Verbetering van de spermakwaliteit in hypervisceus sperma na behandeling met DNase I
Abstract
Sperma hyperviscositeit schaadt de beweeglijkheid van sperma en kan leiden tot mannelijke onvruchtbaarheid. Deze prospectieve studie had tot doel na te gaan in hoeverre exogeen DNase de kwaliteit van sperma kan verbeteren, rekening houdend met het feit dat DNase is aangetroffen in het zaadplasma van verschillende diersoorten en dat neutrofielen chromatine vrijgeven om bacteriën op te vangen. In totaal werden bij deze analyse zevenenzeventig spermamonsters met hoge spermaviscositeit (HSV) als studiegroep vergeleken met tweeënzestig spermamonsters met normale spermaviscositeit (NSV) als controlegroep. Deze spermamonsters werden verdeeld in drie groepen die werden behandeld (a) met DNase I bij 37°C gedurende 15 min, (b) door centrifugatie met dichtheidsgradiënt, en (c) met een combinatie van de twee bovengenoemde methoden. Na een behandeling van hypervisceus sperma gedurende vijftien minuten nam de beweeglijkheid van spermatozoa in 83% van de spermamonsters toe in een statistisch significante mate. De behandeling met DNase van sperma met een normale viscositeit had daarentegen geen dergelijk effect. Bovengenoemde behandeling ging ook gepaard met een significante stijging van het percentage normale spermatozoa, waardoor de teratozoöspermie-index sterk daalde. Vergelijking van de spermamonsters die een centrifugatie met dichtheidsgradiënt ondergingen na behandeling met DNase I, met die welke alleen een behandeling met dichtheidsgradiënt ondergingen, toonde aan dat in het eerste geval de resultaten spectaculairder waren. De evaluatie van elk preparaat in termen van opbrengst (% totaal progressief beweeglijk sperma na behandeling in verhouding tot het aanvankelijke totale aantal spermacellen) toonde aan dat de gecombineerde aanpak resulteerde in 29,8% versus 18,5% met alleen dichtheidsbehandeling (p=0,0121). DNase I behandeling resulteert in een verbetering van de beweeglijkheid en de morfologie van het sperma en zou gunstig kunnen zijn voor mannen met hypervisceus sperma in geassisteerde voortplantingsprotocollen.
1. Inleiding
Studies hebben gedocumenteerd dat hyperviscositeit van het sperma (SHV) voorkomt in 12-29% van de ejaculaten. SHV is een aandoening die kan leiden tot mannelijke onvruchtbaarheid, omdat het de fysische en chemische kenmerken van de zaadvloeistof ernstig kan aantasten. Het wordt in verband gebracht met een verminderde beweeglijkheid van de zaadcellen, een slecht resultaat bij in-vitrofertilisatie en een verhoogde productie van Reactieve Zuurstofspecies (ROS). Bovendien zijn de niveaus van oxidatieve schadeproducten in de zaadcellen significant gecorreleerd met de viscositeit van de zaadvloeistof bij onvruchtbare mannen.
Er zijn sterke aanwijzingen voor het bestaan van remmende routes die de kwaliteit van het sperma aantasten door de productie van ROS tijdens het transport van het sperma door het mannelijke genitale stelsel, aanwijzingen voor schade aan het sperma tijdens de behandeling en de opslag in het laboratorium, maar ook aanwijzingen voor extra productie van ROS “automatisch” na de ejaculatie, althans in sommige gevallen van seminale hyperviscositeit. Deze aandoening wordt meestal in verband gebracht met mannelijke accessoire geslachtsklierontsteking en varicocele , ook al is de pathofysiologie nog niet volledig begrepen. Bovendien werd een verminderde antioxidantcapaciteit van de zaadvloeistof vastgesteld in oligoasthenozoospermische monsters in gevallen van seminale hyperviscositeit. Bovendien veroorzaken overmatig gegenereerde niveaus van ROS lipide peroxidatie die de membraan morfologie verstoort. De aanwezigheid van verhoogde niveaus van leukocyten in sperma wordt geassocieerd met SHV . Bovendien zijn leukocyten een belangrijke bron van ROS en de vectoren van retrovirussen in sperma , terwijl hun aanwezigheid in verband is gebracht met een verminderde waarschijnlijkheid van conceptie en een lager succespercentage van intra-uteriene inseminatie (IUI) en van conventionele IVF . Bovendien is SHV gecorreleerd met de samenstelling van de seminale microbiota en de hogere prevalentie van pathogene bacteriën.
