PMC
TEST METHODS FOR PHOTOTOXICITY AND ANIMAL ALTERNATIVES
Het is van essentieel belang om de fotoveiligheid van chemische stoffen te garanderen wanneer er kans is op blootstelling van de mens, zoals duidelijk kan worden geïllustreerd door farmaceutische producten (20) of cosmetica (21). Om de potentiële fototoxiciteit van een chemische stof te evalueren, werden verschillende testmethodes ingevoerd, gaande van in silico(22), in chemico(23), in vitro tot in vivo assay. Er zijn in-silicotests ontwikkeld en routinematig gebruikt, zoals ROS-generatie (24), in-vitrotests met onder andere de 3T3 NRU-test en het 3D-epidermismodel, en in-vivostudies waarbij cavia’s, muizen of gepigmenteerde ratten worden gebruikt (25).
Lichtbron voor fototoxiciteit. Lichtbron voor fototoxiciteit is uiterst belangrijk aangezien de door de te onderzoeken stof geabsorbeerde golflengten (absorptiespectrum) en de lichtdosis (haalbaar in een redelijke blootstellingstijd) voldoende moeten zijn om fototoxiciteit te induceren (26). Zonnesimulatoren die natuurlijk zonlicht simuleren, worden beschouwd als de ideale kunstmatige lichtbron (fig. 5).
De stralingsvermogensverdeling van de gefilterde zonnesimulator moet die van het daglicht buiten benaderen. Zonnesimulatoren zijn uitgerust met xenonbogen of (gedoteerde) kwik-metaalhalidebogen. Zij moeten ook naar behoren worden gefilterd om de zeer cytotoxische UVB-golflengten te verzwakken. Het onder deze filters geregistreerde spectrum mag niet afwijken van het gestandaardiseerde daglicht buitenshuis (Specificatie: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Niettemin kunnen ook andere UVA-lichtbronnen zoals UVA-lamp worden gebruikt met een goede UV-dosimeter om de intensiteit en de golflengte te controleren. De intensiteit van het licht (irradiantie) varieert naar gelang van de bronnen, en moet regelmatig vóór elke fototoxiciteitstest worden gecontroleerd met een geschikte breedband-UV-meter. De UV-meter moet vóór elke meting zijn geijkt. Dienovereenkomstig hangt de bestralingstijd af van de intensiteit van de lichtbron (bv. voor een lichtbron van 1,7 mW/cm2 is 50 minuten blootstellingstijd nodig om 5 J/cm2 te bereiken). De bestralingstijd varieert ook naar gelang van de testmethoden. Een dosis van 5 J/cm2 (gemeten in het UVA-bereik) werd niet-cytotoxisch bevonden, maar voldoende krachtig om chemicaliën te prikkelen en fototoxische reacties uit te lokken in de 3T3 Neutral Red-opname-test.
3T3 Neutral red uptake assay. De 3T3 NRU-test is officieel goedgekeurd door de OESO en op 13 april 2004 bekrachtigd als OESO TG432 (3). Deze test evalueert de fotocytotoxiciteit door de relatieve vermindering van de levensvatbaarheid van de cellen te bepalen na blootstelling aan het testvoorwerp in aanwezigheid versus afwezigheid van UV/VIS-straling. Besloten wordt de 3T3 NRU fototoxiciteitstest uit te voeren voor de chemische stoffen die absorptiespectra in het UV/VIS-gebied vertonen wanneer zij in een geschikt oplosmiddel zijn opgelost (17). Er is gesuggereerd dat als de molaire extinctie/absorptiecoëfficiënt minder bedraagt dan 10 liter x mol-1 x cm-1 het onwaarschijnlijk is dat de chemische stof fotoreactief is (bv. in een UV-cuvette met een lichtweg van 1 cm moet de OD van een 0,05 M-oplossing minder dan 0,5 zijn om op basis van de vergelijking “extinctie = extinctiecoëfficiënt x weglengte x concentratie” als niet-fotoreactief te worden beschouwd) (26). De 3T3 NRU-test vertoont een hoge sensitiviteit maar een lage specifieke voorspellende waarde (een sensitiviteit van 93% en een specificiteit van 84%). De 3T3 NRU-test heeft veel beperkingen. Hij kan geen andere nadelige effecten voorspellen dan foto(cyto)toxiciteit die kan ontstaan door de gecombineerde werking van een chemische stof en licht, zoals fotogenotoxiciteit, fotoallergie (fotosensibilisatie) of fotocarcinogeniciteit. De 3T3 NRU-test wordt alleen gebruikt voor gevarenidentificatie, terwijl het nut ervan voor de beoordeling van fototoxische potentie niet gerechtvaardigd is. Met name ontbreekt in dit testsysteem de metabolische activiteit die van cruciaal belang is voor de manifestatie van systemisch blootgestelde chemische stoffen. Daarom wordt voor systemisch blootgestelde chemische stoffen die metabole activering vereisen, zoals monocrotaline, riddelliine en heliotrine (pyrrolizidinealkaloïden) (28), in vivo dieronderzoek aanbevolen (5,29).
