In mensen stroomt ongeveer 5 tot 8 liter lucht in en uit de long per minuut in rust. De lucht kan variëren in zuurstof- en CO2-concentratie, kan allergenen bevatten, en kan de luchtwegen en de gasuitwisselingsoppervlakken in verschillende mate mechanisch uitrekken. Deze signalen worden waargenomen, doorgegeven en verwerkt tot fysiologische outputs zoals de controle van de pulmonale bloeddruk, immuunreacties en ademhalingsritme, maar het mechanisme is onduidelijk. Pulmonale neuroendocriene cellen (PNECs) worden gevonden in een breed scala van organismen van vissen tot zoogdieren (1). In de long van zoogdieren zijn PNECs de enige geïnnerveerde epitheelcellen van de luchtwegen en zij vertegenwoordigen minder dan 1% van de totale longepitheelcelpopulatie (2). Hoewel in vitro bewijs heeft aangetoond dat PNECs betrokken zijn bij zuurstofdetectie, bronchiale en vasculaire gladde spiertonus, en immuunreacties (1, 3), zijn deze rollen nog niet in vivo aangetoond. Een recente studie toonde aan dat genetische ablatie van PNECs bij volwassenen de homeostase of het herstel van de luchtwegen niet in gevaar bracht, waardoor het in vivo belang van deze cellen twijfelachtig blijft (4). PNEC pathologieën, in het bijzonder een toename van het aantal PNEC, zijn gedocumenteerd in een groot aantal longziekten, waaronder astma, bronchopulmonale dysplasie, cystische fibrose, chronisch obstructieve longziekte, congenitale diafragmatische hernia, neuro-endocriene hyperplasie bij kinderen, plotselinge sterfte bij kinderen, en pulmonale hypertensie (5-8). In elk geval blijft het onduidelijk of de toename van PNEC een oorzaak voor of het gevolg van de symptomen is.

In de muizenlong bevinden de meeste PNECs zich in clusters van ~ 3 tot 20 cellen die neuroepitheliale lichaampjes (NEBs) worden genoemd (3, 9). Zowel solitaire als geclusterde PNECs bevatten dichte kernblaasjes, gevuld met bioactieve neuropeptiden zoals calcitonine-gen-gerelateerd peptide (CGRP) of amines zoals serotonine (1). Deze worden vrijgemaakt als reactie op stimuli, zoals veranderingen in het zuurstofgehalte. Neuropeptiden en amines zijn betrokken bij een aantal van dezelfde processen als PNEC’s (10-12), waardoor de mogelijkheid bestaat dat zij de functie van PNEC’s mediëren. Een oorzakelijk verband is echter niet in vivo aangetoond.

We begonnen de huidige studie om de mechanismen te ontdekken die ten grondslag liggen aan congenitale diafragmatische hernia (CDH), een geboorteafwijking die wordt geassocieerd met aanzienlijke longdisfunctie, waaronder een verhoogde immuunrespons en pulmonale hypertensie (13). In een genetisch muismodel van CDH, ontdekten we een defect van falende PNEC clustering. Dit wordt gevolgd door een opeenvolging van gebeurtenissen: een toename van PNEC neuropeptiden, een toename van immuun infiltraten, en remodellering van de longstructuur. Deze bevindingen bieden een in vivo demonstratie van de PNEC functie. Omdat veranderingen in PNEC aantal en de bijbehorende neuropeptiden zijn gedocumenteerd in vele longziekten, onze resultaten hebben brede implicaties buiten CDH.

Bij de mens zijn mutaties in de rotonde receptor (ROBO) genen geassocieerd met CDH (13, 14). Om de long defecten geassocieerd met CDH bestuderen, inactiveerden we zowel Robo1 en Robo2 in endoderm-afgeleide epitheel, met inbegrip van de longen, met behulp van Shhcre (hierna Shhcre;Robo mutant) in muizen (15, 16). Hoewel deze mutanten overleven, vertonen ze een verminderde gas-uitwisseling oppervlakte vanaf de postnatale dag (P) 15 (Fig. 1, A en B, en fig. S1). We voerden microarray gevolgd door kwantitatieve reverse transcriptase polymerase chain reaction (qRT-PCR) op P7, vóór vermindering van gas-uitwisseling oppervlak. Vijftien van de top 20 differentieel tot expressie komende genen zijn betrokken bij immuunreacties, en alle zijn significant verhoogd, inclusief Ccl3, Cxcl2, Tnfa, en Saa3 (Fig. 1C). In overeenstemming met dit patroon zagen we verhoogde aantallen immuuncellen, waaronder neutrofielen, eosinofielen, macrofagen en T-cellen (Fig. 1, D en E, en fig. S2). Bovendien is er een toename in het aandeel van M2 en een afname in het aandeel van M1 macrofagen (fig. S3). Deze bevindingen geven aan dat Shhcre;Robo mutanten verhoogde immuun gevoeligheid vertonen, nabootsing van een gemeenschappelijke CDH comorbidity (13).

