań krzyżowych musi być osiągnięta poprzez analizę jonów fragmentów nie tylko jednego, ale dwóch połączonych peptydów, co znacznie komplikuje widma MS2. Po drugie, usieciowane peptydy występują w bardzo małej ilości i są częścią mieszaniny peptydów, w której przeważają peptydy nieusieciowane. W wielu przypadkach prowadzi to do znacznej utraty informacji, co utrudnia dokładną identyfikację wiązań krzyżowych, a tym samym analizę interaktomu. Opracowano kilka odczynników do sieciowania, które wprowadziły grupy ulegające rozszczepieniu przez MS oraz możliwość wzbogacania XL w celu rozwiązania tych problemów.12-18

Niniejszym doniesieniem przedstawiamy opracowanie nowego odczynnika do sieciowania, który można wzbogacić i ma właściwości rozszczepiające, które umożliwiają dokładną identyfikację wiązań krzyżowych. Zaprojektowany cliXlink (1) jest przedstawiony na Rysunku 1. Przepuszczalny dla komórek odczynnik (rysunek 1 A i rysunek S1 w Informacjach Pomocniczych) zawiera dwie jednostki estru sukcynimidylu, które mogą reagować z nukleofilami w białkach i są oddalone od siebie o około 9 Å; umożliwiając w ten sposób wiązanie na krótkich dystansach w celu uzyskania informacji strukturalnych o białkach i wychwycenia białek znajdujących się blisko siebie. Skuteczne rozszczepienie MS jest zapewnione przez dobrze znaną grupę sulfotlenkową, która może być rozszczepiona w warunkach niskoenergetycznej dysocjacji indukowanej zderzeniem (CID) przed fragmentacją peptydu. Ponadto, jednostka alkinowa umożliwia przyłączenie cząsteczki wzbogacającej, na przykład biotyny, do miejsc usieciowanych za pomocą reakcji CuAAC.19

Zastosowanie crosslinkera może przebiegać zgodnie z tokiem pracy przedstawionym na Rysunku 1 B. Polega on na dodaniu odczynnika 1 do złożonego proteomu, utrwaleniu informacji o odległości w stanie natywnym peptydów znajdujących się w bliskim sąsiedztwie i zachowaniu ich w dalszym toku pracy do analizy MS. Dołączenie grupy powinowactwa do wzbogacania odbywa się po sieciowaniu, aby uniknąć interferencji z nieporęcznymi grupami wzbogacającymi. Poprzez modyfikację usieciowanych peptydów na poziomie białka, nadmiar odczynników małocząsteczkowych może być łatwo usunięty przez wytrącenie acetonem. Po tym następuje enzymatyczne trawienie białek. Usieciowane peptydy są w ten sposób znakowane, na przykład biotyną, co pozwala na ich wzbogacenie. Następnie są one analizowane za pomocą spektrometrii masowej. Ponieważ masy poszczególnych peptydów w wiązaniu krzyżowym nie są od razu dostępne, przypisanie wiązania krzyżowego jest trudne, szczególnie w złożonych próbkach. Wymaga to stosowania odczynników rozszczepiających MS, które ułatwiają identyfikację MS2 poprzez tworzenie specyficznych jonów fragmentów.20, 21 W najlepszym przypadku odczynnik powinien umożliwiać również eksperymenty MS3, co wymaga rozszczepienia środka sieciującego przed peptydami. Pozwala to na rozdzielenie peptydów w celu indywidualnej identyfikacji opartej na MS3. Nasz odczynnik 1 zawiera atomy β-wodoru po obu stronach sulfotlenku, tak więc fragmentacja zachodzi w dwóch kierunkach, jak pokazano na rysunku 1 C. Prowadzi to do czystego rozdzielenia peptydów (α, β) i generuje dwa fragmenty dla każdego peptydu: fragment alkenu i fragment kwasu sulfenowego; ten ostatni tworzy tial po utracie wody. W ten sposób otrzymujemy dwie pary mas o charakterystycznym Δm/z≈32. Co ważne, zaobserwowaliśmy, że przeważa ścieżka fragmentacji a (Rysunek 1 C). Zatem, dla α-peptydu głównym produktem rozszczepienia jest fragment alkenowy, a dla β-peptydu fragment tiolowy. Ze względu na asymetryczne właściwości rozszczepienia, większość intensywności sygnału jest zatrzymywana na jednym fragmencie na peptyd, co powinno zapewnić doskonałą czułość w eksperymentach MS3.

