Nutzen der von Exiguobacterium sp. 12/1 produzierten organischen Säure bei der Neutralisierung alkalischer Abwässer
Abstract
Das Ziel dieser Studie war es, die Rolle der von Exiguobacterium sp. Stamm 12/1 (DSM 21148) produzierten organischen Säuren bei der Neutralisierung alkalischer Abwässer aus der Getränkeindustrie zu untersuchen. Es ist bekannt, dass dieses Bakterium in der Lage ist, in einem Medium mit einem pH-Wert von bis zu 12,0 zu wachsen und alkalische Industrieabwässer von pH 12,0 bis pH 7,5 zu neutralisieren. Die anfängliche Untersuchung der Art der im Medium vorhandenen funktionellen Gruppen mittels FT-IR-Spektroskopie ergab das Vorhandensein von Peaks, die der Carbonylgruppe und der Hydroxylgruppe entsprechen, was auf die Freisetzung von Carbonsäure oder verwandten Stoffwechselprodukten schließen lässt. Die Identifizierung der spezifischen Carbonsäuregruppe mittels RP-HPLC ergab das Vorhandensein eines einzelnen Peaks im Kulturüberstand, dessen Retentionszeit der von Ameisensäure am ähnlichsten ist. Die Konzentration der mit verschiedenen Kohlenstoffquellen produzierten Säure wurde in Abhängigkeit von der Zeit untersucht. Obwohl die Säure in der gleichen Endkonzentration vorhanden war, war die Rate der Säureproduktion im Falle eines mit Saccharose ergänzten Mediums am höchsten, gefolgt von Fructose und Glucose. Die Kenntnis der Stoffwechselprodukte des Bakteriums kann als ein erster Schritt zur Realisierung seines Potentials für die Bioremediation alkalischer Abwässer aus der Getränkeindustrie in großem Maßstab angesehen werden.
1. Einleitung
Alkaliphile – Mikroorganismen, die ein pH-Optimum für das Wachstum bei oder über pH 9 haben – haben einen großen Einfluss auf industrielle Anwendungen ausgeübt. Biologische Detergenzien enthalten Enzyme wie alkalische Cellulasen und/oder alkalische Proteasen, die aus Alkaliphilen gewonnen wurden. Alkaliphile wurden auch für die industrielle Herstellung von Enzymen verwendet, die von spezifischem Nutzen sein könnten, z. B. Cyclodextrin durch alkalische Cyclomaltodextrin-Glucanotransferase und alkalisch aktive maltohexaosebildende α-Amylase, die in der Lebensmittel-, Chemie- und Pharmaindustrie Anwendung finden. Es wurde berichtet, dass alkalibehandelter Holzstoff durch von Alkaliphilen produzierte Xylanasen biologisch gebleicht werden kann. Fujiwara und Mitarbeiter berichteten über die Verwendung einer alkalischen Protease zur Zersetzung der gelatinösen Beschichtung von Röntgenfilmen, aus denen Silber zurückgewonnen wurde. Alkaliphile haben auch ihr Potenzial für den biologischen Abbau einer Vielzahl organischer Verbindungen bewiesen.
So haben alkaliphile Bakterien aufgrund ihrer extrazellulären Enzyme und biochemischen Eigenschaften wie Alkaliphilie und Alkalistabilität großes Interesse auf sich gezogen. Auch ihre Bioenergetik wurde bereits eingehend untersucht, während über ihre Physiologie, z. B. intrazelluläre Enzyme und Metaboliten, wenig bekannt ist. Merkmale des intermediären Stoffwechsels sind wichtig, da sie zur Charakterisierung des Bakteriums, seiner Enzymzusammensetzung, des Stoffwechselstadiums der Zellen und der Möglichkeiten des Metabolic Engineering beitragen. Die Fähigkeit von Alkaliphilen, den pH-Wert eines kohlenhydrathaltigen Mediums stark zu schwanken, wurde in früheren Arbeiten zur Neutralisierung stark alkalischer Abwässer aus der Getränkeindustrie mit Exiguobacterium sp. Stamm 12/1 genutzt. Die Gattung Exiguobacterium gehört zur Ordnung der Bacillales, zu der auch Mitglieder der Gattung Bacillus gehören. Exiguobacterium sp. 12/1 ist ein fakultativ alkalipiles Bakterium, das optimal bei einem pH-Wert von 10 wächst und in der Lage ist, alkalische Abwässer zu neutralisieren, um sie von einem pH-Wert von 12,0 auf einen pH-Wert von 7,5 zu senken. Es wird angenommen, dass das Bakterium saure Stoffwechselprodukte freisetzt, um das stark alkalische externe Medium zu neutralisieren. Es ist jedoch wichtig, die Art der in das extrazelluläre Medium freigesetzten Stoffwechselprodukte zu charakterisieren. Hier untersuchen wir die Produktion organischer Säuren als einen möglichen Mechanismus zur Neutralisierung des Alkali. Derartige Studien sind notwendig, bevor das Bakterium in großem Maßstab zur Neutralisierung alkalischer Abwässer aus der Getränkeindustrie eingesetzt werden kann.