Hoewel Robo tot expressie komt in het alveolaire gebied van het longmesenchym (fig. S4), is de expressie ervan in het epitheel beperkt tot zeldzame cellen langs de luchtwegen (Fig. 1F). Colabeling met CGRP antilichaam bleek dat Robo-expressie epitheelcellen zijn PNECs (Fig. 1G). Om te bevestigen dat Robo genen nodig zijn binnen PNECs voor functie, hebben we geïnactiveerd Robo met behulp van Ascl1creERT2 (17), een knock-in cre driver die PNEC-specifieke activiteit in de long epitheel (fig. S5) verleent. We vonden dat Ascl1creERT2;Robo mutanten vertoonden zowel alveolaire vereenvoudiging en macrofaag toename, het recapituleren van de Shhcre;Robo fenotypen (fig. S6). Deze bevindingen tonen samen aan dat Robo specifiek nodig is in PNECs voor het beperken van het aantal immuuncellen en het voorkomen van alveolaire vereenvoudiging.

Op embryonale dag (E) 13,5, nieuw gespecificeerde PNECs waren solitaire cellen in zowel de controle als Shhcre;Robo mutant longen (Fig. 2, A en B). Door E15.5, had een meerderheid van PNECs geaggregeerd in NEBs in de controle. Echter, PNECs waren niet geclusterd in Shhcre;Robo mutanten (Fig. 2, C en D). Deze zeer doordringende fenotype bleef in de postnatale longen (Fig. 2, E en F, en fig. S7). Het totale aantal PNEC-cellen lijkt onaangetast, zoals blijkt uit de normale expressie van Ascl1 en andere PNEC-merkers (fig. S8). Niet-geclusterde cellen in de mutant verliezen hun wigvorm en zijn meer afgerond (figs. S7 en S9). Bovendien, in tegenstelling tot controles, waar solitaire PNECs niet geïnnerveerd (9), ~ 33,3% (31 van 93 cellen) van niet-geclusterde PNECs zijn geïnnerveerd in de mutant (Fig. 2F en fig. S9), wat suggereert dat PNEC innervatie niet afhankelijk is van clustervorming of van Robo-functie in PNECs.

Ascl1creERT2;Robo mutanten vertonen ook PNEC unclustering (fig. S10). Dit fenotype manifesteerde zich zelfs wanneer Robo inactivering werd geïnduceerd postnataal, dat is na de NEB vorming. Samen stellen onze resultaten vast dat Robo nodig is voor PNEC assemblage en onderhoud in NEB’s.

Robo kan zowel afhankelijk als onafhankelijk van zijn ligand, Slit (18) functioneren. Analyse van Slit-mutanten toont aan dat, terwijl PNEC-clustering niet wordt beïnvloed in een van de afzonderlijke mutanten, het is verminderd in Slit1;3 mutanten (fig. S11, A tot D). Dit resultaat suggereert dat Robo functie in dit proces waarschijnlijk ligandafhankelijk is.

Slit en Robo functioneren voornamelijk om cellulaire afstoting te bemiddelen en zelden aantrekking (19). Om te bepalen of Slit fungeert als een afstotende of aantrekkelijke signaal voor Robo-expressie PNECs, hebben we eerst bepaald waar Slit genen worden uitgedrukt. Gecombineerde Slit1, 2-GFP (groen fluorescent eiwit) reporter onthulde expressie in slechts ongeveer 1 tot 3 PNECs binnen grote NEBs, het verhogen van de mogelijkheid dat de Slit1 / 2-uitdrukkende cellen kunnen de kernen cellen van de cluster (fig. S11E) zijn. Dit wijst ook op PNEC subspecialisatie binnen een cluster. Slit3 expressie is beperkt tot de vasculaire gladde spiercellen laag rond arteriën, die loopt langs de belangrijkste bronchiën waar de meeste NEBs worden gevonden (fig. S11, F en G). Samen, de nabijheid van Slit-expresserende cellen aan Robo-expresserende PNECs wekte de mogelijkheid dat Slit liganden kan een aantrekkelijke cue voor PNECs.

Om dit te testen, flowcytometrie gesorteerde GAD1-GFP + PNECs werden gezaaid in de bovenste kamer van een Boyden cel migratie cultuur insert. Wanneer Slit-eiwit werd toegevoegd met de cellen in de bovenste kamer, ~ 52% minder (P = 8,5 × 10-4) PNECs gemigreerd naar de bodem (fig. S12, J tot I). Omgekeerd, wanneer Slit eiwit werd toegevoegd aan de onderste kamer, 18% meer (P = 7,5 x 10-5) PNECs gemigreerd naar de bodem (fig. S11, L tot N). Deze resultaten suggereren dat Slit-Robo PNEC clustering in NEB’s aandrijven, waarschijnlijk door cellulaire attractie.

Om een mogelijk verband tussen PNECs en immuunrespons te testen, testten we de expressie van neuropeptiden geproduceerd door PNECs (1). Van de negen onderzochte neuropeptide genen waren er vijf significant verhoogd in Shhcre;Robo mutanten (Fig. 3A). Kleuring met antilichaam tegen CGRP bleek dat, hoewel de expressie blijft in PNECs in de mutant, de kleuring intensiteit is toegenomen en het is niet langer beperkt tot de basale zijde van deze cellen (figs. S7 en S9). We merken ook op dat, terwijl unclustering optrad bij E15,5, neuropeptide up-regulatie alleen wordt waargenomen na de geboorte, vermoedelijk bij blootstelling aan lucht (fig. S12).

