PMC
Het behoud van genomische stabiliteit is essentieel voor het voorkomen van onnodige celdood of neoplasie (Cassidy en Venkitaraman, 2012). Kritieke DNA-beschadigingen, zoals dubbelstrengsbreuken (DSB’s), activeren de DNA-schaderespons (DDR) – een wijdvertakt signaalnetwerk dat DNA-herstel, activering van controlepunten van de celcyclus en uitgebreide modulatie van genexpressie en vele metabolische routes omvat (Ciccia en Elledge, 2010; Hiom, 2010). DSB’s worden geïnduceerd door ioniserende straling, radiomimetische chemicaliën en endogene zuurstofradicalen. Ze gaan gepaard met het vastlopen van de replicatievork en worden gevormd en weer gesloten bij meiotische recombinatie en de herschikking van de antigeenreceptorgenen tijdens de ontwikkeling van het immuunsysteem. De belangrijkste herstelroutes voor DSB’s zijn foutgevoelige nonhomologous end joining (NHEJ) of high-fidelity homologe recombinatie reparatie (HRR; Holthausen et al., 2010; Lieber, 2010). Het brede, krachtige signaalnetwerk dat door DSB’s wordt opgeroepen, begint met de snelle accumulatie op DSB-locaties van een grote groep eiwitten die “sensoren” of “moderatoren” worden genoemd en gaat verder met de activering van verschillende eiwitkinasen (“transducers”) met gedeeltelijk redundante functies die het signaal doorgeven aan tal van downstream-effectoren, die meestal belangrijke spelers zijn in de verschillende DDR-takken (Lovejoy en Cortez, 2009; Ciccia en Elledge, 2010; Lukas et al,
De primaire transducer van het DSB-alarm is het serine-threonine kinase ataxia telangiectasia (A-T) mutated (ATM; Banin et al., 1998; Canman et al., 1998), dat wordt geactiveerd in reactie op DSB-inductie (Bakkenist en Kastan, 2003) en vervolgens een overvloed aan substraten fosforyleert (Matsuoka et al., 2007; Bensimon et al., 2010). ATM behoort tot een geconserveerde familie van fosfoinositide 3-kinase-achtige eiwitkinasen (PIKK’s) waartoe onder andere twee andere belangrijke DDR-transductoren behoren: de katalytische subeenheid van het DNA-afhankelijke eiwitkinase (DNA-PKcs) en ATR (ataxia telangiectasie en Rad3-gerelateerd). Deze drie kinasen onderhouden nauwe functionele relaties (Lovejoy en Cortez, 2009). Recent bewijs suggereert dat ATM’s brede capaciteit als proteïnekinase het mogelijk maakt om andere processen te reguleren, zoals oxidatieve stress niveaus (Guo et al., 2010), en een rol te spelen in cytoplasmatische, niet-DDR arena’s, waaronder mitochondriale homeostase (Yang et al., 2011; Valentin-Vega en Kastan, 2012; Valentin-Vega et al., 2012).
Menselijke kiembaanmutaties die cellulaire reacties op DNA-schade ondermijnen, veroorzaken ernstige genomische instabiliteitssyndromen (Jeppesen et al., 2011). Het ATM gen is gemuteerd in het genomische instabiliteit syndroom, A-T (Savitsky et al., 1995). A-T wordt gekenmerkt door progressieve neurodegeneratie, immunodeficiëntie, aanleg voor kanker, genomische instabiliteit, en gevoeligheid voor DSB-inducerende agentia (McKinnon, 2012). De ziekte wordt veroorzaakt door null ATM-mutaties, en de patiënten vertonen meestal een volledig verlies van het ATM-eiwit (Gilad et al., 1996).