Die Hauptkohlenstoffquelle im Abwasser der Erfrischungsgetränkeindustrie ist Saccharose (ein Disaccharid, das Glukose und Fruktose enthält), die auch den größten Beitrag zum biochemischen Sauerstoffbedarf (BSB) leistet. Der durchschnittliche BSB von Abwässern der Erfrischungsgetränkeindustrie liegt zwischen 600 und 4500 mg/L, was 673-5052 ppm Saccharose entspricht. Eine Literaturübersicht über die Stoffwechselprodukte einer großen Anzahl von Bakterien, die auf Einfachzucker wachsen, deutet darauf hin, dass die Bakterien diese Einfachzucker zur Erzeugung organischer Säuren nutzen könnten. Dies wird auch durch die Analyse der extrazellulären Stoffwechselprodukte anderer alkaliphiler Bacillus-Arten untermauert. Die wichtigste organische Säure, die in diesen Studien mit Saccharose als Kohlenstoffquelle produziert wurde, war Essigsäure. Ameisensäure ist ein übliches Stoffwechselprodukt neutrophiler Bakterien unter anaeroben Bedingungen, während B. circulans var. alkalophilus selbst in aeroben Kulturen bis zu 2 g/l davon produziert. Andere flüchtige Säuren wie Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure und Isovaleriansäure sind typisch für die Stämme Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus und Bacillus sp. 17-1. Isobuttersäure und Isovaleriansäure wurden in den Medien verschiedener neutrophiler Bazillen nachgewiesen. Diese Säuren sowie Propion- und Buttersäure werden jedoch aufgrund von Untersuchungen an Clostridium sp. als aus Aminosäuren stammend angesehen. Milch- und Brenztraubensäure werden recht häufig von neutrophilen Bazillen produziert, die Produktion von Bernsteinsäure durch Bacillus ist jedoch selten. Ethanol wurde in alkaliphilen Bazillen nicht nachgewiesen, obwohl es ein typisches Produkt von Glukosekulturen vieler neutrophiler Bazillen ist. Somit können alkalische Wachstumsbedingungen die Produktion der neutralen Metaboliten beeinflussen. In dieser Studie haben wir die Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie verwendet, um die Art und Konzentration der Säuren zu untersuchen, die von Exiguobacterium sp. Stamm 12/1 während der Neutralisierung eines Mediums mit hohem pH-Wert und verschiedenen Arten von Kohlenstoffquellen produziert werden.
2. Materialien und Methoden
2.1. Stamm und Kulturbedingungen
Die Kultur von Exiguobacterium sp. 12/1 wurde von DSMZ (DSM 21148) bezogen und als Glycerinvorrat gehalten. Alkalisches Basalmedium (ABM) mit (alle Konzentrationen in g/L): Pepton, 1; Hefeextrakt, 0,5; Glukose, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (die letzten drei Komponenten wurden dem autoklavierten Medium aus separat sterilisierten Lösungen zugesetzt) wurde für die routinemäßige Kultivierung von Stamm 12/1 bei 37°C verwendet. Für die IR- und RP-HPLC-Analyse wurde das Bakterium bei 37°C und 200 U/min in Minimal Salt Medium (MSM) kultiviert, das (alle Konzentrationen in mM) enthält: K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA-Dinatriumsalz, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 und 1 % (w/v) eines der folgenden Kohlenhydrate: Glukose, Fruktose oder Saccharose (alle Komponenten wurden aus den separat autoklavierten konzentrierten Stammlösungen zugegeben). Der endgültige pH-Wert des Mediums wurde mit 1 N NaOH auf 10,5 eingestellt.
