“Een moleculair-genetische techniek die wordt gebruikt voor de directe manipulatie, wijziging of modificatie van genen of het genoom van organismen om de fenotypes te manipuleren, wordt genetische manipulatie genoemd.”

Of met andere woorden, we kunnen zeggen:

“Genetische manipulatie is een techniek waarmee de genetische samenstelling van een organisme kan worden veranderd.”

De techniek staat vaak bekend als genetische manipulatie, genetische modificatie of genetische wijzigingen, in grote lijnen wordt het gecategoriseerd als genetische manipulatie.

Bij deze techniek wordt een recombinant DNA geconstrueerd en met behulp van een vector in het genoom van de gastheer ingebracht. Of we kunnen enkele mutante sequenties uit een genoom verwijderen. Het eerste recombinant-DNA werd in 1972 door Paul Berg geconstrueerd.

Met de techniek van de genetische manipulatie kunnen genetisch gemodificeerde organismen worden geconstrueerd die economisch zeer belangrijk voor ons zijn.

Het wordt gebruikt voor de produktie van verbeterde plantensoorten, therapeutische geneesmiddelen of proteïnen, preventie van erfelijke genetische afwijkingen en de bouw van een genetisch gemodificeerd organisme.

In dit artikel zullen we het vooral hebben over genetische manipulatie en de toepassingen daarvan. De inhoud van het artikel is,

• Wat is genetische manipulatie
  • Definitie
  • Geschiedenis
  • Typen
  • Proces
• Toepassing van gentechnologie
• Beperkingen van gentechnologie
• Conclusie

Mensen manipuleren al lang het genetisch materiaal van veel organismen. Met behulp van selectieve veredeling en kruishybridisatie werden door ons economisch belangrijke plantensoorten gecreëerd.

Het doel van de ontwikkeling van de genetische manipulatie of genetische manipulatietechniek is het produceren van organismen of fenotypen die nuttig voor ons zijn. Genetische manipulatietechnieken worden gebruikt voor,

• Bouw van genetisch gemodificeerde plantensoorten.
• Abiotische en biotische stress resistente plantensoorten.
• Economisch belangrijke plantensoorten
• Commercieel waardevol organisme
• Voor de productie van therapeutische geneesmiddelen
• Voorkomen van genetische afwijkingen.

“Bij genetische manipulatie wordt het DNA van twee verschillende cellen gecombineerd en via een vector in het genoom van de gastheer ingebracht.” Belangrijke onderdelen van de genmanipulatie-experimenten worden hier uitgelegd.

Gen van belang: Een DNA-sequentie die we in onze doelcellen willen inbrengen.

Vector: met behulp van plasmide-DNA-achtige vectoren wordt het gen van interesse in het genoom van de gastheer ingebracht. Vectoren zijn een soort voertuigen die het genetisch materiaal overbrengen.

Doelcellen: doelcellen zijn de populatie cellen waarvan we het genoom willen manipuleren of veranderen.

Definities:

“Een techniek die wordt gebruikt om een gemuteerd gen in te brengen of te verwijderen of om het genoom van een organisme te manipuleren, staat bekend als genetische manipulatie.”

Geschiedenis van genetische manipulatie:

De term genetische manipulatie werd voor het eerst gebruikt door een science-fiction romanschrijver, niet door een wetenschapper. In 1951, gebruikte Jack Williamson de term “genetische manipulatie” voor het eerst in zijn roman “Drakeneiland”.

Snel daarna werd de moleculaire structuur van het DNA ontdekt door Watson en Crick, hoewel de genetische experimenten al populair waren sinds de tijd van Mendel.

Het eerste recombinant-DNA werd in 1972 geconstrueerd door Paul Berg. In datzelfde jaar voerden Herbert Boyer en Stanley Cohen experimenten met genoverdracht uit. In 1974 had Rudolf Jaenisch genetisch gemodificeerde muizen gemaakt, de eerste keer in de geschiedenis van de genetica.

Na het succes van Rudolf werd in 1976 de genetisch gemodificeerde of genetisch gemanipuleerde tabaksplantensoort ontwikkeld.

Tijdens deze periode (tussen 1960 en 1990) werden restrictie digestie, ligatie en PCR-achtige technieken ontdekt die vleugels gaven aan de genetische manipulatie technologie.

Gerelateerd artikel: Wat is een genoom?

Soort van genetische manipulatie technieken:

Recombinant DNA- Een recombinant DNA-technologie is een type genetische engineering-technologie waarbij een kunstmatige DNA-molecule wordt geconstrueerd door twee verschillende DNA’s met behulp van fysische methoden te ligeren. Daartoe wordt het gen van belang in de plasmidevector ingevoegd en gebruikt voor genoverdrachtsexperimenten.

