γδ-selection

γδT cells emerge from DN thymocytes, as the rearrangement of the TCRγ and δ chains occurs in the DN stages . γδ precursorcellen, die TCRγ en δ herschikt hebben voorafgaand aan TCRβ recombinatie, brengen γδTCR/CD3 complex tot expressie op de plasmamembraan, waar γδTCR zelf-oligomeriseert, zoals de pre-TCR, en intracellulaire signaalwegen initieert . Dit γδTCR-signaal induceert het proces dat “γδ-selectie” wordt genoemd en dat de generatie van functionele TCRγδ-ketens bevestigt, waardoor de cel herkent dat “ik een γδT-cel ben”.

Het γδ-selectiesignaal brengt de differentiatie op gang van CD5- CD24-hoge γδ-voorlopercellen naar CD5+ CD24-lagere γδT-gecommitteerde cellen. De overgang van CD5- naar CD5+ γδT-cellen is duidelijk verstoord in Syk-deficiënte muizen, terwijl Zap70-deficiënte muizen een normale differentiatie van CD5+ γδT-cellen vertonen. Dubbel Zap70/Syk deficiënte muizen vertonen een volledige stilstand van γδT celdifferentiatie in het CD5- precursor stadium. Dus, γδ-selectie is voornamelijk afhankelijk van het Syk-gemedieerde signaal, en Zap70 speelt slechts een kleine en redundante rol in dit proces. Dit mechanisme is vrij analoog aan dat van β-selectie. Een kritisch doelwit van Syk in het γδ-selectiesignaal is het Lat-signaalosoom, aangezien Lat-deficiënte muizen een volledige remming van γδ-selectie vertonen en een totaal gebrek aan rijpe γδT cellen.

γδ voorlopercellen van Syk/Zap70-deficiënte muizen of Lat-deficiënte muizen zijn niet te onderscheiden van αβT lineage cellen door de expressie van hun cel-oppervlakte eiwitten met uitzondering van de γδTCR, en behouden nog steeds het potentieel om te differentiëren in αβT cellen. Wat bepaalt het differentiatieflot naar αβT- of γδT-lijn vanuit de precursor? Deze vraag is beantwoord door studies met γδTCR transgene muizen. Wanneer het γδTCR-signaal wordt verzwakt door een tekort aan signaleringseiwitten of endogene liganden voor het transgene γδTCR, gaven de voorlopercellen aanleiding tot αβT-lijncellen ten koste van γδT-lijncellen . Deze resultaten suggereren dat een sterker signaal (waarschijnlijk door γδTCRligand interactie) leidt tot de inzet in γδT cellen, terwijl een zwakker signaal (waarschijnlijk door ligand-onafhankelijke pre-TCR) leidt tot αβT differentiatie. Experimenten met een andere transgene muizenstam die γδTCR met dezelfde ligand-specificiteit tot expressie brengt, toonden echter aan dat γδT-cellen in staat waren zich te ontwikkelen in afwezigheid van de liganden. Chien en medewerkers gebruikten een tetramerische kleuring om de ligand-specifieke γδT celpopulatie te identificeren en zo de betekenis van endogene γδTCR liganden in niet-transgene muizen te onderzoeken. De resultaten toonden duidelijk aan dat het aantal ligand-specifieke γδT cellen vergelijkbaar was tussen de ligand-afhankelijke en -afhankelijke muizen, wat suggereert dat de meerderheid van de γδT cellen geen liganden hebben ontmoet tijdens de thymische differentiatie. De auteurs leverden ook bewijs dat sommige γδTCRs ligand-onafhankelijk kunnen signaleren . Deze observaties zijn duidelijk in tegenspraak met het vorige model dat de γδT lineage commitment γδTCR ligand interactie vereist. Gezien het feit dat polyklonale γδT cellen die reageren op bepaalde exogene liganden differentiëren en functioneel rijpen in de thymus, is het waarschijnlijk dat de waarnemingen in bepaalde γδTCR transgene muizenlijnen niet de meerderheid van γδT cellen met polyklonale γδTCRs weerspiegelen.