2,2. Analyse des Wachstums und des pH-Werts der Kultur
1 mL der Kultur in der log-Phase auf ABM wurde zur Beimpfung von Vorkulturen (50 mL) verwendet (MSM mit 1% Zucker). Die eigentliche Testkultur (250 mL MSM in 500 mL Erlenmeyerkolben) wurde mit der gesamten Vorkultur in der mittleren log-Phase (O.D. ~ 1,2) beimpft. Jeder Kultursatz bestand aus drei Kolben. Die Absorption der Proben bei 650 nm wurde als Maß für das bakterielle Wachstum verwendet. Der pH-Wert wurde in zellfreien Kulturproben bei Raumtemperatur nach 20-minütiger Zentrifugation bei 4000 ×g bestimmt.
2.3. FT-IR-Analyse
Die Kultur wurde nach 60 h Wachstum geerntet und 20 min bei 4000 ×g zentrifugiert. Für die IR-Analyse wurde der Kulturüberstand gefriergetrocknet und in Pulverform zerkleinert. Der pulverisierte Überstand wurde dann mit Kaliumbromid gemischt, und die Mischung wurde zu einer Tablette gepresst. Schließlich wurde die Tablette mit dem FT/IR-4200-Spektrometer (JASCO, Tokio, Japan) analysiert.
2.4. RP-HPLC-Analyse
Die Kultur wurde zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet und 20 Minuten lang bei 4000 ×g zentrifugiert. Für die HPLC-Analyse wurde der Kulturüberstand durch einen 0,22-μm-Filter filtriert, und 10 μl der filtrierten Probe wurden in die HPLC-Säule injiziert.
Ameisensäure, Essigsäure, Bernsteinsäure, Propionsäure, Milchsäure und Isobuttersäure in analytischer Standardqualität wurden von Sigma bezogen. Standard-Stammlösungen (100 mg/mL oder 100 μL/mL) wurden hergestellt und zur weiteren Verwendung bei 4°C gelagert. Arbeitsstandardlösungen (10 mg/mL oder 10 μL/mL) wurden täglich hergestellt. Milli-Q-Wasser (Millipore) wurde zur Herstellung von Puffer- und Stammlösungen der einzelnen Verbindungen und Proben verwendet. Die Stammlösungen, Proben und Puffer wurden durch Zellulosemembranfilter von Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA) filtriert. Die Lösungsmittel wurden vor der Verwendung unter Vakuum entgast.
Die Analyse der organischen Säuren wurde nach der Methode von Tormo und Izco durchgeführt. Die Analyse wurde mit einem Breeze-System (Waters, Mildford, MA, USA) durchgeführt, das aus einer binären HPLC-Pumpe 1525, einem Autosampler 717 plus und einem Zweikanal-UV-Detektor 2487 bei 210 nm besteht und mit einer Breeze-Software betrieben wird. Die Trennung wurde auf einer Atlantis dC18-Säule (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm durchgeführt. 20 mM NaH2PO4, das mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt war, wurde täglich zubereitet und durch hydrophile 0,2 μm-Membranen (Millipore) filtriert. Das Lösungsmittelprogramm bestand aus zwei Behältern mit 1 % Acetonitril in 20 mM Phosphatpuffer, der mit Phosphorsäure auf einen pH-Wert von 2,20 eingestellt war (Lösungsmittel A), und Acetonitril (Lösungsmittel B); die Durchflussrate war auf 1,5 mL/min bei Raumtemperatur eingestellt. Das Gradientenprogramm begann mit 100 % des Lösungsmittels A, und nach 7 Minuten wurde das Lösungsmittel B linear erhöht, um in 5 Minuten 7 % zu erreichen. Von 12 bis 19 min wurde die Rate bei 93% des Lösungsmittels A und 7% des Lösungsmittels B gehalten. Danach wurde die Rate auf die Ausgangsbedingungen geändert, um die Säule 15 min lang zu äquilibrieren, bevor erneut 10 μL der nächsten Probe injiziert wurden.
3. Ergebnisse
3.1. Analyse der Neutralisation auf definiertem Medium
Für die Analyse der von dem Bakterium produzierten organischen Säure wurde ein Minimal-Salz-Medium ausgewählt, da es definiert ist und eine ähnliche Kohlenstoffquelle wie die Abwässer der Getränkeindustrie aufweist. Das Bakterium wuchs in einem Minimal-Salz-Medium, das mit verschiedenen Kohlenstoffquellen wie Glukose, Fruktose und Saccharose versetzt war. Abbildung 1 zeigt das Wachstumsprofil und die pH-Eigenschaften des Mediums im Laufe der Zeit. Fruktose und Saccharose führten im Vergleich zu Glukose zu einer wesentlich schnelleren Neutralisierung des Mediums. Der endgültige pH-Wert, der mit Glukose erreicht wurde, war auch etwas höher als der des mit Saccharose und Fruktose angereicherten Mediums. Dies spiegelt sich auch im Wachstumsprofil des Bakteriums wider, das auf den drei Kohlenstoffquellen gewachsen ist. Die Bakterien wuchsen schneller in Saccharose, gefolgt von Fruktose und Glukose.