Er zijn verschillende therapeutische benaderingen voorgesteld om de viscositeit van SHV semen te verminderen. Overhydratatie en prostaatmassage waren niet effectief. Zachte aspiratie en expulsie van het sperma, met een 5 ml spuit, zijn bijna niet effectief omdat SHV geen mechanisch fenomeen is. Proteolyse met behulp van chymotrypsine verbetert de behandeling van hypervisceus sperma, hoewel er enige veranderingen optreden in de sperma-eiwitten. Rekening houdend met het feit dat een dergelijke procedure de spermastructuur kan beschadigen en dat in de meeste gevallen SHV gecorreleerd is met leukocytospermie , stelden wij de hypothese voorop dat SHV veroorzaakt wordt door neutrofiele extracellulaire vallen (NETs) en dat deze gevoelig zijn voor DNA-degradatie via DNase I. Voor zover ons bekend is dit het eerste verslag van het gebruik van DNase I om SHV aan te pakken.
2. Materialen en Methoden
2.1. Deelnemers
Een prospectieve studie werd gedurende 3 jaar uitgevoerd bij patiënten met een voorgeschiedenis van onvruchtbaarheid in de Medische Kliniek van Athene, Locus Medicus, met de volgende exclusiecriteria: varicocele hypogonadisme, cryptorchidisme, en congenitale obstructie van de zaadbuizen. Zevenenzeventig spermamonsters met HSV werden verkregen als de studiegroep en tweeënzestig spermamonsters normaal met NSV werden verkregen als de controlegroep, als volgt gestratificeerd. In eerste instantie werden een set van tweeëndertig HSV-spermmonsters en tien NSV-spermmonsters behandeld met DNase I. Verder werden nog een set van zesentwintig HSV-spermmonsters en tweeënvijftig NSV-spermmonsters verwerkt met behulp van de DGC-methode (density gradient centrifugation). Ten slotte werden negentien HSV-monsters verwerkt door een combinatie van de methoden, d.w.z. een eerste behandeling met DNase I, gevolgd door DGC. Alle deelnemers ondertekenden een geïnformeerde toestemmingsformulieren alvorens enige betrokkenheid.
2.2. Spermanalyse
Spermmonsters, verkregen door masturbatie na seksuele onthouding gedurende 3-5 dagen, werden in steriele containers geplaatst. Na verzameling werden de spermamonsters bij 37°C vloeibaar gemaakt en ondergingen ze vervolgens een conventionele analyse van de referentiegrenzen voor spermaanalyse, voor en na het hierboven beschreven gecombineerde proces]. De beweeglijkheid werd beoordeeld door dezelfde officieel opgeleide (ESHRE) bioloog, die niet bij de studie betrokken is. De aanwezigheid van witte bloedcellen (WBC) werd beoordeeld met een peroxidasetest (Leukoscreen FertiPro; België) volgens de richtlijnen van de WHO van 2010. Hoewel de viscositeit met een kwantitatieve viscosimeter kon worden beoordeeld, werd de visco-elasticiteit van het sperma geschat door plastic wegwerppipetten te gebruiken waarin het sperma door de zwaartekracht kon vallen en door de lengte van een eventuele draad te observeren. Mannen van wie het sperma een draadlengte heeft tussen 2cm en 4cm worden geclassificeerd met milde SHV (53.12%); een draadlengte tussen 4cm en 6cm (40.62%) wordt gelabeld als matige SHV; en een draadlengte van meer dan 6cm wordt gediagnosticeerd als ernstige SHV (6.25%) werden opgenomen in hoge viscositeit groep (HV), terwijl visco-elasticiteit als normaal werd beschouwd wanneer de draadlengte 2cm of minder was. Behandeling met Enzym
Het effect van DNase I werd geëvalueerd in normale en hoogviskeuze spermamonsters. Na het vloeibaar maken werd DNase I voorzichtig in de steriele container met het spermamonster getrokken tot een eindconcentratie van 20 U/ml en constant gemengd, gevolgd door incubatie bij 37°C gedurende 15 tot 60 minuten. De beweeglijkheid en de morfologie van bovengenoemde spermamonsters werden vóór en na de enzymatische ontsluiting geanalyseerd en het % PR (beweeglijkheid van (a+b) % van het totale aantal spermatozoa) spermatozoa vóór elke behandeling werd beoordeeld (d.w.z. initieel % PR).