Om de invloed van het γδ-selectiesignaal op de αβT/γδT-differentiatie te onderzoeken, hebben we gebruik gemaakt van Lat-deficiënte muizen, waarbij de γδT-celdifferentiatie wordt gestopt in het CD5-voorlopersstadium. γδTCR+ voorlopercellen werden gezuiverd van volwassen Lat-deficiënte muizen, geïnfecteerd met retrovirussen die Lat tot expressie brengen, en gekweekt op stromale celmonolagen (Fig. 2a). Dit experiment maakt directe evaluatie van de cel fenotype voor en na γδ-selectie onder een ligand-vrije conditie. Vergeleken met niet-getransduceerde controlecellen vertoonden Lat-expresserende γδT-cellen een duidelijke inductie van de oppervlakte-expressie van CD5 (fig. 2b), alsmede mRNA-expressie van kenmerkende genen van γδT-cellen (Tcrd, Egr3, Runx3 en Bcl-2), en een volledige onderdrukking van de transcriptie van genen die worden geassocieerd met voorloper-DN-cellen en αβT-cellen (Rag1, Rag2 en Ptcra) (fig. 2c). Deze resultaten geven aan dat het γδTCR-signaal zowel de differentiatie naar de γδT-lijn aanstuurt als de differentiatie naar de αβT-lijn op een ligand-onafhankelijke manier onderdrukt.

Hoewel de mechanismen waarmee de pre-TCR en γδTCR de differentiatieprocessen in respectievelijk de αβT- en γδT-lijnen sturen nog onduidelijk zijn (en worden besproken), is het waarschijnlijk dat γδ-selectie, althans in de meeste natuurlijk gegenereerde γδT-cellen, niet afhankelijk is van cognaat γδTCR-ligand in de thymus.

γδTCR signaalsterkte bepaalt γδT17/γδT1 differentiatie

Tijdens de ontwikkeling van zowel de αβT als de γδT lineages, wordt de expressie van Syk en Zap70 omgekeerd gereguleerd: Syk komt sterk tot expressie in de vroege stadia (DN1-3 en γδ precursor) en wordt daarna gedownreguleerd, terwijl Zap70 tot expressie komt in de latere stadia (na β-selectie of γδ-selectie). γδT-cellen die γδ-selectie hebben doorlopen, brengen hoge niveaus van Zap70 tot expressie, evenals γδTCR/CD3-complexen en kunnen reageren op endogene liganden als deze in de thymus worden aangeleverd. Momenteel wordt erkend dat γδT-cellen, in tegenstelling tot αβT-cellen, geen ligand-gedreven positieve selectie of klonale deletie ondergaan in de thymus. Verschillende studies hebben gesuggereerd dat de γδTCR-ligandinteractie in de thymus in plaats daarvan de effectorfunctie van γδT-cellen controleert.

Gebruik makend van tetramerische kleuring van een γδT celpopulatie die reactief is op de niet-klassieke MHC klasse I moleculen T10 en T22, ontdekte de groep van Chien dat antigeen-naïeve γδT cellen die zich ontwikkelden in afwezigheid van de liganden bij voorkeur IL-17 produceerden, terwijl antigeen-ervaren γδT cellen die zich ontwikkelden in aanwezigheid van de liganden overwegend IFNγ produceerden. Deze studie suggereerde voor het eerst het idee dat een ligand-geïnduceerd sterk γδTCR signaal en een zwak γδTCR signaal respectievelijk γδT1 en γδT17 cellen induceren. Een recente studie met nieuw gegenereerde T10/T22-deficiënte muizen rapporteerde in wezen dezelfde resultaten, wat dit “signaalsterkte-model” ondersteunt. Dit model is verder ondersteund door andere studies. De thymische maturatie en effectordifferentiatie van Vγ5Vδ1 γδT cellen vereisen Skint1 (en waarschijnlijk andere Skint familie-eiwitten), een vermoedelijk costimulatoir eiwit voor het Vγ5Vδ1 TCR . In afwezigheid van Skint1, worden Vγ5Vδ1 γδT cellen verkeerd gericht op een γδΤ17 cel fenotype ten koste van het γδT1 cel fenotype. Bovendien vereist de ontwikkeling van γδT1-cellen ook costimulatie via CD27, een TNF-receptorsuperfamilie-eiwit dat tot expressie komt in γδT1-cellen, maar niet in γδT17-cellen. Meer recent identificeerde de groep van Pennington thymische bipotente γδT cellen (CD24lo CD44lo CD45RBlo) die aanleiding kunnen geven tot zowel γδT17 cellen als γδT1 cellen. In foetale thymus orgaancultuur werd de ontwikkeling van γδT17 cellen geremd door sterke TCR signalen geïnduceerd door stimulatie met anti-TCRδ of anti-CD3ε antilichamen, maar deze effecten werden opgeheven door farmacologische remming van de MEK/ERK pathway. Deze gegevens leveren direct bewijs voor het idee dat de sterkte van het γδTCR-signaal een kritieke determinant is van de effectorfunctie van γδT-cellen.