(a)
(b)
(a)
(b)
Veränderung von pH (a) und O.D. (b) mit der Zeit auf MSM. Die Werte stellen den Durchschnitt von drei Wiederholungsmessungen dar, die Fehlerbalken die Standardabweichung.
3.2. Identifizierung der im Kulturüberstand vorhandenen funktionellen Gruppe
Um die breite funktionelle Gruppe des von dem Bakterium zur Neutralisierung alkalischer Abwässer produzierten Metaboliten zu identifizieren, wurde der gefriergetrocknete Kulturüberstand einer FT-IR-Spektroskopie unterzogen. Zwei Peaks, die der Carbonylgruppe (bei 1644,98 cm-1) und der Hydroxylgruppe (bei 3436,74 cm-1) entsprechen, waren im Spektrum zu finden (Tabelle 1). Nach der Literaturübersicht produziert das Bakterium höchstwahrscheinlich organische Säuren als Stoffwechselprodukt, die das alkalische Abwasser neutralisieren.
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3.3. Identifizierung des spezifischen Stoffwechselprodukts des Bakteriums
Um die vom Bakterium produzierte organische Säure zu identifizieren, wurde eine Umkehrphasen-HPLC mit bekannten Standards für organische Säuren durchgeführt, die nach einer Literaturrecherche ausgewählt wurden. Die Standards wurden sowohl einzeln (Abbildung 2(a)) als auch im Gemisch (Abbildung 2(b)) untersucht, um etwaige Unterschiede in der Retentionszeit festzustellen, die auf Interferenzen mit anderen organischen Säuren im Medium zurückzuführen sind. Es wurde festgestellt, dass die RT der organischen Standardsäuren in beiden Fällen ähnlich war und der Unterschied in der Retentionszeit nicht mehr als 0,09 Einheiten betrug, außer bei Propionsäure (Tabelle 2). Der Kulturüberstand wurde mit der gleichen Methode analysiert und ergab einen einzigen Peak mit einer ähnlichen Retentionszeit wie Ameisensäure. Dies wurde weiter bestätigt, indem der Überstand mit Standard-Ameisensäure versetzt wurde, deren Peak sich mit dem des Produkts im Überstand überlagerte (Abbildung 2(d)).
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(b)
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RP-HPLC-Chromatogramme der einzelnen organischen Standardsäuren (a), Standardorganische Säuren im Gemisch (b), Kulturüberstand (c) und mit Ameisensäure versetzter Kulturüberstand.
3.4. Quantitative Analyse des Stoffwechselprodukts des Bakteriums
Für die quantitative Analyse des Kulturüberstands wurden verschiedene Standardkonzentrationen von Ameisensäure verwendet, und die Peakfläche für jede Konzentration wurde berechnet. Die Peakfläche wurde gegen die Konzentration aufgetragen, um eine Standardkurve zu erhalten (Abbildung 3). Anhand dieser Standardkurve wurde die Menge an Säure berechnet, die im Laufe der Zeit auf einem mit verschiedenen Kohlenstoffquellen ergänzten Mineralsalzmedium produziert wurde. Der Kulturüberstand des Bakteriums wurde zeitabhängig analysiert und erneut einer Umkehrphasen-HPLC-Analyse unterzogen. Es wurde festgestellt, dass der Peak des Hauptprodukts im bakteriellen Kulturüberstand mit der Zeit zunimmt. Die Retentionszeit der Säure ist ähnlich wie die der Ameisensäure. Die Untersuchung der mit verschiedenen Kohlenstoffquellen produzierten Ameisensäure als Funktion der Zeit ist in Abbildung 4 dargestellt. Die höchste Menge an Säure wurde bei mit Saccharose angereichertem Separatorenfleisch produziert, gefolgt von Fruktose und Glukose.
Standardkurve für die Bestimmung der Ameisensäurekonzentration im Kulturüberstand.
Veränderung der Menge der produzierten organischen Säure mit der Zeit bei MSM, das mit verschiedenen Kohlenstoffquellen ergänzt wurde. Die Werte stellen den Durchschnitt von drei Wiederholungsmessungen dar, die Fehlerbalken die Standardabweichung.