Genoverdrachtstechniek wordt gebruikt voor de insertie van een gen van belang in het gastheergenoom.

Elektroforatie, solicitatie en virale vector-gemedieerde genoverdracht, liposoom-gemedieerde genoverdracht, transposon-gemedieerde genoverdracht zijn enkele van de methoden die daarvoor worden gebruikt.

Gene editing- Een gene-editing techniek wordt gebruikt om het genoom te bewerken waarbij een ongewenste DNA-sequentie wordt verwijderd of een nieuw gen in het genoom van de gastheer kan worden ingevoegd. CRISPR-CAS9, TALEN en ZFN zijn enkele bekende gen-editing-tools die bij gentherapie-experimenten worden gebruikt.

Lees meer: Wat is gen-editing en CRISPR-CAS9?

Proces van genetische manipulatie:

De techniek van genetische manipulatie wordt voor veel verschillende doeleinden gebruikt, zodat we eerst het doel van het experiment moeten bepalen. Het hele proces van genetische manipulatie kan worden onderverdeeld in 5 bredere stappen:

• Selecteren en isoleren van het kandidaatgen
• Selectie en bouw van plasmide
• Gentransformatie
• Insertie van DNA in het gastgenoom
• Bevestiging van insert

Selecteren en isoleren van het kandidaatgen:

Het gen moet een sequentie van DNA bevatten die we willen bestuderen en daarvoor heeft een gen enkele speciale kenmerken. Een kandidaat-gen moet een hoog GC-gehalte hebben en een minder repeterende DNA-sequentie.

Daarnaast moet het gen van belang niet te lang zijn- slechts enkele kb genen kunnen met succes worden ingebracht. Hoe langer het gen, hoe groter de kans op mislukking. Het kandidaat-gen moet een start- en stopcodon bevatten. Verwant artikel: Wat is de genetische code?

Nu kan het gen van belang worden geïsoleerd van de rest van het DNA met behulp van restrictie digestie of polymerase kettingreactie.

De restrictie-endonucleasen zijn de bacteriële enzymen die het vermogen hebben de DNA-sequentie op een specifieke plaats te verteren. Met behulp van een specifiek type restrictie-endonuclease kunnen we ons gen van belang doorsnijden en isoleren.

De restrictiedigestiemethode is uitgelegd in ons vorige artikel: Wat is restrictiedigestie?

In de polymerase kettingreactie, met behulp van de informatie van de gensequentie, wordt het gen van interesse of het kandidaat-gen in de thermocycler geamplificeerd.

De machine maakt met behulp van de polymerase-kettingreactie miljoenen kopieën van een gen van onze interesse. Door het proces van agarose gelelektroforese wordt het geamplificeerde gen geïsoleerd.

Als het gen van onze interesse eerder goed is bestudeerd, dan is de informatie van een gen toegankelijk in de genetische bibliotheek en kunnen we het gebruiken voor de kunstmatige synthese van een gen van onze interesse. (Met behulp van de informatie uit de genetische bibliotheek kan het gen ook kunstmatig worden gesynthetiseerd)

In de volgende stap voert u, indien nodig, de DNA-zuivering uit. Nu is ons DNA klaar om in een plasmide te worden ingebracht.

Selectie en bouw van plasmide:

De selectie van het plasmide voor het gentechnologisch experiment is een van de cruciale stappen in het hele experiment. Voordat we de plasmide selecteren, moeten we begrijpen waarom de plasmide wordt gebruikt in de genoverdrachtsexperimenten.

Het plasmide-DNA is een cirkelvormig, dubbelstrengs cytoplasmatisch DNA van de bacteriën dat zich onafhankelijk repliceert.

Wetenschappers gebruiken het als een voertuig voor het overbrengen van het gen van belang naar de doellocatie in het genoom. Het kan het gen efficiënt op de doellocatie overbrengen. De structuur van plasmide wordt uitgelegd in de onderstaande figuur,

Gerelateerd artikel: Wat is een plasmide?

Preparatie van plasmide:

Selecteer de plasmide die bij uw experiment past.

De plasmide moet de replicatieoorsprong, het promotorgebied, het antibiotica-resistentiegen en andere belangrijke sequenties bevatten. Met behulp van de restrictiedigestiemethode wordt een insertieplaats in het plasmide ingebracht waarop ons gen van belang wordt geligeerd.