Fundamenteel testprincipe van 3T3 NRU is de vergelijking van de levensvatbaarheid van cellen in de aan- of afwezigheid van UV/Vis-bestraling, zoals bepaald met de vitale kleurstof neutraalrood, een zwakke kationische kleurstof die gemakkelijk door celmembranen dringt en zich intracellulair ophoopt in de lysosomen van levensvatbare cellen. De basiscellijn is de Balb/c 3T3 cel, een muizenfibroblast ontwikkeld uit muizenembryo’s door G.T. Todaro in 1968. De benaming 3T3 staat voor “3-daagse transfer, inoculum 3 × 105 cellen” in een schaal van 20 cm2, en deze cel is relatief stabiel, gemakkelijk verkrijgbaar en gemakkelijk te hanteren (30). Huidfibroblast is een van de doelcellen van fototoxiciteit, wat een solide reden is voor het gebruik van 3T3-cellen.
Om te bepalen of het testartikel al dan niet fototoxisch is in de 3T3 NRU-test, moet de concentratie-respons worden verkregen in de aanwezigheid en in de afwezigheid van bestraling. De foto-irritatiefactor (PIF) of het gemiddelde foto-effect (MPE) moet worden berekend (31). PIF is de verhouding van IC50 (concentratie waarbij de levensvatbaarheid van de cellen met 50% afneemt) van niet bestraalde over bestraalde zoals weergegeven in fig. 7.
Wanneer IC50 niet kan worden verkregen, wordt MPE berekend met de volgende vergelijking
PIF < 2 of een MPE < 0,1 voorspelt: “geen fototoxiciteit”. Een PIF > 2 en < 5 of een MPE > 0,1 en < 0,15 voorspelt: “waarschijnlijke fototoxiciteit” en PIF > 5 of een MPE > 0,15 voorspelt: “fototoxiciteit” (fig. 8).
Erytrocytenhemolyseproef. Celmembranen zijn kwetsbaar voor fotochemisch gegenereerde ROS en radicalen. Door UVA veroorzaakte beschadiging van erytrocyten en de daaruit voortvloeiende hemolyse (fotohemolyse) wordt gebruikt om het fototoxische potentieel van testartikelen te beoordelen (32). Rode bloedcellen van schapen (SRBC) worden geïncubeerd met chemicaliën en bestraald met UVA bij 20 J/cm2. Na de bestraling werden de SRBC’s gedurende 2 uur in het donker bij kamertemperatuur geïncubeerd en vervolgens nog eens 1 uur bij 37 ℃, waarna de hemolyse werd gemeten met Drabkin’s reagens en de meting van de UV-absorptie bij 540 nm. De mate van fototoxiciteit werd beoordeeld aan de hand van het vrijkomen van hemoglobine uit SRBC, d.w.z. fotohemolytische activiteit, volgens vergelijking (33).
-
ADE: optische dichtheid van blootgestelde geneesmiddeloplossing met erytrocyten
-
AD: optische dichtheid van blootgestelde geneesmiddeloplossing zonder erytrocyten
-
C: optische dichtheid van 100% hemolytische controleoplossing
Fototoxische stoffen zoals ciprofloxacine, norfloxacine of enoxacine verhogen de fotohemolytische activiteit aanzienlijk tot meer dan 20% bij 100 μg/mL. De gevoeligheid, specificiteit en nauwkeurigheid van deze test bedroegen respectievelijk 67%, 73% en 73% voor 24 chemische stoffen (8 geurstoffen, 5 UV-absorbers, 4 geneesmiddelen, 4 antimicrobiële stoffen en 3 kleurstoffen) in vergelijking met de in-vivotest met cavia’s (34). De lage gevoeligheid kan problematisch zijn en de prestaties zijn veel minder goed dan die van de 3T3 NRU-test, wat het verminderde gebruik van deze test onlangs kan verklaren.