Synteza odczynnika 1 jest prosta (Schemat 1). Punktem wyjścia jest utleniony dimer disulfidowy homocysteiny 2, który jest traktowany kwasem 4-pentynowym w celu otrzymania disulfidu 3. Redukcyjne rozszczepienie disulfidu i alkilowanie powstałych tioli 3-bromopropionianem metylu prowadzi do powstania związku siarczkowego 4. Zmydlanie obu estrów metylowych do 5 i przekształcenie 5 w aktywowany ester bissuccinimidylowy 6, po którym następuje utlenianie tioeteru do sulfotlenku, daje odczynnik 1 z całkowitą wydajnością 16 %. Szczególnie ważne jest to, że odczynnik jest bardzo czysty, a reaktywne jednostki estrowe znajdują się po obu stronach. Należy unikać częściowej hydrolizy. Zostało to zapewnione przez końcowe oczyszczanie przez wytrącanie. Odczynnik 1 został rozpuszczony w mieszaninie octanu etylu i dichlorometanu i wytrącony po dodaniu heksanów.

Następnie zbadaliśmy właściwości MS 1. W tym celu dodaliśmy 1 do powszechnie stosowanego białka modelowego, albuminy surowicy bydlęcej (BSA). Postępowaliśmy zgodnie z przebiegiem pracy przedstawionym na rysunku 1 B bez wykonywania etapu wzbogacania. W skrócie, po dodaniu 1 do roztworu białka i reakcji przez 1 h w temperaturze pokojowej i fizjologicznym pH, wytrąciliśmy białko acetonem, ponownie zawiesiliśmy je w buforze (patrz Informacje pomocnicze), a następnie strawiliśmy białko mieszaniną trypsyny i Lys-C.

Otrzymaną mieszaninę peptydów odsalono za pomocą kolumn C18 Tip i przeanalizowano za pomocą HPLC-MS2 (rysunek 2). Rysunek 2 A przedstawia jako przykład dwa usieciowane peptydy BSA (α+β). Po określeniu dokładnej masy nienaruszonego wiązania krzyżowego (m/z 677,1; Rysunek 2 B), przeprowadziliśmy fragmentację CID i HCD na prekursorze w celu oceny właściwości fragmentacyjnych (Rysunek 2 C). Bardziej selektywna fragmentacja CID (wzbudzenie rezonansowe jonu wiązania krzyżowego; rysunek 2 C, górne widmo) przy niskiej znormalizowanej energii zderzenia wynoszącej 25 % dostarcza, zgodnie z oczekiwaniami, jedynie niewielki zestaw intensywnych sygnałów. Dwie znaczące pary sygnałów, o Δm/z równym 32 (Δmrep), uzyskuje się w wyniku fragmentacji crosslinkera, co skutkuje fragmentem tialowym (α-/β-tial) i alkenowym (α-/β-alken) dla każdego peptydu. Jak wspomniano wcześniej, preferowana jest ścieżka fragmentacji a (Rysunek 1 C), co prowadzi do asymetrycznego rozkładu intensywności. Dominujące tworzenie oczekiwanych nienaruszonych, rozdzielonych peptydów w konsekwencji sprawia, że odczynnik może być wykorzystany do bardziej zaawansowanych eksperymentów MS3.

Do naszych badań wykorzystaliśmy fragmentację HCD. Metoda ta zapewnia jednoczesne rozszczepienie sieciatora i tworzenie fragmentów peptydowych wymaganych do identyfikacji (Rysunek 2 C, dolne widmo). Aby pomóc w rozpoznaniu wiązania krzyżowego/peptydu, ważne jest, aby fragmentacja HCD nadal zapewniała fragmenty alkenowe i tiolowe. Dane HCD pozwalają zatem na identyfikację peptydów za pomocą MS2.

Stosując tę metodę, przeanalizowaliśmy dane za pomocą swobodnie dostępnego oprogramowania MeroX, ściśle filtrując wszystkie identyfikacje wiązań krzyżowych (wynik >50, współczynnik fałszywego odkrycia (FDR) 1%) i wymagając obecności co najmniej trzech z czterech jonów z dwóch charakterystycznych par mas.23, 24 Nie wykorzystując możliwości wzbogacania opartego na CuAAC, byliśmy w stanie zidentyfikować 61 unikalnych wiązań krzyżowych BSA w jednym pomiarze (rysunek 2 D).25 Wynik ten jest reprezentatywny dla pomiarów przeprowadzonych z oczyszczonym BSA w naszym laboratorium. Dodatkowo, przedstawiliśmy wiązania krzyżowe znalezione w strukturze krystalicznej BSA i zauważyliśmy, że większość zmierzonych odległości była odpowiednia. Co ważne, wiązania krzyżowe wykazują średnią odległość Cα-Cα pomiędzy usieciowanymi aminokwasami wynoszącą 22,1 Å i rozkład odległości, który jest w idealnej zgodności z tym, czego oczekuje się w przypadku sieciowania za pomocą odczynnika, który spowalnia aktywne estry o około 9 Å (Rysunki 2 E i S2)26 oraz biorąc pod uwagę długości łańcuchów bocznych i dynamikę molekularną białka.27 Sieciowanie zachodziło głównie pomiędzy dwiema resztami Lys (49%), ale wykryliśmy również połączenia Lys-Thr (30%), Lys-Ser (13%) i Lys-Tyr (8%), co jest zgodne z reaktywnością estrów sukcynimidylowych (Rysunek 2 F).28