Op transcriptioneel niveau induceert het sterke γδTCR-signaal de expressie van γδT1-geassocieerde transcriptionele regulatoren, zoals Egr2, Egr3 en Id3, wat resulteert in een γδT1-celbestemming. Id3 remt de aanname van het γδT17 celtype door remming van de transcriptieregulatie gemedieerd door HEB (gecodeerd door Tcf12) . HEB kan zich direct upstream van de transcriptionele startplaatsen van Sox4 en Sox13 binden om hun expressie te bevorderen. Deze γδT17-geassocieerde transcriptiefactoren zijn vereist voor de expressie van de essentiële transcriptiefactor RORγt (gecodeerd door Rorc) en het signaleringseiwit Blk . Gezien deze feiten laat het TCR signaalsterkte model duidelijk de mechanismen zien waarmee het TCR signaal de effectorfunctie van γδT cellen controleert.

Een serie studies heeft echter de invloed aangetoond van genetische ablatie van TCR signaalmoleculen op de γδT cel effectorfunctie, waardoor het idee dat γδTCR signaalsterkte alleen het γδT17/γδT1 differentiatie lot bepaalt, op losse schroeven komt te staan. Zap70 W163C mutante muizen vertonen een volledig verlies van Vγ6+ γδT17 celontwikkeling, maar hebben een normale ontwikkeling van γδT1 cellen, terwijl TCR signalen gedempt zijn in deze muizen. Een andere studie door Silva-Santos en medewerkers toonde aan dat muizen die haploinsufficient zijn voor CD3δ en CD3γ (CD3DH), die een lagere cel-oppervlakte expressie hadden van de γδTCR/CD3 complexen en een verminderde γδTCR signalering, vertoonden een duidelijke vermindering van de thymische ontwikkeling van Vγ6+ γδT17 cellen evenals γδT1 cellen, maar niet van Vγ4+ γδT17 cellen, wat aangeeft dat de γδT17 subsets een verschillende γδTCR signaalsterkte nodig hebben voor hun ontwikkeling . Hoewel αβT celontwikkeling en αβTCR signaaltransductie onaangetast waren in CD3DH muizen, is deze muizenstam tot nu toe het enige diermodel waarin de specifieke inhibitie van γδTCR signaaltransductie is aangetoond. Het blijft onduidelijk waarom γδT cellen specifiek zijn aangetast in CD3DH muizen, maar het is waarschijnlijk dat de verschillende samenstelling van de TCR-CD3 complexen αβT en γδT cellen verklaart voor het unieke fenotype van CD3DH muizen. In dit verband moet worden opgemerkt dat muizen met de CD3ε C80G mutatie, die niet in staat is conformatieveranderingen in TCR te induceren, ook verminderde γδT17 celontwikkeling vertonen, maar normale γδT1 celontwikkeling.

Syk is nodig voor γδT17 differentiatie

Recentelijk rapporteerden we een nieuw regulatiemechanisme waarmee de γδTCR-proximale kinasen Syk en Zap70 differentieel γδT17 inductie controleren. Syk-deficiënte muizen vertonen een volledig verlies van γδT17 cellen (zowel de Vγ4+ als de Vγ6+ subsets) in de thymus. Met name gedwongen expressie van Zap70 in Syk-deficiënte T-progenitor cellen herstelt de γδT17 cel generatie niet, wat een niet-redundante rol van Syk in γδT17 differentiatie suggereert. Aangezien Syk- maar niet Zap70-deficiënte γδT cellen een significante reductie vertonen van de Akt fosforylering geïnduceerd door γδTCR stimulatie, is het aannemelijk dat Syk de γδTCR-geïnduceerde activatie van het PI3K-Akt pathway medieert. PI3K-deficiënte muizen (p110γ-/- p110δ-/-) vertonen volledige remming van de γδT17 celontwikkeling, maar zijn onaangetast wat betreft γδ-selectie (CD5 upregulatie) of γδT1 ontwikkeling. Inhibitie van PI3K bleek de expressie van γδT17-geassocieerde transcriptiefactoren (Rorc, Sox13, en Sox4) te verminderen, wat een cruciale rol suggereert voor de PI3K-Akt pathway in het induceren van het γδT17 differentiatieprogramma. In overeenstemming hiermee toonde een eerder rapport aan dat kinase-inactieve PI3Kδ of PI3Kγ-deficiënte muizen een duidelijke vermindering vertonen van het perifere γδT17 cel aantal en een verbetering van γδT17-afhankelijke ontsteking. De PI3K-Akt pathway is ook vereist voor de differentiatie van IL-17-producerende αβT (Th17) cellen , wat suggereert dat deze signaalweg een gemeenschappelijk regulerend mechanisme is dat gedeeld wordt door αβT en γδT lineages voor het induceren van IL-17-producerende proinflammatoire subsets.

