Prothrombine speelt een centrale rol in de bloedstolling (Fig. 1, 2). Zijn functionele eigenschappen houden verband met de aanwezigheid van gamma-carboxyglutamyl (Gla) residu’s, die het resultaat zijn van Vitamine K-afhankelijke post-translationele carboxylering van tien specifieke glutamyl residu’s (Fig. 3,4). Mijn runderstudies (b.v. onderzoek naar het verband tussen metaal-ion binding en eiwitfunctie binnen het “”””””””prothrombinase complex””””””””) zullen onderscheid maken tussen ligandering en de daaropvolgende conformationele betrokkenheid van de Gla residuen in het normale fysiologische proces. Binnen dit kader heb ik eerder zes verschillende Gla-deficiënte (0-,1-,2-,3-,5- en 7-Gla) protrombine varianten geïsoleerd en gekarakteriseerd. Elk van deze varianten genereerde kwantitatief trombine maar aan een merkelijk tragere snelheid (hoge K/m) dan 10-Gla protrombine omwille van de sterke afname in Ca/2+- en fosfolipide-binding in vergelijking met normaal 10-Gla protrombine. Zeven- en minder-Gla varianten vertoonden slechts 3% van de normale protrombine activiteit, gemeten aan de hand van hun vermogen om de stolling van protrombine en Factor VII-deficiënt plasma te versnellen. Nieuw geïsoleerde 8- en 9-Gla protrombines bezitten respectievelijk 18 en 75% van de normale activiteit, en vormen daarmee een overgang tussen de 7- en 10-Gla protrombines. De isolatie van 8- en 9-Gla varianten werd mogelijk door gebruik te maken van monoklonale antilichamen (McAb) tegen de Ca2+-gestabiliseerde structuur (Ca II Ab) van protrombine voor immunoaffiniteits-chromatografie. Mijn immunochemische studies met Ca II Ab, polyklonaal en monoklonaal, hebben aangetoond dat zij (polyklonaal) niet specifiek zijn voor normaal protrombine omdat zij wel kruisreageren met 7-, 8- en (vooral) 9-Gla varianten. Verder suggereren mijn voorlopige gegevens met 5- en 7-Gla protrombines dat Glu posities 15 en 17 niet gemodificeerd zijn, en dat selectieve posities (residuen 7,8,20,30,33) mogelijk preferentieel gecarboxyleerd zijn. Het voorgestelde onderzoek zal uitwijzen of de Gla- deficiënte prothrombines inderdaad selectief deficiënt zijn, en de volgorde van “”””””””in vivo”””””””” carboxylering van Glu residuen aangeven. Mijn expertise in het beschrijven van hoe de positie en/of het aantal Gla residuen de functionele, fysicochemische (conformationele) en immunochemische eigenschappen van protrombine en Gla-bevattend Fragment 1 beïnvloeden, vormt de basis voor de isolatie van menselijk materiaal voor zowel basaal als klinisch onderzoek. Ik zal normale en de meest cruciale Gla-deficiënte protrombines isoleren. Deze laatste zullen vervolgens in twee (of meer) groepen worden verdeeld naar gelang van hun fysiologische activiteit. Het doel zal zijn het plasma van patiënten die met warfarine worden behandeld te controleren op normale, 9-Gla (als dit de enige is die functioneel actief is en totale (normale plus Gla-deficiënte) protrombines door immunoassays met specifieke monoklonale antilichamen om de hemostatische toestand van deze patiënten te beoordelen.
Het doel is vast te stellen waarom sommige patiënten trombotische episoden vertonen terwijl anderen meer vatbaar blijven voor bloedingen, ook al wordt hun plasma protrombine bioactiviteit op klinisch aanvaardbare niveaus gehandhaafd. Bovendien kunnen Gla-deficiënte protrombines een andere marker voor leverdysfunctie verschaffen.