Studies naar ATM-afhankelijke processen zijn meestal gebaseerd op menselijke wild-type versus A-T-cellen, ATM knockdown met behulp van RNAi, reconstitutie van ATM-deficiënte cellen door ectopische expressie van wild-type of kinase-dood ATM-eiwit, of het behandelen van gekweekte cellen met ATM-remmers. Laboratoria die deze experimentele systemen gebruiken zijn al lang van mening dat de fysiologische gevolgen van ATM-verlies ten opzichte van het hosten van inactief ATM mogelijk niet vergelijkbaar zijn (Choi et al., 2010). De artikels van Daniel et al. en Yamamoto et al. (beide in dit nummer) leveren solide bewijs voor deze opvatting en betekenen een keerpunt in onze kijk op de werking van ATM. Beide werken zijn gebaseerd op het manipuleren van het Atm gen in de muis.
Atm knockout muizen bestaan al lang. Deze muizen vertonen de meeste symptomen van A-T, waaronder een laag lichaamsgewicht, steriliteit, stralingsgevoeligheid en aanleg voor kanker, maar de neurodegeneratie is bij deze dieren aanzienlijk minder uitgesproken dan bij menselijke A-T patiënten (Barlow et al., 1996; Elson et al., 1996; Xu et al., 1996; Borghesani et al., 2000). Aldus, vóór het ontstaan van kanker en zonder blootstelling aan straling, is het murine Atm-/- fenotype relatief matig. Met behulp van mutant Atm transgene expressie in een Atm-/- achtergrond (Daniel et al., 2012) en via directe knockin (Yamamoto et al., 2012), genereerden de twee groepen nieuwe muizenstammen die Atm activiteit missen; in plaats van verstoken te zijn van Atm, brengen deze dieren fysiologische niveaus van katalytisch inactief (kinase dood) eiwit tot expressie. Opvallend is dat in beide laboratoria dit genotype leidde tot vroege embryonale letaliteit, met een inherente genomische instabiliteit die hoger was dan die waargenomen in Atm-/- dieren (Fig. 1). Voorwaardelijke expressie van het gemuteerde eiwit in het immuunsysteem verminderde de efficiëntie van V(D)J (variable, diversity, and joining) recombinatie en immunoglobuline klasse switching-twee processen die de NHEJ-route van DSB reparatie betrekken en actieve ATM vereisen voor een optimale werking. Deze vermindering was echter vergelijkbaar met die veroorzaakt door afwezigheid van Atm. De gegevens van beide laboratoria suggereren dat de HRR-route van DSB-herstel, in plaats van NHEJ, in grotere mate kan worden beïnvloed door de aanwezigheid van inactief Atm in vergelijking met het effect verkregen na het verlies van Atm.
Phenotypische vergelijking van muizen Atm-genotypes. Muizen die een inactief eiwit tot expressie brengen als hun enige bron van Atm, sterven in utero (Daniel et al., 2012; Yamamoto et al. 2012). Heterozygoten lijken op wild-type (WT) dieren, wat wijst op het ontbreken van een dominant-negatief effect. HRR, homoloog recombinatieherstel; kd, kinase dood.
Dit dramatische fenotype wordt vermoedelijk veroorzaakt door een ernstig defect van de DDR, wat eens te meer het belang ervan in de vroege ontwikkeling aantoont. De cruciale rol van de DDR in de ontwikkeling is in het verleden reeds gedocumenteerd (Phillips en McKinnon, 2007), maar de nieuwigheid van de huidige studies ligt in het grote verschil tussen het verlies van Atm en de aanwezigheid van katalytisch inactief Atm. Hetzelfde geldt waarschijnlijk ook voor de mens: A-T patiënten vertonen typisch ATM verlies, en in zeldzame gevallen van katalytisch inactief ATM in patiënten, is het niveau laag genoeg om levensvatbaarheid toe te laten. Een soortgelijke waarneming werd onlangs gedaan door Zhang et al. (2011) met een ander lid van de PIKK-familie-DNA-PKcs. Deze groep ontdekte dat muizen die een gemuteerde versie van DNA-PKcs tot expressie brengen, waarin drie fosforyleringsplaatsen ontbreken die geassocieerd zijn met de activering, kort na de geboorte sterven ten gevolge van beenmergfalen. Het is interessant op te merken dat, in tegenstelling hiermee, het afschaffen van drie fosforylatieplaatsen in muis-Atm, waarvan de equivalenten in humaan ATM worden gefosforyleerd tijdens de activering (Bakkenist en Kastan, 2003; Kozlov et al., 2006), niet resulteerde in enig waarneembaar fenotype (Pellegrini et al., 2006; Daniel et al., 2008).
