De zoogdieren geslachtschromosomen hebben gespecialiseerde rollen in mannelijke (XY) en vrouwelijke (XX) kiemcelontwikkeling (1). Geslachtschromosoomafwijkingen zijn de meest voorkomende genetische oorzaak van onvruchtbaarheid bij de mens (2). Bij de geslachtschromosoomtrisomieën (SCT’s) Klinefelter (XXY) en dubbel Y (XYY) syndroom is de spermatogenese verstoord door respectievelijk een teveel aan X- en Y-genen (2). XYY-mannen zijn meestal vruchtbaar door spontaan verlies van het extra geslachtschromosoom (mozaïcisme). Bij XXY-mannen komt mozaïcisme minder vaak voor. Het terughalen van testiculair sperma heeft bij sommige jonge Klinefelter-mannen voortplanting mogelijk gemaakt, maar is minder succesvol bij oudere patiënten (3, 4). XXY en XYY individuen zonder XY kiemcellen zijn onvruchtbaar.

Om SCT onvruchtbaarheid te bestuderen, genereerden we volwassen XXY en XYY muizen die de fluorescerende reporter transgenen Blimp1-mVenus (BV) en Stella-ECFP (SC) (5) dragen om de differentiatie van pluripotente stamcellen in primordiale kiemcel-achtige cellen (PGCLCs) (6) te volgen. XXY mannetjes werden gecreëerd door het paren van een wild-type vrouwtje met een geslachtschromosoom variant mannetje dat XY-bevattend sperma produceert (fig. S1). Generatie van XYY muizen vereist overerving van een Y-chromosoom van beide ouders. Daarom gebruikten we een vaderlijk overgeërfd wild-type Y-chromosoom en een maternaal overgeërfd Yd1 chromosoom dat niet de testis-determinant Sry (fig. S1) (7) tot expressie brengt. Zoals eerder aangetoond (8, 9), het spermatogenese fenotype in beide modellen recapituleerde dat in SCT mannen, met arrestatie in de prospermatogonial stadium in XXY muizen en op pachynema in XYY muizen (fig. S2). Spermatogenese was normaal in euploïde XY BVSC transgene broers en zussen.

Volgende, we fibroblasten van SCT en controle XY en XX muizen (Fig. 1A). DNA-fluorescentie in situ hybridisatie (DNA-FISH) voor het X-gen Slx en Y-gen Sly bevestigde dat passage 4 (P4) SCT en controle fibroblasten hadden hun oorspronkelijke geslachtschromosoom complementen behouden (Fig. 1B en fig. S3A). Fibroblasten werden geherprogrammeerd tot geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) (10) in een doxycycline (Dox)-induceerbare wijze. DNA-FISH werd uitgevoerd in resulterende P2 iPSCs (Fig. 1A).

Een groot deel van de SCT-afgeleide iPSC lijnen vertoonden geslachtschromosoom verlies. Van XXY muizen, zagen we XY, XX, en XO iPSCs (Fig. 1, C en E). De incidentie van het verlies was vergelijkbaar voor de X-en Y-chromosomen (P = 0,062, Mann-Whitney test). Van XYY muizen, zagen we XY en XO iPSCs (Fig. 1, D en E). Y-chromosoom verlies in XYY mannetjes trad op met een vergelijkbare frequentie als die waargenomen voor het X-en Y-chromosoom gecombineerd in XXY mannetjes (P = 0,089, Mann-Whitney test). We vergeleken vervolgens de incidentie van geslachtschromosoom verlies tussen SCT-afgeleide en euploïde XY-en XX-afgeleide iPSCs. Geslachtschromosoom verlies kwam vaker voor in SCT- dan euploïde afgeleide iPSCs (Fig. 1E), ongeacht de cutoff gebruikt om geslachtschromosoom verlies (fig. S12D) definiëren.