Ten sukces pozwolił nam na walidację nowego sieciatora w bardziej złożonym środowisku. Szczególnie zależało nam na pokazaniu dodatkowej wartości możliwości wzbogacania opartego na CuAAC. W tym eksperymencie ponownie usieciowaliśmy białko BSA (10 μg), wytrąciliśmy je acetonem, ponownie rozpuściliśmy usieciowane białko, a następnie przeprowadziliśmy reakcję kliknięcia (Rysunek S3 A) dodając 7 (Rysunek 3 A) i CuSO4/tris(3-hydroksypropylotriazolylometylo)aminę (THPTA), po czym nastąpiła redukcja CuII do CuI po dodaniu askorbinianu sodu. Po 1 h w temperaturze pokojowej przeprowadzono kolejną precypitację acetonem w celu usunięcia nadmiaru azydku biotyny. Następnie dodaliśmy trypsynę i Lys-C do trawienia.

Peptydy te następnie połączyliśmy z trawieniem białka uzyskanym z ekstraktu komórek HEK (435 μg białka; Figura 3 B). W ten sposób powstało ogromne tło nieusieciowanych peptydów. Jeśli przeanalizowaliśmy teraz wiązania krzyżowe w tym dużym tle (Rysunek 3 C), zidentyfikowaliśmy jedynie bardzo małą liczbę dopasowań spektralnych wiązań krzyżowych (średnia CSMs=5,0), unikalnych miejsc usieciowanych (średnia unikalnych XLs=3,7), jak również monolinki (średnia=5,3), w których jeden ester sukcynimidylowy uległ hydrolizie przed reakcją z białkiem. Jeśli jednak wzbogacanie przeprowadziliśmy przy użyciu kulek magnetycznych pokrytych streptawidyną, liczba identyfikacji wiązań krzyżowych uległa radykalnej poprawie. Po inkubacji mieszaniny peptydów z cząsteczkami magnetycznymi; dokładnym przemyciu (6×) kulek buforem (patrz Informacje pomocnicze) i łagodnym, redukcyjnym rozszczepieniu disulfidu w celu uwolnienia „uchwyconych” wiązań krzyżowych, a tym samym usunięcia cząsteczki biotyny (Figura S3 B), obecnie średnio wykryliśmy 95,0 CSM i 37,0 unikalnych XL wraz z 184,3 monoliniami. Liczba zidentyfikowanych unikalnych XLs była niższa niż dla oczyszczonego BSA (Figura 2 D), co można wyjaśnić brakiem wydajności w reakcji CuAAC lub interferencją tła nieusieciowanego kompleksu. Jednakże, wynik ten pokazuje, że nasz nowy środek sieciujący, 1, jest w stanie wzbogacić usieciowane peptydy w znacznym nadmiarze niemodyfikowanych peptydów; ułatwiając w ten sposób analizę złożonych próbek z niską liczbą wiązań krzyżowych. Początkowo byliśmy sceptycznie nastawieni do asymetrycznej struktury 1. Dane pokazują jednak, że pomimo tego, duża liczba wiązań krzyżowych jest identyfikowana.

Podsumowując, nasz nowy crosslinker 1 łączy w sobie następujące zalety: po pierwsze, rozmiar odczynnika jest idealnie dostosowany do uzyskania cennych informacji o odległości dla proteomiki strukturalnej. Ponadto, cząsteczka jest przepuszczalna dla komórek, a jednostka alkinowa nie powoduje większych zakłóceń w reakcji sieciowania. Co więcej, solidna, wydajna fragmentacja sulfotlenkowa upraszcza identyfikację wiązań krzyżowych. Możliwość funkcjonalizacji peptydów usieciowanych za pomocą 1 za pomocą chemii typu „click” pozwala na zastosowanie różnorodnych modyfikacji i strategii wzbogacania, które umożliwiają analizę wiązań krzyżowych o niskiej liczebności. Podsumowując, nasz odczynnik 1 otwiera obecnie drogę do kompleksowej analizy interaktomu z wykorzystaniem eksperymentów MS2 i MS3.

Konflikt interesów

Autorzy nie zgłaszają konfliktu interesów.