2.4. Semen Preparation
Density gradient centrifugation (DGC) method was done according to manufacturer’s recommendations. De dichtheidsgradiënt wordt bereid door in een conische centrifugebuis van 15 ml 1 ml 40% medium over het 80% medium PureSperm® (Nidacon International, Gothenburg, Zweden) te leggen. Sperma werd op de top van de gradiënt aangebracht en gedurende 20 minuten bij 300 g gecentrifugeerd. De mate en de kracht van centrifugeren kunnen worden gevarieerd afhankelijk van de kwaliteit van het monster: de centrifugatietijd kan bijvoorbeeld worden verlengd voor monsters met een hoge viscositeit. Na het centrifugeren moet het grootste deel van het supernatans voorzichtig worden verwijderd en moet de pellet in een nieuw, schoon buisje worden gedaan en goed worden geresuspendeerd in 5 ml medium om het medium voor de dichtheidsgradiënt te verwijderen. Vervolgens wordt het gedurende 10 minuten bij 200 g gecentrifugeerd, wordt het supernatant verwijderd en wordt de uiteindelijke pellet geresuspendeerd in het steriele medium voor geassisteerde voortplantingstechnologieën (ART). Ten slotte werden bij een combinatorische behandeling monsters met een hoge viscositeit eerst behandeld met DNase I en vervolgens geprepareerd met de hierboven beschreven DGC-methode. Concentratie, beweeglijkheid en morfologie voor en na de bereiding werden bepaald.
In aanmerking nemend dat het totaal aantal progressief beweeglijke zaadcellen (TPMSC) na het wassen nuttig zou kunnen zijn voor het voorspellen van de doeltreffendheid van intra-uteriene inseminatie, werd de opbrengst van elke methode ook als volgt geëvalueerd: het percentage TPMSC na behandeling met de DGC-bereiding of DNase I of met de gecombineerde DNase I-behandeling gevolgd door DGC-bereiding werd gedeeld door het aantal totale spermatozoa vóór de behandeling. Bovendien werd het resultaat van de opbrengst (d.w.z. % eind-PR/totaal spermatozoa vóór) vergeleken met het % begin-PR/totaal spermatozoa vóór elke behandeling. De opbrengst werd beoordeeld in spermamonsters met een hoge of normale viscositeit. Hoewel er geen consensus bestaat over het aantal toegediende beweeglijke spermatozoa in ART, wordt algemeen aanvaard dat het terugwinnen van het maximum aantal beweeglijke spermatozoa van elk spermamonster na elke behandeling van groot belang is.
2.5. Statistische analyse
De gegevens werden geanalyseerd door middel van een eenzijdige ANOVA gevolgd door een meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test met behulp van de GraphPad Prism 6.0. Een p-waarde kleiner dan 0,05 werd beschouwd als statistisch significant.
3. Resultaten
De concentratie van witte bloedcellen (WBC) wordt getoond in figuur 1. Er is een statistisch significant verschil tussen alle groepen (p=0,0238 one-way ANOVA). Bovendien is het statistische verschil binnen de HV-groep 0,0018.
Concentratie van WBC (106/ml) in overeenstemming met de draadlengte van viscositeit (mild, matig, en ernstig) als de HV-groep; w/o V: sperma zonder viscositeit.
Het gebruik van DNase I verhoogt de beweeglijkheid van spermatozoa bij mannen (32 proefpersonen) met een hoge viscositeit. Zoals figuur 2(a) laat zien, verbetert de toevoeging van het enzym gedurende vijftien minuten (t=15) het percentage van (a) beweging van 2,875% spermatozoa tot 8,094% spermatozoa onmiddellijk na het vloeibaar maken (t=0), hetgeen statistisch significant is (p=0,049, meervoudige vergelijkingstest). Bovendien steeg de PR-beweging tussen dezelfde tijdstippen van 27,468% tot een statistisch significante 46,59% (p<0,0001, meervoudige vergelijkingstest). Tegelijkertijd daalde de motiliteit van de (c)-fractie van 34,687% (t=0) tot 21,5% (t=15) (p<0,0001, meervoudige vergelijkingstest) terwijl de motiliteit van de (d)-fractie daalde van 37,812% (t=0) tot 31,968% (t=15) (p=0,45 meervoudige vergelijkingstest). Het gebruik van DNase I in sperma met een normale viscositeit verhoogt de beweeglijkheid van de spermatozoa niet op statistisch significante wijze, in geen enkel monster, zoals blijkt uit figuur 2(b).