Om te bepalen of de toename van neuropeptiden bijdraagt aan de immuunrespons, richtten we ons op CGRP, omdat zijn transcript de grootste toename vertoont van alle geteste (fig. 3A). We hebben deze toename tegengegaan door het kweken van een mutant allel van Cgrp in de Shhcre;Robo achtergrond (20). In Robo controles, verlies van Cgrp veranderde niet macrofaag nummers (Fig. 3, B, D, en F). Echter, in Shhcre;Robo mutanten, verlies van Cgrp significant macrofaag aantal verminderde in een dosis-afhankelijke wijze (Fig. 3, C, E, en F). We vonden ook dat verlies van Cgrp gedeeltelijk het alveolaire vereenvoudiging fenotype terugdraaide (fig. S13). We merken op dat noch de toename van macrofagen, noch de alveolaire vereenvoudiging volledig werden voorkomen, wat suggereert dat de toename van andere neuropeptiden kan bijdragen aan de downstream resultaten. Samen bieden deze resultaten in vivo genetische demonstratie dat neuropeptiden PNEC functie mediëren.

Als normale alveologenesis begint bij P4 (21), de late verschijning van alveolaire vereenvoudiging bij P15 suggereert dat verstoring van alveologenesis niet een primaire oorzaak kan zijn. Hoewel er geen verandering in celdood werd waargenomen tegen P10, was er een duidelijke vermindering van elastine (fig. S14), wat een mogelijke trigger van vereenvoudiging is (22). Immuuncellen zoals macrofagen brengen matrix metalloproteïnasen tot expressie die elastine afbreken (23). Bovendien wordt de toename van macrofagen waargenomen vóór de vereenvoudiging (fig. S1 en S2), wat de mogelijkheid van een oorzakelijk verband oproept. Om dit te testen, behandelden we Shhcre;Robo en controle longen met clodronaat, een hydrofiel geneesmiddel dat macrofagen uitput (24). Behandeling te beginnen bij P5, voor de immuuncel toename, effectief beperkt alveolaire macrofagen nummers tot basislijn niveau in Shhcre;Robo mutanten (Fig. 4, A tot E). Dit verzwakte de afname van elastine en volledig voorkomen vereenvoudiging (Fig. 4, F tot J, en fig. S15). Samen bieden deze gegevens in vivo bewijs dat verhoogde immuuninfiltraten verantwoordelijk zijn voor alveolaire vereenvoudiging en dat beide stroomafwaartse gevolgen zijn van PNEC disfunctie.

In deze studie presenteren we in vivo genetisch bewijs dat aantoont dat PNECs, ondanks hun zeldzaamheid, een diepgaande invloed hebben op de postnatale longfunctie. Hoewel het PNEC-defect al duidelijk is op E15,5 in de Shhcre;Robo mutant, beginnen de fysiologische gevolgen, beginnend met de up-regulatie van neuropeptiden, pas na de geboorte. Dit suggereert dat het effect van PNEC afhankelijk is van de blootstelling van de longen aan lucht. Aldus schetsen onze bevindingen een modus van signaaltransductie waarin PNECs gevoelige rheostaten zijn op de luchtwegwand die omgevingscues niet-cel-autonoom vertalen in immuunreacties.

Onze resultaten stellen Robo1,2 vast als een set van genen die PNEC clustering in NEBs controleren. Het presenteert ook Slit en Robo als spelers in selectieve celsortering in het epitheel van een zoogdierorgaan. Inactivering van Robo na NEB-vorming leidde ook tot unclustering, wat suggereert dat de clusters actief worden onderhouden. Hoewel Slit-Robo grotendeels bekend zijn om cellulaire afstoting te mediëren, geven onze gegevens aan dat ze PNEC clustering door cellulaire aantrekkingskracht aandrijven. Robo inactivering leidde tot veranderde innervatie en verlies van basaal-biased lokalisatie van neuropeptiden. Deze veranderingen kunnen ten grondslag liggen aan de veranderde downstream impact van PNECs.

Een toename van PNEC aantal is gedocumenteerd in een groot scala van long-geassocieerde ziekten, variërend van zeldzame aandoeningen zoals CDH tot veel voorkomende aandoeningen zoals astma (5-8). Wij merken op dat de Robo mutant PNEC fenotype is verschillend van verhoogde PNEC aantal. Echter, beide zijn geassocieerd met verhoogde neuropeptiden, die we laten zien dat krachtige effectoren van PNEC functie. Onze bevindingen voorspellen dus dat in plaats van een passieve uitlezing van de ziekte, de gedocumenteerde PNEC pathologieën en neuropeptide verhogingen kunnen dienen als actieve bijdrage aan de symptomen in een groot scala van respiratoire ziekten.