ABSTRACT

Vóór de ligatie moet elk Okazaki fragment, gesynthetiseerd op de achterliggende streng in eukaryoten, nucleolytisch verwerkt worden. Nuclease-splitsing vindt plaats in de context van 5′-flapstructuren die worden gegenereerd via streng-verplaatsingssynthese door DNA polymerase delta. Ten minste drie DNA-nucleasen: Rad27 (Fen1), Dna2, en Exo1, zijn betrokken bij de verwerking van Okazaki fragment flappen. Nochtans zijn noch de bijdragen van individuele nucleasen aan de synthese van laggingstrengen, noch de structuur van de DNA-tussenproducten die in hun afwezigheid gevormd worden, duidelijk in vivo bepaald. Door het conditioneel uitputten van achterblijvende-streng nucleasen en het direct analyseren van Okazaki fragmenten gesynthetiseerd in vivo in S. cerevisiae, voeren we een systematische evaluatie uit van de impact van Rad27, Dna2 en Exo1 op achterblijvende-streng synthese. We stellen vast dat Rad27 de meerderheid van de achterblijvende-streng flappen verwerkt, met een significante extra bijdrage van Exo1 maar niet van Dna2. Wanneer nuclease-splitsing verstoord is, zien we een vermindering van streng-verplaatsing synthese, in tegenstelling tot de wijdverspreide generatie van lange Okazaki fragment 5′ flappen, zoals voorspeld door sommige modellen. Verder, met behulp van celcyclus-beperkte constructen, tonen we aan dat zowel de nucleolytische verwerking als de ligatie van Okazaki fragmenten kan worden losgekoppeld van DNA-replicatie en uitgesteld tot na de synthese van het grootste deel van het genoom is voltooid.