(a)
(b)
(a)
(b)
Effecten van DNase I op de beweeglijkheid van sperma na 15 min incubatie met DNase I. DNase I verbetert de PR-beweging op statistisch significante wijze in hypervisceus sperma (a), maar heeft geen effect in sperma met normale viscositeit (b). w/o: sperma zonder behandeling, behandeld: sperma behandeld met DNase I, a: snel progressieve spermatozoa, b: langzaam progressieve spermatozoa, c: niet-progressief, d: immotiel, en PR: beweeglijkheid van (a+b).
Door de incubatie nog eens vijftien minuten voort te zetten (bij 21 van de 32 proefpersonen) (voor een totale tijd van dertig minuten, t=30) steeg de beweeglijkheid van een fractie van de spermatozoa van 1,761% (t=0) tot 9,524% (t=30) (p=0,046, meervoudige vergelijkingstest), zoals blijkt uit figuur 3. De beweeglijkheid van de spermatozoa nam toe van 1,761% (t=0) bij 21 van de 32 proefpersonen (t=30) tot 1,524% (t=30). Interessant is dat de PR-beweging drastisch verbeterde van 24% (t=0) tot 45,047% (t=30) (p<0,0001, meervoudige vergelijkingstest) van de spermatozoa. De beweeglijkheid van de (c) en (d) fractie van spermatozoa daalde op een statistisch significante manier van 35,714% naar 22,08% (p=0,001, meervoudige vergelijkingstest) en van 40,238% naar 32,238% (p=0,039, meervoudige vergelijkingstest), respectievelijk. Herbeoordeling van de viscositeit van sperma na DNase I-behandeling toonde aan dat in de meeste gevallen de viscositeit was genormaliseerd of ten minste verbeterd.
Effecten van DNase I op de beweeglijkheid van hypervisceus sperma na 30 min incubatie met DNase I. DNase I verbetert de beweeglijkheid op statistisch significante wijze in hypervisceus sperma, maar op een minder spectaculaire wijze dan vijftien minuten incubatie. w/o: sperma zonder behandeling, behandeld: sperma behandeld met DNase I, a: snel progressieve spermatozoa, c: niet-progressief, d: immotiel, en PR: motiliteit van (a+b).
Wij vergeleken vervolgens de resultaten van sperma dat na DNase I-behandeling een centrifugatie met dichtheidsgradiënt onderging, met die welke werden gevonden na de behandeling met alleen dichtheidsgradiënt. Wegens monsterbeperkingen werden de twee procedures niet toegepast op monsters van dezelfde proefpersonen, maar op specimens van verschillende proefpersonen waarvan de spermaviscositeit hoog was. De centrifugebehandeling met de dichtheidsgradiënt werd ook gebruikt voor intrauteriene inseminatie (IUI). Zoals figuur 4 laat zien, steeg het percentage (a) beweging na centrifugatie met dichtheidsgradiënt na DNase I-behandeling van 3,416% tot 35,083% van de spermatozoa (een 10,27-voudige verbetering), vergeleken met 6,333% tot 26,866% van de spermatozoa (een 4,242-voudige verbetering) in het geval van alleen dichtheidsgradiëntbehandeling (p<0,0001, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test). Wat de (b) beweging betreft, was de verbetering na dichtheidsgradiëntcentrifugatie na DNase I-behandeling ook statistisch significant (van 28,583% tot 40,916% van de spermatozoa (een 1,43-voudige toename), p=0,0112). In de behandelingsgroep met dichtheidsgradiëntcentrifugatie nam de respectieve verbetering toe van 34,533% tot 46,466% van de spermatozoa (een 1,34-voudige verbetering), hoewel het verschil tussen de groepen niet statistisch significant was (ns, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test). Bovendien nam de PR-beweeglijkheid in de eerste groep toe van 32% tot 76% van de spermatozoa (2,375-voudig) in vergelijking met een 1,776-voudige verbetering in de tweede groep (van 40,866% tot 72,666% van de spermatozoa) (niet statistisch significant tussen de groepen, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis-test). De beweeglijkheid van de (c) en (d) fractie van de spermatozoa daalde respectievelijk van 36,083% tot 10,583% en van 31,916% tot 13,583%. De respectieve daling in de groep die alleen met dichtheidsgradiëntcentrifugatie werd behandeld, was van 29,40% tot 14,80% (niet statistisch significant tussen de groepen, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test).