4. Diskussion
Die wichtigste Kohlenstoffquelle im Abwasser der Getränkeindustrie ist Saccharose. Daher wurde für die Analyse der bei der Neutralisierung entstehenden Stoffwechselprodukte ein genau definiertes Minimal-Salzmedium ausgewählt, das Saccharose und die beiden Monosaccharidzucker Glucose und Fructose enthält. Die Wachstumseigenschaften des Stammes 12/1 auf Minimal-Salz-Medien, die mit den drei Kohlenstoffquellen ergänzt wurden, zeigen eine effiziente Neutralisierung, die mit dem Wachstum einhergeht (Abbildungen 1(a) und 1(b)). Die Abnahme des pH-Wertes des Wachstumsmediums ist zwangsläufig entweder auf die Bildung von Säuren oder auf die Entfernung von Basen zurückzuführen.
Die Bildung von Säuren ist bei Bakterien, die auf Einfachzucker wachsen, gut dokumentiert. Die Stoffwechselprodukte einiger alkaliphilischer Mitglieder der Gattung Bacillus wurden untersucht. Die wichtigste organische Säure, die in diesen Studien auf der Kohlenstoffquelle Saccharose produziert wurde, war Essigsäure. Die Genomsequenzen der alkaliphilen Bacillus-Arten – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans und Bacillus clausii – stützen diese Beobachtung ebenfalls, da alle diese Arten einen funktionellen Pyruvat-Acetat-Umwandlungsweg besitzen. Ameisensäure ist ein üblicher Metabolit neutrophiler Bakterien unter anaeroben Bedingungen, während B. circulans var. alkalophilus selbst in aeroben Kulturen bis zu 2 g/l davon produziert. Andere flüchtige Säuren wie Propionsäure, Buttersäure, Isobuttersäure und Isovaleriansäure sind typisch für die Stämme Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus und Bacillus sp. 17-1. Isobuttersäure und Isovaleriansäure wurden in den Medien verschiedener neutrophiler Bazillen nachgewiesen. Diese Säuren sowie Propion- und Buttersäure werden jedoch aufgrund von Untersuchungen an Clostridium sp. als aus Aminosäuren stammend angesehen. Milch- und Brenztraubensäure werden recht häufig von neutrophilen Bazillen produziert, aber die Produktion von Bernsteinsäure durch Bacillus ist selten. Ethanol wurde in alkaliphilen Bazillen nicht nachgewiesen, obwohl es ein typisches Produkt von Glukosekulturen vieler neutrophiler Bazillen ist. Die alkalischen Wachstumsbedingungen können also die Produktion der neutralen Metaboliten beeinflussen.
Die ersten Untersuchungen der Stoffwechselprodukte von Bacillus sp. wurden mit Hilfe des titrimetrischen Verfahrens durchgeführt. Die erhöhte Pufferkapazität des bakteriellen Kulturüberstandes bei pH 5, dem typischen Bereich der Protonierung von Carbonsäuren, wurde zu der Hypothese genutzt, dass das Medium Carbonsäuren enthält. In dieser Studie haben wir die FT-IR-Spektroskopie eingesetzt, um die funktionelle(n) Gruppe(n) der im Kulturüberstand vorhandenen Verbindungen zu bestimmen. Die FT-IR-Spektrografie zeigte die charakteristischen Peaks der Carbonylgruppe (bei 1644,98 nm) und der Hydroxylgruppe (bei 3436,74 nm) (Tabelle 1), was auf das Vorhandensein einer chemischen Spezies hindeutet, die aus einer Hydroxyl- und einer Carbonylgruppe besteht und höchstwahrscheinlich eine Carbonsäure ist.
Die Umkehrphasen-HPLC-Methode wurde zur Analyse der im Kulturüberstand vorhandenen organischen Säuren verwendet. Die HPLC-Bedingungen wurden so gewählt, dass die beste Auflösung erzielt wurde, d.h. pH 2,2 und 1% Acetonitril. Die Umkehrphasen-HPLC-Methode ist vorteilhaft, da kostengünstigere Säulen verwendet werden können, die analytischen Parameter zur Optimierung der Trennung leichter zu manipulieren sind und die Analysen bei Raumtemperatur durchgeführt werden können. Die Methode wurde zunächst zur Berechnung der Retentionszeit von Säurestandards verwendet, die anhand einer Literaturübersicht ausgewählt wurden. Die Reihenfolge der Elution der Säuren unter diesen Bedingungen war die gleiche wie in Tormo und Izco , aber es gab Abweichungen zwischen den Retentionszeiten, die in dieser Studie beobachtet wurden, und denen, die in Tormo und Izco berichtet wurden. Diese Abweichung kann auf unterschiedliche HPLC-Bedingungen zurückgeführt werden, wie z. B. die Temperatur von 25-30 °C in dieser Studie gegenüber 24 °C ± 1 °C in Tormo und Izco .