Geslachtschromosoom verlies zou kunnen optreden tijdens de herprogrammering van SCT-cellen of tijdens iPSC vermeerdering tot P2, misschien verlenen van een proliferatieve voordeel aan de resulterende euploïde cellen. Inderdaad, geslachtschromosoom instabiliteit is waargenomen in pluripotente stamcellen (11, 12). Om de laatste hypothese te testen, analyseerden we geslachtschromosoom stabiliteit tussen P2 en P6 in iPSCs met zeer ouderlijke (>90%) aanvullingen (fig. S4A). We zagen geslachtschromosoom verlies in XX en XXY iPSC lijnen (P < 0,01 en 0,05, respectievelijk; Wilcoxon signed-rank test), maar niet in XY en XYY iPSC lijnen (P = 0,21 en 0,66, respectievelijk; Wilcoxon signed-rank test). Echter, geen iPSC lijn vertoonde meer dan een 15% afname in ouderlijk complement (fig. S4B). Bovendien, geslachtschromosoom verlies tussen P2 en P6 was niet trisomie-biased (fig. S4B). SCT-afgeleide euploïde XY iPSCs vertoonden ook geen proliferatieve voordeel ten opzichte van XXY of XYY iPSCs (fig. S5). Omdat SCT fibroblasten waren ook karyotypisch stabiel (Fig. 1B en fig. S3A), is chromosoom verlies waarschijnlijk geïnduceerd tijdens iPSC herprogrammering en is dus verschillend van geslachtschromosoom instabiliteit in pluripotente stamcellen (11, 12). We verwijzen naar het fenomeen als trisomie-biased chromosoom verlies (TCL).

Vervolgens hebben we bepaald of euploïde XY iPSCs afgeleid van SCT fibroblasten zou vormen functioneel sperma. We selecteerden zeer euploïde (≥80% van de cellen XY) P6 iPSCs aangepast aan Dox-vrij medium (fig. S6). Voor onze XYY experimenten, alleen XY iPSC lijnen die de wild-type Y in plaats van de Yd1 chromosoom behouden werden gebruikt voor PGCLC experimenten (fig. S7). Karyotypering bevestigd dat alle SCT-afgeleide XY iPSC lijnen en een controle XY iPSC lijn waren euploïde (fig. S8). Deze iPSC lijnen werden gedifferentieerd (6) door middel van een epiblast-achtige toestand PGCLC aggregaten positief voor BV en SC (Fig. 2A) te creëren. BV-positieve PGCLC’s (tabel S1) werden geïsoleerd door fluorescentie-geactiveerde celsortering (FACS) (Fig. 2B) en getransplanteerd in kiemcel deficiënte W/Wv (Kit mutant) testes (13).

Spermatogenese in ontvangers werd geëvalueerd 9 tot 10 weken na transplantatie. Teratomen, die worden waargenomen na iPSC-afgeleide PGCLC transplantatie (6), waren aanwezig in 29% van XXY-afgeleide en 50% van XYY-afgeleide getransplanteerde lijnen (fig. S9). Reconstitutie van spermatogenese, onthuld door de aanwezigheid van spermatogene kolonies (Fig. 2C) en door histologie (Fig. 2D), werd waargenomen voor alle XXY-en XYY-afgeleide iPSC lijnen gebruikt (tabel 1). Dus, SCT-afgeleide XY iPSCs kunnen differentiëren tot kiemcellen in vitro en volledige spermatogenese na transplantatie.

We vroegen ons af of sperma, gecreëerd via transplantatie, de voortplanting kon ondersteunen. Intracytoplasmatische sperma injectie (ICSI) met behulp van sperma van twee XXY- en twee XYY-afgeleide XY iPSC lijnen (Fig. 2E en fig. S10A) gegenereerd zygotes die ontwikkeld tot twee-cel embryo’s in vitro (efficiëntie 76.7 tot 87,3%) (Fig. 2F, fig. S10B, en tabel S2) en grosso modo normale nakomelingen wanneer getransplanteerd in ontvangers (efficiëntie 46,9 tot 59,4%) (Fig. 2G, fig. S10C, en tabel S2). Polymerase kettingreactie genotypering bevestigde dat de nakomelingen afkomstig waren van de getransplanteerde PGCLC’s (fig. S10D). Pups van XXY- en XYY-afgeleide iPSC lijnen vertoonden een vergelijkbare groei als die afgeleid van controle XY iPSCs (fig. S10E). Met name de XXY- en XYY-afgeleide pups hadden euploïde (XY of XX) complementen (fig. S11). Drie volwassen mannetjes en drie vrouwtjes van elke XXY-en XYY-afgeleide iPSC lijn werden gepaard met elkaar, en alle waren vruchtbaar (fig. 2H en fig. S10F). Dus, sperma van SCT-afgeleide XY iPSCs geven aanleiding tot chromosomaal normale, gezonde en vruchtbare nakomelingen.