γδTCR-geïnduceerde activering van de PI3K-Akt-route is afhankelijk van Syk maar niet van Lat, wat aangeeft dat Syk de PI3K-Akt-route aanstuurt voor het induceren van γδT17-differentiatie, naast de Lat-afhankelijke hoofdstroom-signaalroute die γδ-selectie induceert. Het is onduidelijk of Syk de PI3K/Akt route in γδT cellen activeert door directe interactie of op een indirecte manier. Een eerdere studie rapporteerde dat Rasgrp1-deficiënte muizen een γδT cel effector fenotype vertonen dat vergelijkbaar is met dat van PI3K-deficiënte muizen (d.w.z. een verlies van γδT17 cellen en een toename van γδT1 cellen) . Aangezien Rasgrp1 kan functioneren als een upstream activator van de PI3K/Akt pathway in αβTCR signalering, is het waarschijnlijk dat Rasgrp1 signalen van γδTCR doorgeeft aan PI3K om γδT17 differentiatie te induceren.

Preferentieel verlies van γδT17 cellen werd ook gerapporteerd in muizen deficiënt voor Blk, een Src familie kinase tot expressie gebracht in γδT cellen evenals B cellen, hoewel de functie ervan in γδTCR signaaltransductie onbekend is.

Zap70 controleert bepaalde γδT cel subsets

We hebben ook de rol van Zap70 aangetoond in de thymische differentiatie van γδT cellen . Zap70-deficiënte muizen vertonen een duidelijke vermindering van Vγ6 + cellen, waarvan de meerderheid γδT17 zijn, maar zijn onaangetast in termen van de ontwikkeling van andere γδT cellen, met inbegrip van de Vγ1 + en Vγ4 + subsets. Het expressieniveau van het Zap70-eiwit was inderdaad het hoogst in de Vγ6+ subset onder de γδT-cellen. Aangezien de CD5 expressie lager was in de Zap70-deficiënte Vγ6+ cellen dan in controle cellen, is Zap70 waarschijnlijk vereist voor thymische maturatie van Vγ6+ cellen. In onze experimenten hadden Zap70-deficiënte muizen normale thymische differentiatie van Vγ4+ cellen, inclusief de γδT17 subset, wat in tegenspraak is met een eerder rapport waarin een hypomorfe Zap70 mutatie een vermindering van thymische Vγ4+ γδT17 cellen veroorzaakte. Deze discrepantie kan te wijten zijn aan de verschillende muizen gebruikt in de twee studies (Hayday’s groep gebruikt hypomorfe Zap70 mutant muizen op een BALB / c achtergrond, terwijl we gebruik gemaakt van volledige Zap70-deficiënte muizen op een C57BL / 6 achtergrond). Bovendien vertoonden Zap70-deficiënte muizen een significante vermindering in perifere Vγ4+ cellen, die zowel de γδT17 als de γδT1 subsets omvatten, maar hadden geen verminderde Vγ1+ cellen. Dus, in tegenstelling tot zijn essentiële rol in αβT celontwikkeling, is de vereiste van Zap70 beperkt tot de thymische maturatie van Vγ6+ cellen en perifeer behoud van Vγ4+ cellen.