Vergelijking tussen DGC na behandeling met DNase I versus DGC alleen wat de beweeglijkheid van hypervisceus sperma betreft. De combinatiebehandeling had een grotere invloed op de beweging van spermatozoa dan DGC alleen. w/o: sperma zonder behandeling, treated: sperma behandeld met DNase I, a: snel progressieve spermatozoa, b: langzaam progressieve spermatozoa, c: niet-progressief, d: immotiel, en en PR: motiliteit van (a+b).
De na het wassen verkregen TPMSC in verhouding tot het oorspronkelijke aantal (opbrengst) van elk preparaat werd geëvalueerd (M&M). De opbrengst van de dichtheidsgradiëntbehandeling in het geval van een individu zonder spermaviscositeit bedroeg 27,096% (figuur 5, w/o V-d). De opbrengst van hetzelfde preparaat in het geval van individuen met een hoge viscositeit (figuur 5, HV-d) was 18,519%. De verandering in beide gevallen ten opzichte van hun respectieve controle (d.w.z., Figuur 5, w/o V, HV) was statistisch significant (p<0.0001 en p=0.0377, respectievelijk, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test), wat erop wijst dat veel PR spermatozoa verloren gingen na DGC behandeling. Wanneer sperma van individuen met een hoge viscositeit een DNase-behandeling ondergingen (figuur 5, HV-DNase), bedroeg de overeenkomstige opbrengst 42,47%, terwijl de vergelijking tussen dichtheidsgradiëntbehandeling (HV-d) en DNase-behandeling (HV-DNase) resulteerde in een p<0,0001 ten opzichte van de HV-groep, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis-test. Ondanks de omvang van de bovenstaande prestatie, de combinatie van DNase behandeling die wordt gevolgd door dichtheid gradiënt behandeling (figuur 5, HV-DNase-d) resultaten op te leveren 29.782% (p = 0.0121 met betrekking tot HV-groep, meervoudige vergelijking Kruskal-Wallis test). Bovendien werd het gecombineerde preparaat (HV-DNase-d) vergeleken met het % PR-spermatozoa in sperma met hoge viscositeit vóór enige behandeling (figuur 5, HV), en resulteerde in p=0,448 wat betekent dat de meeste PR-spermatozoa werden teruggewonnen. Bovendien, in vergelijking met w/oV-d groep is er geen statistisch significant verschil als p = 0,619 meerdere vergelijking Kruskal-Wallis test.
Evaluatie van het opbrengstpercentage (TPMSC na behandeling/totaal spermatozoa vóór behandeling) van DGC, DNase-behandeling, en de combinatie daarvan, in sperma met een hoge of normale viscositeit. w/oV-d: sperma met normale viscositeit na DGC, HV-d: sperma met hoge viscositeit na DGC, HV-DNase: sperma met hoge viscositeit na DNase-behandeling, en HV-DNase-d: sperma met hoge viscositeit na DNase-behandeling, gevolgd door DGC. w/oV: sperma met normale viscositeit vóór de behandeling; HV: sperma met hoge viscositeit vóór de behandeling.
De beoordeling van de morfologie van spermatozoa na een vijftien minuten durende incubatie met DNase I resulteert in een statistisch significante stijging van het percentage normale spermatozoa van 5,468% tot 7,25%, p=0,0197, zoals geïllustreerd in figuur 6. Tegelijkertijd daalden de kopafwijkingen van 81,75% tot 74,937% (p=0,0004) terwijl de halsafwijkingen daalden van 22,062% tot 19,343% (p=0,0197). Staartafwijkingen en de cytoplasmatische druppel volgen hetzelfde patroon. Als gevolg van deze veranderingen in morfologie, is het redelijk om een grote invloed op de teratozoöspermie-index (TZI) waar te nemen. Zoals figuur 6 laat zien, daalde deze van 1,205 tot 1,084 (p<0,0001).