Die RP-HPLC des Kulturüberstands zeigt das Vorhandensein eines einzelnen Peaks mit einer Absorption bei 211 nm, der charakteristischen Absorptionswellenlänge von organischen Säuren. Somit enthält der Überstand eine einzige chemische Spezies, bei der es sich höchstwahrscheinlich um eine organische Säure handelt. Der Vergleich der Retentionszeit dieses Peaks mit der Retentionszeit von organischen Standardsäuren zeigt, dass die Retentionszeit der Ameisensäure am ähnlichsten ist. Diese Beobachtung wurde durch die Zugabe von Ameisensäure in den Kulturüberstand bestätigt, wodurch sich die Peakfläche des Produkts vergrößert (Abbildungen 2(c) und 2(d)). Das Vorhandensein von Ameisensäure im Kulturüberstand steht im Einklang mit den Stoffwechselprodukten einiger alkaliphiler Mitglieder der Gattung Bacillus sowie einiger saccharolytischer anaerober alkaliphiler Bakterien wie Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum und Amphibacillus tropicus .
Die maximale Abnahme der pH-Einheiten pro Zeiteinheit, die bisher bei alkaliphilen Bakterien berichtet wurde, beträgt 0,13 Einheiten pro Stunde im Fall von Bacillus circulans var. alkalophilus, was im Vergleich zu der in dieser Studie berichteten Abnahme um mehr als zwei Einheiten während der ersten 1 Stunde der Inokulation recht gering ist. Der starke Rückgang des pH-Wertes deutet auf die Bildung von sauren Abbauprodukten hin. Die Geschwindigkeit der pH-Senkung allein sagt jedoch nichts über die Zunahme der Säurekonzentration aus. Daher wurde die quantitative Analyse der Stoffwechselprodukte des Bakteriums mit RP-HPLC durchgeführt. Die HPLC wurde der GC vorgezogen, da ein Vergleich von GC- und HPLC-Methoden zur Bestimmung organischer Säuren in Kulturüberständen alkalophiler Bakterien zeigt, dass die Auflösung der Säuren mit der GLC zwar hervorragend, die quantitative Reproduzierbarkeit mit der HPLC jedoch besser war als mit der GLC. Wie erwartet, nahm die Konzentration der produzierten Säure mit zunehmender Inkubationszeit zu (Abbildung 4). Tatsächlich nahm die Säuremenge noch lange nach Erreichen des minimalen pH-Werts zu. Dies stimmt mit früheren Untersuchungen der Säureproduktion bei fakultativ und obligat alkaliphilen Bacillus sp. überein, bei denen die Säureproduktion auch 30 Stunden nach Erreichen des minimalen pH-Werts noch anstieg. Die vergleichende Analyse des Stoffwechselprodukts, das in mit verschiedenen Kohlenstoffquellen ergänzten Medien produziert wurde, zeigt, dass die Säureproduktion, obwohl sie in der gleichen Endkonzentration vorhanden war, im Falle des mit Saccharose ergänzten Mediums am höchsten war, gefolgt von Fructose und Glucose (Abbildung 4). Dies steht im Einklang mit den Wachstumseigenschaften des Organismus in den mit diesen Zuckern ergänzten Medien.
5. Schlussfolgerung
Exiguobacterium sp. Stamm 12/1 neutralisiert den pH-Wert des externen Mediums durch die Produktion von kurzkettiger organischer Säure – Ameisensäure. In Anbetracht der potenziellen Anwendung der Bioremediation alkalischer Abwässer in großem Maßstab kann diese Fähigkeit des Bakteriums zur Neutralisierung von Alkali in Abwässern der Getränkeindustrie als ein erster Schritt zur Nutzung seines Vermarktungspotenzials angesehen werden.
Danksagungen
N. M. Kulshreshtha dankt der University Grants Commission für das Forschungsstipendium. Die Autoren sind dem Council of Scientific and Industrial Research, Indien, für die Bereitstellung einer F&D-Plattform und von Einrichtungen für diese Forschung sehr dankbar.