Onze bevindingen over de verschillende rollen van Zap70 en Syk zouden een nieuwe aanwijzing kunnen geven om de mechanismen van γδTCR signalering en γδT celontwikkeling te begrijpen. Zap70 is vereist voor αβTCR signalering en γδTCR signalering in bepaalde γδT cel subsets. In αβT cellen is de activering van Zap70 afhankelijk van Lck, dat gekoppeld is aan CD4 of CD8 coreceptoren die zich binden aan pMHC op het oppervlak van antigeen-presenterende cellen. Aldus wordt gesuggereerd dat Lck-Zap70 een signaleringsas is die gespecialiseerd is in antigeenherkenning door cel-celcontact; hoewel het in het geval van γδT-cellen onduidelijk blijft hoe Zap70 wordt geactiveerd ondanks het ontbreken van CD4- en CD8-expressie. Syk daarentegen is geassocieerd met een breed scala van immuunreceptoren, waaronder pre-TCR, γδTCR, BCR, en FcR . Omdat Syk in staat is om ITAMs en downstream targets te fosforyleren onafhankelijk van Src familie kinases zoals Lck , kunnen deze receptoren ligand-onafhankelijk geactiveerd worden of na binding aan een verscheidenheid van oplosbare en cel-oppervlakte antigenen. Het gebruik van Syk of Zap70 in immunoreceptor signalisatie kan dus dicteren hoe de receptor antigenen herkent. Expressie van Syk in plaats van Zap70 maakte αβT cellen in staat om te reageren op oplosbare anti-CD3 antilichaam stimulatie, terwijl normale αβT cellen alleen reageerden op multimerized anti-CD3 antilichamen die de interactie met cel-oppervlakte pMHC nabootsten. Deze bevindingen brachten ons tot de hypothese dat de wijze van antigeenherkenning door lymfocyten niet alleen bepaald zou kunnen worden door hun receptor op zich, maar ook door verschillend gebruik van Syk familie kinasen. Gebaseerd op dit concept, voorspellen wij dat er endogene cel-oppervlakte γδTCR liganden nodig zijn voor thymische maturatie van Vγ6+ cellen, evenals het perifere onderhoud van Vγ4+ cellen, en dat Vγ1+ cellen geen cel-oppervlakte γδTCR liganden nodig hebben voor hun ontwikkeling en/of onderhoud.

γδTCR-onafhankelijke en -afhankelijke processen voor γδT17-inductie

Een recent rapport toonde op elegante wijze aan dat γδT17-cellen ontstaan uit een progenitor die verschilt van de andere γδT-celsubets . Er werd gerapporteerd dat foetale, intrathymische progenitors die hoge niveaus van Sox13 tot expressie brengen, werden geïdentificeerd in een populatie die eerder werd gecategoriseerd als DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) thymocyten. Deze Sox13+ progenitors gaven bij voorkeur aanleiding tot γδT17 cellen in de gereconstitueerde foetale thymus, terwijl andere progenitors binnen de DN2 populatie dit niet deden. Het belangrijkste is dat de Sox13+ progenitors detecteerbaar waren en dat hun γδT17 lineage programma’s intact waren in TCRδ-deficiënte of Rag-deficiënte muizen, wat aangeeft dat het γδT17 lineage lot “voorbedraad” is door een cel-intrinsiek, γδTCR-onafhankelijk mechanisme. Een vorig rapport toonde echter aan dat γδT17 cellen zich kunnen ontwikkelen vanaf het DN2 stadium (CD44+CD25+c-kithi) wanneer ze gecultiveerd worden op een monolayer van Notch-ligand-expresserende stromale cellen. Het kan dus nodig zijn de differentiatiestadia en de progenitor-afstammelingrelaties in de ontwikkeling van γδT-cellen opnieuw te definiëren.

Figuur 3 geeft een overzicht van de differentiatieprocessen van zowel γδT-cellen als αβT-cellen, waarbij de verschillen in de vereiste van αβ/γδTCR-signalen en Syk-familie kinasen worden benadrukt. De vroege stappen van differentiatie, d.w.z. β-selectie voor de αβT cellijn en γδ-selectie voor de γδT cellijn, worden gestuurd door ligand-onafhankelijke pre-TCR of γδTCR signalering, die dient als een checkpoint voor de cellen die een functionele TCRβ keten of γδTCR keten tot expressie brengen, respectievelijk. Deze ligand-onafhankelijke receptorsignalen worden geïnitieerd door Syk, dat tot expressie komt in DN thymocyten, met inbegrip van γδT precursors. In de γδT cellijn is het Syk-gemedieerde γδTCR signaal ook nodig voor de priming van γδT17 celdifferentiatie via de activering van het PI3K pad. Tijdens zowel β-selectie als γδ-selectie, wordt de expressie van Syk en Zap70 omgekeerd gereguleerd: Syk wordt gedownreguleerd terwijl Zap70 wordt geupreguleerd bij pre-TCR of γδTCR signalering. Daarom is de latere stap in de differentiatie van de αβT lijn afhankelijk van Zap70-gemedieerde αβTCR signalering, die DP thymocyten in staat stelt pMHC op het oppervlak van TECs te herkennen om positief of negatief geselecteerd te worden naargelang de sterkte van de αβTCR-pMHC interactie. Daarentegen bepaalt de Zap70-gemedieerde γδTCR-signalering in reactie op endogene liganden de effectorfunctie van γδT-cellen: een sterk signaal induceert γδT1, terwijl een zwak/geen signaal γδT17 induceert.