Vijftien minuten incubatie met DNase I stroomlijnt de morfologie van spermatozoa en de TZI van semen met hoge viscositeit. w/o: sperma zonder behandeling, behandeld: sperma behandeld met DNase I, head abn: afwijkingen aan de kop, tail abn: afwijkingen aan de staart, en TZI: teratozoöspermie-index.
4. Discussie
In deze studie stelden wij de hypothese voorop dat de hyperviscositeit van sperma zijn oorsprong vindt in NET’s. De gepresenteerde gegevens tonen aan dat de vertering van het geëxtrudeerde DNA van NET’s haalbaar is, wat leidt tot verbetering van de beweeglijkheid van spermatozoa. De enzymatische digestie van het DNA van het zaadplasma werd onderzocht met het oog op de verhoging van de beweeglijkheid van spermatozoa, waardoor deze geschikt worden voor gebruik in ART. Het gebruik van DNase I na liquefactie van het sperma resulteerde in verbetering van zowel de beweeglijkheid als de morfologie van de spermatozoa. Er werden verschillende incubatietijdstippen gebruikt om de beste resultaten te bereiken, die na 15 minuten incubatie werden verkregen. Het doel van de studie was de verbetering van het rendement van de intrauteriene inseminatie, in het cohort van subfertiele mannen waarvan het sperma gekenmerkt wordt door een hoge viscositeit die waarschijnlijk te wijten is aan belemmeringen veroorzaakt door geëxtrudeerd DNA. Bovendien verbeterde het gebruik van DNase I de abnormale morfologie die gewoonlijk samengaat met hoge viscositeit. De verrijking van het sperma werd ook geëvalueerd aan de hand van het uiteindelijke aantal geïsoleerde, zowel snel als traag progressieve spermatozoa.
De statistisch significante verbetering van de morfologie van de spermatozoa na behandeling met DNase I kan erop wijzen dat deze afwijkingen zich materialiseren na de ejaculatie en in stand worden gehouden als gevolg van de hoge viscositeit. Aangezien hyperviskeus sperma een verminderde totale antioxidant capaciteit heeft, kan de aanwezigheid van spermatozoa in deze omgeving leiden tot lipide peroxidatie en DNA schade en, uiteindelijk, tot morfologische stoornissen. Ten minste enkele van deze morfologische afwijkingen bleken omkeerbaar te zijn door behandeling met DNase I. Deze verbetering suggereert een optimale toepassing van bovengenoemde behandeling in gevallen waarin er niet zo’n grote vraag is naar een groot aantal direct beweeglijke spermatozoa, zoals in het geval van intra-uteriene inseminatie, maar waarin er vraag is naar de best mogelijke morfologie, zoals het geval is bij IVF of de ICSI-procedure voor bevruchting .
Uw resultaten tonen aan dat toepassing van DNase I alleen effectief is in de aanwezigheid van hyperviscositeit. Zoals figuur 2 (b) laat zien, in de afwezigheid van hyperviscositeit, DNase I gebruik niet. Meer bepaald, bij normale viscositeit en ongeacht de beweeglijkheid van de spermatozoa, resulteerde enzymatische digestie in geen van de onderzochte parameters in een statistisch significant verschil. In het cohort van hyperviskeus sperma daarentegen leidde het gebruik van het enzym tot een statistisch significante verbetering van de PR-motiliteit, zoals blijkt uit figuur 2(a). Bovendien waren er in de HV-groep geen verschillen in motiliteit en morfologisch herstel van de spermatozoa naargelang van de ernstige of matige viscositeit, hoewel het aantal spermamonsters met ernstige viscositeit laag was. Bovendien is, zoals blijkt uit figuur 5, het statistisch significante verschil na DGC-preparatie tussen de groep met hoge viscositeit (HV-d) en de groep met normale viscositeit (w/oV-d) 0,0179, wat erop wijst dat verbetering haalbaar is. Bovendien resulteerde in dezelfde figuur de opbrengst van de gecombineerde behandeling (HV-DNase-d) in het herstel van een percentage PR-spermatozoa, dat het niveau bereikte van de overeenkomstige spermatozoa bij mannen met hoge viscositeit (HV) vóór de behandeling, aangezien het uiteindelijke percentage PR (29,782%, HV-DNase-d) in het eerste geval geen statistisch verschil vertoont met het aanvankelijke PR (26,478%, HV vóór de behandeling), p=0,4480. De betekenis van deze gecombineerde aanpak, hoewel het vermindert opbrengst in vergelijking met DNase behandeling alleen (p<0001 tussen HV-d en HV-DNase), werd gestaafd door het feit dat de dichtheid gradiënt behandeling afgetrokken van herstelde, (c) en (d) klasse spermatozoa tegenhangers, waardoor ze te zuiveren. Daarentegen was het overeenkomstige statistische verschil tussen het rendement van het DGC-preparaat (HV-d, 18,519%) en “HV vóór behandeling” (26,478%) significant (d.w.z., p=0,0322).
