De wisselwerking van röntgenstralen met de elektronen in een kristal geeft aanleiding tot een diffractiepatroon, dat mathematisch de Fourier-transformatie is van de elektronendichtheidsverdeling. De detectoren die worden gebruikt om de röntgenstraling te meten, kunnen echter alleen de amplitude van de gebroken röntgenstraling meten; de faseverschuivingen, die nodig zijn om de Fourier Transformatie te gebruiken en de verdeling van de elektronendichtheid te vinden, kunnen met deze methode niet rechtstreeks worden gemeten. Dit staat in de natuurkundige wereld bekend als het “faseprobleem”. Eenvoudiger gezegd kunnen de fasen niet worden gevonden uit de gemeten amplitudes van de röntgenstraling. Er moeten andere extrapolaties worden gemaakt en aanvullende experimenten worden gedaan om een elektronendichtheidskaart te verkrijgen. Vaak kunnen de bestaande gegevens over de fysische en chemische eigenschappen van de verbinding helpen wanneer er een slechte dichtheidskaart is. Een andere methode die bekend staat als Patterson Synthese is zeer nuttig om een eerste schatting van de fasen te achterhalen en is zeer nuttig voor de eerste fasen om de structuur van eiwitten te bepalen wanneer de fasen niet bekend zijn. Het probleem kan worden vereenvoudigd door een atoom, meestal een zwaar metaal, te vinden met behulp van Patterson Synthese en vervolgens de positie van dat atoom te gebruiken om de aanvankelijke fasen te schatten en een aanvankelijke elektronendichtheidskaart te berekenen die verder kan helpen bij het modelleren van de positie van andere atomen en de faseschatting nog verder kan verbeteren. Een andere methode heet moleculaire vervanging; deze lokaliseert de plaats van de eiwitstructuur in de cel. Naast de moleculaire vervangingsmethode kan het faseprobleem ook worden opgelost door de isomorfe vervangingsmethode, de anomale diffractiemethode met meerdere golflengten, de anomale diffractiemethode met één golflengte, en directe methoden.

Moleculaire VervangingEdit

Faseprobleem kan worden opgelost door een atoommodel te hebben dat fasen kan berekenen. Een model kan worden verkregen als de verwante eiwitstructuur bekend is. Om dit atoommodel te kunnen bouwen, moeten echter de oriëntatie en positie van het model in de nieuwe eenheidscel worden bepaald. Dit is wanneer de techniek, moleculaire vervanging (of MR) in beeld komt.

Moleculaire vervanging, ook bekend als MR, is een methode om faseproblemen in de röntgenkristallografie op te lossen. MR lokaliseert de oriëntatie en positie van een eiwitstructuur met zijn eenheidscel, waarvan de eiwitstructuur homoloog is met de onbekende eiwitstructuur die moet worden bepaald. De verkregen fasen kunnen helpen bij het genereren van elektronendichtheidskaarten en bij het produceren van berekende intensiteiten van de positie van het eiwitstructuurmodel ten opzichte van de waargenomen structuren van het röntgenkristallografie-experiment.

MR methode is ook effectief voor het oplossen van macromoleculaire kristalstructuren. Deze methode vergt minder tijd en inspanning voor de structuurbepaling, omdat zware atoomderivaten en het verzamelen van gegevens niet behoeven te worden voorbereid. De methode is rechttoe rechtaan en de modelbouw is vereenvoudigd omdat er geen chain tracing nodig is.

Deze methode bestaat uit twee stappen:

1. een rotationele zoektocht om het homologe model in de eenheidscel te oriënteren of
2. een translationele target waar het nieuw georiënteerde model in de eenheidscel wordt gepositioneerd

Op Patterson gebaseerde (Molecular Replacement)Edit

Patterson maps zijn interatomaire vectorkaarten die pieken bevatten voor elk gerelateerd atoom in de eenheidscel. Als de Patterson-kaarten zijn gegenereerd op basis van de gegevens die zijn afgeleid van de elektronendichtheidskaarten, moeten de twee Patterson-kaarten alleen nauw aan elkaar verwant zijn als het model juist is georiënteerd en in de juiste positie is geplaatst. Dit zal ons in staat stellen informatie af te leiden over de plaats van de onbekende eiwitstructuur met zijn cel. Er is echter een probleem met moleculaire vervanging, het heeft zes dimensies, drie parameters om oriëntatie en positie te specificeren. Met de Patterson kaarten, kan het worden onderverdeeld in subsets van de parameters om naar elk deel afzonderlijk te kijken.