Het lijkt er dus op dat de aanwezigheid van fysiologische niveaus van inactief Atm ernstig interfereert met de DDR, zeker meer dan de afwezigheid ervan. Waarom zou dit zo zijn? Hoewel het exacte mechanisme van dit fenomeen onbekend is, kunnen enkele veronderstellingen worden gemaakt. ATM wordt gerekruteerd op DSB plaatsen (Andegeko et al., 2001) en is daarom aanwezig in de enorme nucleaire foci die deze plaatsen omsluiten. Veel ATM-gemedieerde fosforylaties vinden plaats binnen deze eiwitconglomeraten. Belangrijk is dat de rekrutering van kinase-dode Atm naar plaatsen van DNA-schade door Daniel et al. (2012) en Yamamoto et al. (2012) normaal bleek te verlopen. Het is mogelijk dat de aanwezigheid van katalytisch inactief Atm binnen deze DDR-hubs het vermogen van de cel om op de schade te reageren ernstig verstoort. Vermoedelijk verstoort het de geordende temporele dynamiek van gebeurtenissen binnen deze eiwitfabrieken (Lukas et al., 2011). Een beter begrip van de ruimtelijke organisatie van deze eiwitstructuren (Chapman et al., 2012) en de temporele hiërarchie van de gebeurtenissen binnen deze structuren kan opheldering verschaffen over de rol van ATM, niet alleen als enzym maar ook als eiwitgroep in deze structuren. ATM is een groot eiwit van 3.056 residuen, waarvan ∼10% de actieve site vormt. De regulerende functies van de resterende 90% van dit polypeptide zijn grotendeels onduidelijk. In ruimere zin tonen deze studies overtuigend aan, op het niveau van het organisme, dat het verlies van een enzym versus het feit dat het inactief in de cel verblijft, werelden van verschil kunnen zijn. In dit verband zou het interessant zijn de ontwikkeling van maligniteiten te volgen bij dieren die de mutant Atm in hun lymfoïde systeem tot expressie brengen. Dit is bijzonder belangrijk omdat de maligniteiten die bij Atm-/- muizen worden waargenomen, net als bij A-T patiënten, hoofdzakelijk lymfoïde zijn.
De implicaties voor ATM-gerelateerd translationeel onderzoek zijn opmerkelijk. ATM is van nature beschouwd als een potentieel doelwit om te worden geïnactiveerd in tumorcellen om ze selectief gevoelig te maken voor radiotherapie (Begg et al., 2011; Basu et al., 2012; Golding et al., 2012). De komst van efficiënte ATM-remmers (Hickson et al., 2004; Golding et al., 2009) heeft deze hoop verder aangewakkerd. Het goede nieuws is dat het effect van deze remmers op de stralingsgevoeligheid van de cellen (en waarschijnlijk ook op het algemeen welzijn) wel eens groter zou kunnen zijn dan eerder werd aangenomen, op voorwaarde dat deze kleine moleculen specifiek op de kwaadaardige cellen kunnen worden gericht. Anderzijds kan blootstelling van normaal, prolifererend lichaamsweefsel aan ATM-remmers ongewenst zijn, afhankelijk van het type weefsel. Een dergelijke blootstelling van normaal weefsel aan ATM-remming, zelfs als die maar kort duurt, zou kunnen leiden tot aanzienlijke genomische instabiliteit – een potentiële drijvende kracht in de richting van nieuwe kwaadaardigheid.