Bovendien zou het de mechanische behandeling van hypervisceus sperma kunnen vervangen; zo wordt het gewoonlijk verdund of in een hypodermische naald getrokken en doorgedrukt om de verhoogde viscositeit te overwinnen. Het is echter onwaarschijnlijk dat deze methoden doeltreffend zijn omdat dit soort behandeling de ROS-productie verhoogt. Bovendien is hyperviscositeit negatief gecorreleerd met chromatine integriteit als defecte decondensatie, hetgeen reeds is opgemerkt .
In het algemeen is de toepassing van DNase I in de luchtwegen reeds medisch goedgekeurd door de FDA in het geval van cystic fibrosis . Bovendien is DNase een natuurlijk bestanddeel van het zaadplasma dat waarschijnlijk een rol speelt bij de verdunning van NET’s die in het vrouwelijke voortplantingskanaal worden gevormd na rekrutering van neutrofielen als reactie op een ontsteking, en de voorgestelde procedure is potentieel medisch toepasbaar in ART. De rol ervan wordt ook versterkt door het feit dat de afwezigheid ervan nadelige gevolgen heeft voor de inseminatie bij primaten.
Hyperviscositeit wordt waarschijnlijk veroorzaakt door een ontsteking of door een disfunctie van de zaadklieren, hoewel het exacte mechanisme niet duidelijk is. Het kan geassocieerd worden met virale infecties van de genitale tractus zoals eerder aangetoond door ons labo. Verschillende therapeutische protocollen zijn toegepast om de viscositeit van het sperma te verminderen, maar zelden waren de resultaten bemoedigend. Methoden zoals overhydratatie en prostaatmassage hebben niet de verwachte resultaten opgeleverd. Het gebruik van proteolytische enzymen zoals alfa-chymotrypsine gaf hoopgevende resultaten, maar het gebruik ervan werd niet overgenomen.
In een andere studie werd DNase I gebruikt om de viscositeit te verminderen, maar de eindresultaten waren in dit opzicht niet succesvol. De auteurs bestudeerden geen kwalitatieve spermaparameters, d.w.z. beweeglijkheid. Bovendien was de incubatietijd veel langer (een uur) dan de door ons voorgestelde (vijftien minuten), zodat het neutrale effect op de viscositeit mogelijk kan worden toegeschreven aan de langere incubatie van het enzym met het spermaplasma.
Ten slotte, ondanks de gegevens dat de hyperviscositeit van het sperma is gecorreleerd met ontsteking van het mannelijk genitaal stelsel, d.w.z, zaadblaasjes, wat heeft geleid tot het gebruik van antibiotica en anti-oxidanten, konden deze vormen van therapie deze aandoening alleen behandelen in de gevallen waarin de belangrijkste factor ontsteking was. Gewoonlijk wordt de aandoening veroorzaakt door verschillende factoren die synergetisch werken en daarom bestaat er geen directe oorzakelijke therapie voor hyperviscositeit.
Bij blootstelling aan ontstekingsstimuli oefenen neutrofielen, de belangrijkste leukocytenpopulatie in sperma, hun beschermende rol uit via de inactivering van bacteriën door fagocytose en vervolgens het doden door blootstelling aan proteolytische enzymen en ROS. Een tweede manier waarop neutrofielen ziekteverwekkers kunnen neutraliseren is door de productie van neutrofiele extracellulaire vallen (NET’s). NET’s zijn driedimensionale vezelachtige netwerken, hoofdzakelijk bestaande uit chromatine, die micro-organismen kunnen insluiten en immobiliseren. Er is aangetoond dat NET’s gevoelig zijn voor DNase maar niet voor protease afbraak . Aangezien de vorming van NET’s op DNA is gebaseerd en van seminaal DNase is aangetoond dat het geëxtrudeerd DNA verteert en verstrengelde spermatozoa bevrijdt, stelden wij de hypothese voorop dat het gebruik van exogeen DNase een waardevolle behandeling zou kunnen blijken in gevallen van seminale hyperviscositeit die voornamelijk wordt veroorzaakt door de aanwezigheid van extracellulair, blootgesteld neutrofielen-DNA.