RotatiefunctieEdit

Rotatiefunctie heeft intramoleculaire vectoren die alleen afhangen van de oriëntatie van het molecuul en niet van de positie, want zelfs als het molecuul wordt vertaald in de eenheidscel, worden alle atomen met hetzelfde bedrag verschoven, maar de vectoren tussen de atomen zijn hetzelfde. De Patterson-kaart voor de onbekende eiwitstructuur wordt vergeleken met de homologe bekende eiwitstructuur in verschillende oriëntaties

Klassieke RotatiefunctieEdit

Om de oriëntatie te vinden, moeten de rotatie-as en de rotatiehoek om die as worden bepaald. Er zijn twee parameters nodig om een as te definiëren (een vector van het middelpunt van de bol naar een punt op het oppervlak van de bol). De rotatie-as begint parallel aan de z-as en wordt geroteerd rond de y-as met hoek ᶱ, vervolgens roteert het object rond de z-as met hoek ᶲ, en tenslotte roteert het rond de rotatie-as met hoek ᵠ. Deze geven een punt aan op het oppervlak van een eenheidsbol.

Snelle RotatiefunctieEdit

De rotatiefunctie kan worden berekend door twee Patterson-kaarten of de pieken in die Pattersons te vergelijken. De rotatiefunctie kan alleen veel sneller worden berekend met Fourier-transformaties als de Pattersons werden uitgedrukt in termen van sferische harmonischen.

Directe RotatiefunctieEdit

In de directe rotatiefunctie kan de eiwitstructuur in de eenheidscel van de onbekende structuur worden geplaatst en wordt de Patterson voor het georiënteerde molecuul vergeleken met de volledige Patterson van de onbekende structuur.

Translation FunctionEdit

Nadat de oriëntatie van de bekende structuur bekend is kan het model (elektronendichtheidskaart) worden georiënteerd om structuurfactoren te berekenen waarbij een correlatiefunctie wordt gebruikt om de vector te bepalen om het model te vertalen bovenop de homologe binnen een asymmetrische eenheid.

Met de juiste georiënteerde en vertaalde faseringsmodellen van de eiwitstructuur, is het nauwkeurig genoeg om de elektronendichtheidskaarten af te leiden uit de afgeleide fasen. De elektronendichtheidskaarten kunnen worden gebruikt om het model van de onbekende structuur op te bouwen en te verfijnen.

Anomale Diffractie met meerdere golflengtenEdit

Röntgenstraling wordt opgewekt in grote machines die synchrotrons worden genoemd. Synchrotrons versnellen elektronen tot bijna de lichtsnelheid en leiden ze door een grote, holle, metalen veelhoekige ring. In elke hoek buigen magneten de elektronenstroom af, waardoor energie vrijkomt in de vorm van elektromagnetische straling. Aangezien de elektronen zich met de snelheid van het licht verplaatsen, zenden zij hoogenergetische röntgenstralen uit.

De voordelen van het gebruik van synchrotrons is dat de onderzoekers niet van elk gekristalliseerd molecuul meerdere versies behoeven te kweken, maar in plaats daarvan slechts één type kristal dat selenium bevat. Zij kunnen dan de golflengte afstemmen op de chemische eigenschappen van selenium. Deze techniek staat bekend als Multiwavelength Anomalous Diffraction. De kristallen worden vervolgens verschillende malen gebombardeerd met golflengten van verschillende lengte, en uiteindelijk ontstaat er een diffractiepatroon dat de onderzoekers in staat stelt de plaats van de seleniumatomen te bepalen. Deze positie kan worden gebruikt als referentie of marker om de rest van de structuur te bepalen. De voordelen hiervan stellen onderzoekers in staat hun gegevens veel sneller te verzamelen.

Isomorfe vervangingsmethodeEdit

Deze methode vergelijkt de röntgendiffractiepatronen tussen het oorspronkelijke proteïnekristal en hetzelfde type kristal met toevoeging van ten minste één atoom met een hoog atoomnummer. De methode werd gebruikt om de structuur van kleine moleculen te bepalen en uiteindelijk die van hemoglobine door Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Van een perfect isomorfisme is sprake wanneer het oorspronkelijke kristal en het afgeleide kristal precies dezelfde conformatie van het eiwit, de positie en oriëntatie van de moleculen, en de eenheidscelparameters hebben. Het enige verschil dat het kristal en zijn derivaat bij een perfect isomorfisme vertonen, zijn de intensiteitsverschillen ten gevolge van de toevoeging van zware atomen op het derivaat. Deze verschillen kunnen handmatig of met een automatische Patterson-zoekprocedure, zoals SIR 2002, SHELXD, nB en ACORN, worden geïdentificeerd, en dergelijke informatie is belangrijk om de fashoeken van de proteïnen te bepalen. Een perfect isomorfisme treedt echter nauwelijks op vanwege de verandering in celafmetingen. Voor het eiwit met zwaar atoom is de toelaatbare verandering in celafmeting dmin/4, want dmin is de resolutielimiet. Andere factoren, zoals rotatie, dragen ook bij tot niet-isomorfisme.

