PMC
Het gebruik van NEBcutter
NEBcutter accepteert een input sequentie, die kan worden ingeplakt, opgehaald uit een lokaal bestand of opgehaald van NCBI als een GenBank bestand via zijn toetredingsnummer. Er zijn verschillende opties beschikbaar om de grootte van de weer te geven ORF’s en de set van te gebruiken restrictie-enzymen te selecteren. Het programma berekent de posities van alle restrictie-enzymplaatsen, met uitzondering van die welke mogelijk geblokkeerd kunnen worden door overlappende methylering, en vindt de ORF’s in de sequentie. Vervolgens toont het een schematisch diagram van de sequentie, de lange ORF’s, gebaseerd op de in de Methoden beschreven regels en alle restrictie-enzymen die de sequentie slechts één keer doorsnijden. De eerste weergave toont ook de enzymen die in een volledige digest kunnen worden gebruikt om elke weergegeven ORF te exciseren. Figuur11 toont een typische digest, in dit geval een lineaire weergave van het plasmide pBR322. Als de oorspronkelijke DNA-sequentie circulair is, worden zowel lineaire als circulaire weergaven aangeboden. Vanuit de initiële weergave zijn er vele opties om verder te gaan, inclusief aangepaste digestie met enzymen naar keuze en verschillende weergaven van de digest. Het is ook mogelijk om, vanuit lineaire weergaven, in te zoomen op een geselecteerde regio van de sequentie voor een meer gedetailleerde weergave. Eén optie maakt het mogelijk een bepaald gebied te selecteren en de enzymen weer te geven die onmiddellijk naast dat gebied snijden. Dit is nuttig om enzymen te vinden die in staat zijn de gewenste regio te knippen. Als het zoomen leidt tot een regio van <60 nucleotiden, wordt de eigenlijke sequentie weergegeven (fig. (fig.2),2), samen met een eventuele vertaling. Op deze display worden alle enzymen getoond die de sequentie doorsnijden, alle basen die deel uitmaken van een herkenningssequentie van een restrictie-enzym zijn gemarkeerd en door met de muis over een enzymnaam te bewegen verschijnt een vakje met de herkenningssequentie genoteerd en wordt de sequentie zelf onderstreept in de display.
De lineaire weergave van een digest van het plasmide pBR322. Merk op dat de twee belangrijkste ORF’s worden geflankeerd door sites (MseI en PflMI; BspHI en EarI) die kunnen worden gebruikt om ze uit de volledige plasmidesequentie te excideren. In deze weergave worden alleen enzymen getoond die de sequentie eenmaal splijten. Opties voor verdere digestie en weergave zijn beschikbaar via de knoppen onderin de weergave.
Invergrote weergave van een korte regio van pBR322. Merk op dat de rood en blauw gemarkeerde basen delen van de restrictie-enzymherkenningsplaatsen vormen. De rode zijn ondubbelzinnig, terwijl de blauwe degenerate basen zijn. Zo herkent BsiEI de sequentie CGRYCG. De buitenste CG-residuen zijn invariant, terwijl de binnenste basen ontaard zijn en, in de getoonde specifieke sequentie, GT zijn. De in het zwart weergegeven basen maken geen deel uit van een herkenningsplaats van een restrictie-enzym. Deze weergave kan nuttig zijn om restrictie-enzymen te vinden die SNP-allelen kunnen onderscheiden.
Op elk hoofdscherm wordt door met de muis over de naam van een restrictie-enzym te gaan de herkenningsvolgorde ervan getoond, alsmede het precieze basennummer waarop het splitst. Als er meer dan één site voor het enzym aanwezig is, zijn alle andere sites onderstreept. Klikken op de enzymnaam levert een pagina op met een samenvatting van informatie over het enzym, waaronder de methyleringsgevoeligheid, de soorten eindpunten die worden geproduceerd, de isoschizomeren die beschikbaar zijn en een lijst van andere enzymen die compatibele eindpunten kunnen produceren. Voor NEB-enzymen wordt informatie over ontsluitingscondities en een link naar de NEB-website gegeven.
Een belangrijk kenmerk van NEBcutter is dat het alles integreert wat in REBASE is vastgelegd over de methyleringsgevoeligheid van elk van de weergegeven enzymen wanneer deze een Dam-site (GATC), een Dcm-site (CCWGG), een CpG-site, een EcoKI-site (AACN6GTGC) of een EcoBI-site (TGAN8TGCT) overlappen. Wanneer theoretische digesties worden uitgevoerd, bevatten de resultaten een vergelijking van de effecten van methylering, waarbij de banden die verschuiven worden aangegeven (fig. (fig.33).
Een theoretische digestie die de effecten laat zien van overlappende Dcm-methylering op de MscI-locaties (herkenningssequentie: TGGCCA) die in de sequentie aanwezig zijn, als de bacteriofaag lambda was gekweekt in een E.coli-stam die het Dcm-methyltransferase tot expressie brengt (herkenningssequentie: CCWGG). Fragmenten die door Dcm-methylering zijn aangetast, zijn in rood aangegeven. De virtuele gel is gebaseerd op interpolatie van een kubische spline curve die is gegenereerd uit experimentele gegevens die zijn geproduceerd met fragmenten van bekende grootte.
Op elke pagina zijn hot links aangebracht die terugleiden naar de hoofdpagina, hulp bieden bij de interpretatie van de weergave of gebruikers in staat stellen commentaar naar de auteurs te sturen. De interface is ontworpen om zo intuïtief mogelijk te zijn en om gemakkelijk toegang te bieden tot de belangrijkste functies die nuttig zijn voor onderzoekers die proberen hun DNA te klieven. De huidige versie van NEBcutter heeft meer dan 400.000 sequenties van gebruikers verwerkt. Wij bereiden momenteel een aantal verbeteringen aan NEBcutter voor en versie 2.0 is gepland voor release op 1 juli.