Vanuit de pathofysiologie gezien, is het concept dat hyperviscositeit toeschrijft aan ontsteking bijna vastgesteld. De ontstekingsreacties omvatten de vorming van NET’s van neutrofielen voor het insluiten van micro-organismen. Het is zeer waarschijnlijk dat spermatozoa veel energie verbruiken in een poging zich te bevrijden van NET’s en bijgevolg is de studie van hun oxidatie en apoptotische status van groot belang. Bovendien is de “trapping effect” dat al is beschreven is een gevolg van bewegende spermatozoa voorkomen als gevolg van hun verstrengeling met NETs.
In deze studie hebben we geprobeerd om de extracellulaire DNA van het zaadplasma, dat is de belangrijkste component van NETs, lyseren met DNase I met het oog op hen te bevrijden van NETs en het herstellen van spermatozoa kwaliteit parameters, dat wil zeggen, motiliteit en morfologie. Bovendien is er, zoals blijkt uit figuur 1, een statistisch significant verschil tussen de concentratie van WBC en de viscositeitsgraad. De voorgestelde behandeling is beperkt tot de postejaculatiefase en niet tot de klinische. Bovendien werd de aanvankelijke hypothese dat de verhoogde viscositeit van het sperma het gevolg was van de aanwezigheid van DNA in het sperma geverifieerd, hoewel verdere studies nodig zijn om deze hypothese te bevestigen. Rekening houdend met het feit dat gerekruteerde neutrofielen NET’s vormen naar ontstoken plaatsen, stelden wij de hypothese voorop dat het DNA in sperma afkomstig is van neutrofielen. Hoewel wij geen direct bewijs hebben geleverd dat deze veronderstelling ondersteunt, zijn wij van mening dat, volgens onze kennis, de belangrijkste mogelijke bron van DNA het chromatine van de neutrofielen is dat bij ontsteking wordt geëxtrudeerd.
5. Conclusies
Onze studieresultaten ondersteunen de conclusie dat DNase I behandeling een statistisch significante verbetering geeft van de beweeglijkheid en morfologie van sperma. Alleen in het geval van hyperviskeus sperma worden de basisparameters van sperma voor ART, d.w.z. motiliteit en morfologie, verbeterd. Bovendien suggereren onze bevindingen dat een belangrijke oorzaak van SHV de vorming van NETs is en we stellen dus het therapeutisch potentieel en nut van deze aanpak voor.
Beschikbaarheid van gegevens
De gegevens die worden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen, zijn op verzoek beschikbaar bij de corresponderende auteur.
Ethische goedkeuring
Alle procedures uitgevoerd in deze studie en waarbij menselijke deelnemers betrokken waren, waren in overeenstemming met de ethische normen van de Commissie voor Bio-ethiek en Deontologie, Nationale Kapodistriaanse Universiteit van Athene, Faculteit Geneeskunde, goedgekeurd op januari 2014 (Referentienummer: 1130).
Toestemming
Alle patiënten gaven hun geïnformeerde toestemming voorafgaand aan hun betrokkenheid bij de studie.
Belangenverstrengeling
Alle auteurs verklaren geen concurrerende financiële belangen.
Bijdragen van de auteurs
Angelos D. Gritzapis en Vassilis Tsilivakos bedachten de studie. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis en Vassilis Tsilivakos verzamelden de gegevens, werkten mee aan het ontwerp van de studie en schreven het manuscript. Effrosyni Nosi voerde de immunoassays uit en Angelos D. Gritzapis voerde de statistische analyse uit. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti, en Vassilis Tsilivakos namen deel aan de analyse en interpretatie van de gegevens. Alle auteurs hebben de definitieve versie van het manuscript gelezen en goedgekeurd.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door het Klinisch Diagnostisch Laboratorium, Locus Medicus S.A.