ProceduresEdit

1. Prepareer een paar derivaten van het eiwit in kristallijne structuur. Meet vervolgens de celafmetingen om te controleren of er sprake is van isomorfisme.
2. Verzamel röntgenintensiteitsgegevens van het oorspronkelijke eiwit en het afgeleide eiwit.
3. Toepassen van de Patterson-functie om de coördinaten van het zware atoom te bepalen.
4. Vernauwen van de zware atoomparameters en berekenen van de fasehoek van het eiwit.
5. Berekenen van de elektronendichtheid van het eiwit.

De afgeleiden worden met twee verschillende methoden gemaakt. De voorkeursmethode is het eiwitkristal te weken in een oplossing die identiek is samengesteld als de moedervloeistof, maar met een lichte verhoging van de precipitantconcentratie. Een andere methode is co-kristallisatie, maar deze wordt niet vaak toegepast omdat het kristal niet groeit of nietisomorf groeit. De inweekprocedure hangt af van hoe breed de poriën van het kristal zijn. De poriën moeten breed genoeg zijn om het reagens in het kristal te laten diffunderen en de reactieve plaatsen op het oppervlak van alle eiwitmoleculen in het kristal te bereiken.

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

Multiple Wavelength Anomalous Diffraction (afgekort MAD) is een methode die in de röntgenkristallografie wordt gebruikt en waarmee we de structuren van biologische macromoleculen, zoals eiwitten en DNA, kunnen bepalen om het faseprobleem op te lossen. Vereisten voor de structuur zijn onder andere atomen die aanzienlijke verstrooiing van röntgenstraling veroorzaken; met name zwavel of metaalionen van metalloproteïnen. Aangezien selenium de natuurlijke zwavel kan vervangen, wordt het vaker gebruikt. Het gebruik van deze techniek maakt het voor de kristallograaf veel gemakkelijker om de Meervoudige Isomorfe Vervanging (MIR) methode te gebruiken, omdat het bereiden van zware verbindingen overbodig is.

Deze methode wordt gebruikt om fase problemen op te lossen, wanneer er naast amplitudes geen gegevens over verstrooide diffractie beschikbaar zijn. Bovendien wordt zij gebruikt wanneer een zwaar metaalatoom reeds in het eiwit is gebonden of wanneer de eiwitkristallen niet isomorf zijn, hetgeen ongeschikt is voor de MIR methode. De methode is meestal gebruikt voor zware metallo oplossingen, deze metallo enzymen komen normaal uit de 1e overgangsreeks en hun buren. het is belangrijk een bron voor een krachtig magnetisch veld te hebben om dit experiment uit te voeren, omgeving zoals ondergronds moet worden overwogen. Een deeltjesversneller genaamd een synchrotron is ook nodig voor de methode.

Single-Wavelength Anomalous Diffraction MethodEdit

In vergelijking met multi-golflengte anomale diffractie (MAD), single-wavelength anomale diffractie (SAD) maakt gebruik van een enkele set van gegevens van een enkele golflengte. Het belangrijkste gunstige verschil tussen MAD en SAD is dat het kristal bij SAD minder tijd in de röntgenstraal doorbrengt, waardoor de potentiële stralingsschade aan het molecuul wordt beperkt. Omdat bij SAD slechts één golflengte wordt gebruikt, is het ook tijdsefficiënter dan MAD.

De elektronendichtheidskaarten die zijn afgeleid van anomale diffractiegegevens met één golflengte moeten wel worden gewijzigd om fasemeerduidigheden op te lossen. Een veel gebruikte modificatietechniek is solvent flattening, en wanneer SAD wordt gecombineerd met solvent flattening, zijn de resulterende elektronendichtheidskaarten van vergelijkbare kwaliteit als die welke zijn afgeleid van volledige MAD fasering. Bij het afvlakken van oplosmiddelen wordt de elektronendichtheid van de interstitiële gebieden tussen de eiwitmoleculen, die door het oplosmiddel worden bezet, aangepast. Het oplosmiddelgebied wordt verondersteld relatief ongeordend en karakterloos te zijn in vergelijking met het eiwit. Het afvlakken van de elektronendichtheid in de oplosmiddelgebieden zal de elektronendichtheid van het eiwit tot een interpreteerbare graad verhogen. Deze methode wordt ISAS genoemd, iterative single-wavelength anomalous scattering.

Direct MethodsEdit

De directe methode kan helpen de fasen te herstellen met behulp van de gegevens die zij verkrijgt. De directe methode schat de begin- en uitdijingsfasen met behulp van een drievoudige relatie. Een drievoudige (trio-) relatie is de relatie van de intensiteit en fase van één reflectie met twee andere intensiteiten en fasen. Bij gebruik van deze methode is de grootte van de eiwitstructuur van belang, aangezien de fasekansverdeling omgekeerd evenredig is met de vierkantswortel van het aantal atomen. De directe methode is de meest bruikbare techniek om faseproblemen op te lossen.