Met behulp van het T4 DNA-ligase als power sealer wordt het DNA van onze interesse ingebracht en in het plasmide geligeerd. Samen met het plasmide wordt ook een selecteerbare merker in het plasmide DNA ingebracht om het recombinant-DNA te identificeren.

Daarnaast worden in het plasmide ook een promotorgebied en terminatorsequenties opgenomen voor de effectieve expressie van een gen van onze interesse. Een plasmide met ons gen van belang en enkele andere belangrijke sequenties wordt nu aangeduid als een recombinant DNA-molecuul.

Nu is ons recombinant-DNA klaar voor de expressie.

Als we genklonering uitvoeren, wordt de plasmide in de bacteriële gastheer ingebracht, waarvoor over het algemeen E.Coli wordt gebruikt. Zodra de bacterie zich begint te delen, wordt ons recombinant plasmide-DNA ook mee gerepliceerd.

Nu hebben we de meervoudige kopieën van ons plasmide-DNA, die worden geëxtraheerd met de plasmide-DNA-extractiekit en gebruikt voor de transformatie-experimenten.

Transformatie in het gastheergenoom:

Het overbrengen van het recombinant-DNA in de ontvangende cel of het gastgenoom is nog een vervelende en moeilijke taak. Verschillende methoden voor het inbrengen van recombinant-DNA worden gebruikt voor verschillende celtypes, omdat één enkele methode niet voor alle celtypes kan worden gebruikt.

Diverse methoden voor transformatie:

Gebruik van stress- bacteriën gemakkelijk opnemen van de plasmide DNA met behulp van een aantal stressfactoren, zoals warmte of elektrische sok.

Micro-injectie- een scherpe naald wordt gebruikt om DNA rechtstreeks in de kern van een cel in te brengen, maar de methode is minder effectief en vereist een hogere mate van deskundigheid daarvoor.

Electroporatie- een van de beste methoden met een groot succespercentage is de elektroforese-methode waarbij het recombinant-DNA in het genoom van de gastheer wordt ingebracht door de cel met elektrische stroom te permeabiliseren.

We hebben er een heel artikel aan gewijd. Lees het hier: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonication- sonication is nog een andere goede methode die soms wordt gebruikt in het genoverdrachtsexperiment waarbij het recombinant-DNA in de doelcel wordt ingebracht met behulp van ultrasone golven. De ultrasone golven verhogen ook de permeabiliteit van de cellen.

Liposoom gemedieerde genoverdracht- Met behulp van een kunstmatige cel-achtige buitenmantel bekend als een liposoom- kan recombinant DNA worden ingebracht in het genoom van de gastheer.

Genoverdracht met behulp van bacteriële infectie- Deze methode is een van de populaire methoden en wordt routinematig gebruikt bij gentechnologische experimenten met planten. Hier wordt de plantensoort geïnfecteerd met de getransformeerde bacterie voor het inbrengen van een gen van belang.

Agrobacterium tumifecian wordt gebruikt om recombinant-DNA in de plantencel in te brengen. Een gen van belang wordt ingebracht in het Ti-plasmide van de Agrobacterium. De plantencellen worden geïnfecteerd door deze bacteriecelcultuur en de getransformeerde cellen worden geregenereerd met behulp van de plantweefselkweekmethoden.

Chemical in gene transfer- Sommige metaalionen, chemicaliën, en oplossingen van verschillende chemicaliën worden ook gebruikt in de genoverdracht experimenten, maar het slagingspercentage is te laag in vergelijking met de andere methoden.

Bevestiging van insert:

Ons werk is nog niet af.

Nu moeten we bevestigen of het recombinant-DNA al dan niet in onze doelcel is ingebracht. Daarvoor worden verschillende moleculair genetische technologieën gebruikt. Bij de traditionele kweekmethode wordt de aan- of afwezigheid van een selecteerbare merker gebruikt om getransformeerde cellen te onderscheiden van de niet-getransformeerde cellen.

Hoewel dit niet nodig is voor de op PCR gebaseerde detectiemethode. De op polymerase-kettingreactie gebaseerde detectiemethode wordt algemeen aanvaard, meer vertrouwd dan andere methoden.

DNA wordt geëxtraheerd uit de getransformeerde cel en geamplificeerd met behulp van de primers die complementair zijn aan ons gen van belang of ons recombinant-DNA.

Als het recombinant-DNA aanwezig is, wordt het zeker geamplificeerd, anders wordt geen amplificatie verkregen. Voor de conformatie met twee factoren wordt één primerset complementair aan het recombinant-DNA-specifiek en één primerset complementair aan de selecteerbare merkersequentie genomen en multiplex PCR uitgevoerd.