We onderzochten of TCL specifiek is voor trisomie van geslachtschromosomen. Omdat muismodellen met trisomie voor een volledig autosoom niet beschikbaar zijn (14), herhaalden we onze experimenten in mannelijke Tc1 transchromosomische muizen, een Down-syndromiemodel met een bijkomend menselijk chromosoom 21 (hChr.21) (15). Tc1 muizen dragen een hChr.21-geïntegeerde neomycine resistentie cassette, selectie voor die hChr.21 mozaïcisme vermindert (15). Daarom verrijkten we eerst volwassen Tc1 fibroblasten voor de aanwezigheid van hChr.21 met behulp van het neomycine-analoog G418 (Fig. 3A). DNA-FISH bleek dat de overgrote meerderheid (≥96%) van Tc1 fibroblasten behouden hChr.21 (Fig. 3B en fig. S3B). Deze Tc1 fibroblasten werden geherprogrammeerd zonder G418 selectie, en de resulterende iPSCs werden geanalyseerd op P2. Tien van de 16 iPSC lijnen die werden gegenereerd (62,5%) toonde verlies van hChr.21 in ≥10% van de cellen (Fig. 3, C en D, en fig. S12D). In tegenstelling, na G418 verwijdering, hChr21 werd behouden in Tc1 fibroblasten gekweekt voor dezelfde periode als die gebruikt voor iPSC herprogrammering (18 dagen) en in P6 iPSC lijnen die zeer ouderlijke (>90% hChr.21 positief) complementen had op P2 (fig. S12, A en B). We concluderen dat het verlies van hChr.21 in Tc1 cellen wordt bevorderd door herprogrammering in plaats van G418 verwijdering en dus dat TCL ook een accessoire chromosome.

We vroegen ons vervolgens af of TCL in menselijke cellen voorkomt. Gevallen van chromosoom verlies zijn waargenomen tijdens de menselijke trisomic celcultuur (16, 17), maar de prevalentie en de relatie tot herprogrammering is niet systematisch geanalyseerd. We selecteerden menselijke Klinefelter syndroom, het syndroom van Down, en euploïde XY en XX fibroblast lijnen vertonen minimale mozaïcisme (fig. S13, A en D), geherprogrammeerd hen, en bepaalde de chromosoom complementen van de resulterende iPSC lijnen. We zagen XY en XX iPSCs van Klinefelter syndroom fibroblasten en euploïde iPSCs van het syndroom van Down fibroblasten (fig. S13, B, C, F, en G). Chromosoom verlies kwam vaker voor in trisomic dan in disomic cellen, waaruit blijkt dat TCL ook optreedt tijdens de menselijke herprogrammering. Echter, de frequentie van zeer euploïde iPSC lijnen was lager dan die waargenomen in trisomie-afgeleide muis iPSCs (fig. S13, F tot H).

We hebben aangetoond dat TCL euploïde iPSCs van SCT en autosomaal trisomic muizen en patiënten (fig. S12E) produceert. Bij muizen kunnen de resulterende “gecorrigeerde” iPSC’s functioneel sperma vormen, waardoor de productie van chromosomaal euploïde nakomelingen van onvruchtbare SCT individuen mogelijk wordt. TCL is een aanvulling op bestaande iPSC-therapieën voor chromosoomafwijkingen (17-21). De mechanismen die TCL veroorzaken zijn onbekend. Cellulaire stress geassocieerd met herprogrammering kan selecteren tegen trisomic cellen, waardoor het ontstaan van euploïde cellen. We zagen minder vaak TCL in menselijke dan in muizen cellen (figs. S12D en S13H). Zelfs indien zeldzaam, zouden TCL behandelingen kunnen bieden voor onvruchtbare SCT patiënten voor wie alternatieve benaderingen niet succesvol zijn. Het klinisch gebruik van in vitro geproduceerde menselijke geslachtscellen moet echter ethisch en juridisch zorgvuldig worden overwogen (22-24). Bovendien zal volledige in vitro spermatogenese moeten worden ontwikkeld om het risico van teratoomvorming door kiemceltransplantatie te vermijden.

TCL maakt ook de productie mogelijk van vrouwelijke iPSC’s van mannen, wat mogelijkheden biedt voor de genetische dissectie van seksuele dimorfismen (25). Door het creëren van isogene iPSC lijnen die alleen verschillen met betrekking tot hun geslachtschromosomen, kan geslacht verschillen geïdentificeerd tijdens iPSC ziekte modellering worden toegeschreven aan X-of Y-chromosomale effects.