In vitro humaan 3D epidermismodel. Om de beperkingen van in vitro celgebaseerde methoden te overwinnen, wordt 3D gereconstrueerd epidermismodel onderzocht voor toepassing in fototoxiciteitstests (35,36). In principe is het testprincipe vergelijkbaar met de 3T3 NRU-test, namelijk de beoordeling van het verschil in levensvatbaarheid van het weefsel tussen in aanwezigheid en afwezigheid van UV/VIS-straling. Een soortgelijk voorspellingsmodel met gebruikmaking van PIF en MPE kan worden gebruikt (37). In het 3D epidermismodel kunnen echter in water onoplosbare stoffen worden getest en blijft er een zekere mate van metabolische capaciteit behouden in de primaire keratinocyten in de epidermale laag, die kan worden toegepast op de toxische stoffen die metabole activering vereisen (38). Bovendien zijn metingen van de cytokineproductie zoals IL-1β (Interleukine-1β) (39), comet-assay (40) en histologisch onderzoek mogelijk die in aanmerking kunnen worden genomen bij de verdere evaluatie van fotoallergeniciteit en fotocarcinogeniciteit.
In vivo methoden waarbij gebruik wordt gemaakt van cavia’s, muizen of gepigmenteerde ratten. Laboratoriumdieren zoals muizen en cavia’s worden gebruikt om het reële scenario van fototoxiciteit bij de mens na te bootsen. De dieren worden plaatselijk of systemisch blootgesteld aan chemicaliën en bestraald met een geschikte dosis UVA (meestal 10 J/cm2 voor de proef met cavia’s, 20 J/cm2 voor de proef met muizen (41)). Scores van erytheem en oedeem van 0 tot 4 worden bij elkaar opgeteld en de maximale score gedurende 72 uur observatie wordt gemiddeld per dier om de irritatie-index te genereren. De fototoxiciteitsindex wordt verkregen met de vergelijking “Irritatie-index van de met UVA bestraalde plaats – Irritatie-index van de niet bestraalde plaats” (42). Een fototoxiciteitsindex van meer dan 0,6 wijst op mogelijke fototoxiciteit. Als alternatief kan de dikte van het oor worden gemeten om oedeem in muizenproeven te schatten. Deze in vivo tests zijn een goede afspiegeling van het pathofysiologische proces van fototoxiciteit bij de mens, maar de opoffering van dieren, de kosten en de tijd die nodig zijn om de test uit te voeren, leveren veel problemen op, vooral in het tijdperk van een wijdverbreid bewustzijn van dierenwelzijn en ethiek. Niet op dieren gebaseerde fototoxiciteitstests winnen tegenwoordig aan populariteit om deze problemen te ondervangen (43).
In chemico methoden voor fototoxiciteitsevaluatie. Celvrije reageerbuismethoden, namelijk in chemico zijn onderzocht om de fototoxiciteit te beoordelen. Informatie over lichtabsorptie en fotostabiliteit van testartikelen is geanalyseerd om de fototoxiciteit te voorspellen (44). Door gebruik te maken van de generatie van reactieve zuurstofspecies tijdens de fotoexcitatie en de daaropvolgende fotoreactie kan het fototoxische potentieel van een chemische stof in chemico worden geëvalueerd (12). Singlet zuurstof wordt gedetecteerd door p-nitrosodimethylaniline (RNO) te bleken, terwijl de nitroblauwtetrazoliumtest (NBT-formazanreactie) wordt gebruikt om de peroxideproductie te bepalen, zoals hieronder is afgebeeld (24),
-
Singletzuurstof + imidazool
-
→ geoxideerd imidazool
-
+ RNO
-
→ RNO-bleken + producten
ROS-genereerbaarheidstest vertoonde een gevoeligheid en specificiteit van 90% en 76.9% voor cosmetica en 100% en 75% voor niet-cosmetische chemicaliën. Het afbreken van DNA-strengen is een andere manier om de door UV veroorzaakte fototoxiciteit van verschillende soorten chemicaliën of geneesmiddelen in chemisch onderzoek te evalueren door het kwantificeren van open of gesloten circulair DNA. Ook voor deze bepaling zijn geen levende cellen of weefsels nodig, maar plasmide. Plasmide wordt opgelost in buffer en vermengd met teststoffen. Nadat het mengsel met UV is bestraald, worden de monsters aan elektroforese onderworpen. De hoeveelheid gebroken DNA wordt geanalyseerd met behulp van fluorescentie-gebaseerde technologie. Door UV geïnduceerde fototoxische verbinding leidt tot het openbreken van DNA-strengen en dit is afhankelijk van de concentratie van het geneesmiddel en de UV-bestralingsdosis (33). Voor deze tests zijn geen levende cellen of weefsels nodig, wat de variabiliteit van de testresultaten kan vergroten. Deze methoden hebben echter beperkingen, zoals het ontbreken van metabole activeringscapaciteit, ontoepasbaarheid van in water onoplosbare materialen (oliën, vaste stoffen, gels, geformuleerde producten), en het onvermogen om fotogenotoxiciteit, fotoallergie (fotosensibilisatie) of fotocarcinogeniteit te voorspellen. Deze test is beperkt tot gevarenidentificatie, niet tot een beoordeling van de fototoxische potentie.