Voor de validatie van de resultaten moet in beide reacties amplificatie worden verkregen.

Maar wacht eens even!

Wat gebeurt er als er tijdens het experiment een mutatie optreedt in ons gen van belang? Omdat de PCR alleen het DNA kan amplificeren. We moeten sequentie-informatie hebben om de mutatie op te sporen.

Daarvoor wordt de DNA-sequencing methode gebruikt.

DNA wordt uit de getransformeerde cellen geëxtraheerd en het gen van interesse wordt geamplificeerd met de PCR. Nu worden de PCR-amplicons gebruikt voor DNA-sequencing, waarbij met behulp van de fluorescerende chemie de sequentie van ons gen van belang ordelijk wordt bepaald.

Als aan alle parameters voor het bepalen van het gen van interesse is voldaan, zijn onze cellen nu klaar om te worden geïnjecteerd in het gastheerorganisme of voor weefselkweek experimenten.

Toepassingen van genetische manipulatie:

Nu komen we bij het belangrijke punt van dit onderwerp, “Waar wordt genetische manipulatie voor gebruikt?”

Genetische manipulatie heeft grote industriële en agrarische waarde. Het wordt beoefend in de geneeskunde, genetisch onderzoek, landbouw, gewasverbetering, en voor de produktie van therapeutische geneesmiddelen.

Zij wordt ook gebruikt bij de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde organismen. Hier bespreken we enkele van de belangrijke toepassingen van genetische manipulatie.

De recombinant-DNA-technologie wordt gebruikt bij de verbetering van gewassen en de ontwikkeling van nieuwe economisch belangrijke eigenschappen. Enkele daarvan zijn:

• resistentie tegen herbiciden
• resistentie tegen virussen
• vertraagde rijping van vruchten
• veranderd oliegehalte
• pollenbeheersing
• ontwikkeling van koude- en droogtetolerante plantensoorten.

Een klassiek voorbeeld is het BT-katoen – een van de soorten genetisch gemodificeerde soorten biedt de plant resistentie tegen bacillus thuringiensis.

Proces van de ontwikkeling van genetisch gemodificeerde plantensoorten:

Een gen van belang wordt geïsoleerd uit het organisme met behulp van restrictiedigestie of geamplificeerd door de polymerase-kettingreactie. Recombinant-DNA wordt geconstrueerd door een gen van belang in het plasmide in te brengen, hier wordt het T-plasmide gebruikt.

In de volgende stap wordt het T- plasmide in de agrobacterium ingebracht. In de laatste stap wordt de plantensoort geïnfecteerd met de getransformeerde bacteriecellen en gekweekt. Het hele proces is weergegeven in de onderstaande figuur,

GMF- genetisch gemodificeerd voedsel is een andere beste toepassing van genetische manipulatie waarbij economisch belangrijke voedingsmiddelen worden geconstrueerd met behulp van recombinant-DNA-technologie.

Het klassieke voorbeeld hiervan is Flavr Savr-tomaat, een genetisch gemodificeerde tomatensoort die is vervaardigd met behulp van de antisense RNA-technologie. Het heeft grote economische waarden omdat de GM-tomaat gemakkelijk van de ene plaats naar de andere kan worden vervoerd.

Een andere belangrijke toepassing van genetische manipulatie is genetisch gemodificeerd of genetisch gemanipuleerd voedsel.

De kwaliteit van sommige voedingsmiddelen zoals katoen, maïs en sojabonen wordt verbeterd met behulp van de huidige recombinant-DNA-technologie. Het doel van het ontwikkelen van genetisch gemodificeerde gewassen of plantensoorten is om ze economisch belangrijk, voedzaam, eiwitrijk, ziekte- en stressbestendig te maken.

Zelfs, met behulp van genetische manipulatie en weefselkweek technieken insecticiden resistentie plantensoorten in tabak, aardappel, maïs, en katoen worden ontwikkeld.

Daarnaast kunnen met de huidige genetische modificatietechniek ook enkele gemodificeerde planten worden gemaakt die in staat zijn hun eigen meststoffen te genereren.

Transgene modelorganismen worden ontwikkeld om verschillende parameters te testen – de functie van bepaalde genen kan worden bepaald door het ontwerpen van de transgene micro-organisme en dierlijke modellen.

schadelijke ziekteverwekkers en insectenverdelgers kunnen worden vernietigd met behulp van genetisch gemodificeerde micro-organismen die in staat zijn toxische stoffen af te breken.

Medicinale toepassingen:

Lage kosten geneesmiddelen, hormonen, enzymen en vaccins worden gecreëerd met behulp van genetische manipulatie-instrumenten.

De anti-bloedstollingsfactor is hiervan het beste voorbeeld, waarbij het plasminogeen activerende enzym, dat in staat is de bloedstolsel op te lossen, kunstmatig wordt ontworpen en gebruikt bij de patiënten met coronaire hartziekte of hartaanval.

Andere voorbeelden zijn twee andere therapeutische proteïnen somatostatine en lymfokines die tegen verschillende ziektebeelden werken en kunstmatig kunnen worden gesynthetiseerd. Insuline is nog een klassiek voorbeeld van een therapeutisch eiwit dat met behulp van gentechnologie is ontworpen.

Een gen voor insuline wordt geïsoleerd door restrictiedigestie of door PCR en in het plasmide ingebracht. Het recombinant-plasmide-DNA wordt onmiddellijk ingebracht in de bacterie- of gistcel waarin het plasmide zich vermenigvuldigt. Wanneer het micro-organisme zich begint te delen, begint het kunstmatige insuline te maken.

Een grote hoeveelheid insuline wordt met dezelfde techniek op industriële schaal geproduceerd. Het gedetailleerde schema van de insulineproductie is weergegeven in de onderstaande figuur,

De commerciële productie van insuline begon na de goedkeuring van de FDA in 1982.

Recombinante vaccins:

Vaccins tegen pokken, herpes simplex virus en hepatitis worden geproduceerd met behulp van de gentechniek. De vaccins zijn de geïnactiveerde virale deeltjes die worden gebruikt om een immuunrespons tegen die ziekteverwekker op te wekken, maar de kans op besmetting is daarbij groot.

Wetenschappers hebben met behulp van de recombinant-DNA-technologie een uniek type vaccin gecreëerd dat alleen het DNA voor de virale manteleiwitten bevat, zodat de ziekteverwekker nooit meer kan worden geactiveerd. Het belangrijkste voordeel hiervan is dat het veiliger, besmettingsvrij en reactiever is.

Genetische manipulatie in gentherapie:

Met de gentherapie- of genoverdrachttechniek kunnen erfelijke genetische aandoeningen worden genezen. Cystic fibrosis, Duchenne spierdystrofie en sikkelcelanemie-achtige gentherapieën bevinden zich thans in de laatste fase van de klinische proeven en zijn klaar om op patiënten te worden toegepast.

In de gentherapie wordt een defect, niet-functionerend of gemuteerd gen vervangen door het wildtype met behulp van dezelfde techniek als hierboven uitgelegd.

We hebben geweldige artikelen over gentherapie behandeld, lees het hier:

1. Gentherapie: Soorten, Vectoren , Proces, Toepassingen en Beperkingen.
2. Wat is gentherapie? en Hoe werkt het?
3. Naked DNA Mediated Gene Therapy
4. Sleeping Beauty Transposon System: The Future of Gene Therapy

Daarnaast wordt de genetische manipulatie technologie ook gebruikt bij de productie van biobrandstof, ziekte, bio alcohol en andere essentiële producten.

Beperkingen van genetische manipulatie:

Er zijn ethische kwesties verbonden aan het gebruik van gentherapie en genetisch gemanipuleerde producten.

Ook komen de voedingswaarden in het gedrang om een economische waarde aan het voedingsmiddel of een genetisch gemanipuleerd product te geven.

Door het nadelige effect ervan evolueren nieuwe resistente pathogene stammen sneller.

Ook de bijwerkingen van gentherapie en het gebruik van virussen daarbij zijn schadelijk voor het doelorganisme.

De technologie is duurder aangezien gentherapie tot 50.000 USD kost.

Conclusie:

Het spelen met het embryo of de foetus is tegen de natuurwet, mensen geloven er sterk in, dus genetisch gemodificeerd voedsel en plantaardige producten worden altijd een middelpunt van controverse.

Met behulp van genetische manipulatiemiddelen zoals gentherapie en genoverdracht kunnen echter erfelijke aandoeningen en kankerachtige dodelijke ziekten worden voorkomen. Positief gebruik van genetische manipulatie technieken kan veranderen het lot van de mensheid.

Bronnen:

1. National Research Council (VS) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Safety of Genetically Engineered Foods: Approaches to Assessing Unintended Health Effects. Washington (DC): National Academies Press (VS); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. Beginselen van genmanipulatie. Een inleiding tot genetische manipulatie. Studies in microbiologie. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.