Het centrale dogma in de moleculaire biologie is DNA→RNA→Eiwit. Om een bepaald eiwit te synthetiseren moet DNA eerst worden getranscribeerd in boodschapper-RNA (mRNA). mRNA kan vervolgens in het ribosoom worden vertaald in polypeptideketens die de primaire structuur van eiwitten vormen. De meeste eiwitten worden vervolgens gemodificeerd via een reeks post-translationele modificaties, waaronder eiwitvouwing, vorming van disulfidebruggen, glycosylering en acetylering, om functionele, stabiele eiwitten te creëren. Eiwitexpressie verwijst naar de tweede stap van dit proces: de synthese van eiwitten uit mRNA en de toevoeging van post-translationele modificaties

Lees meer moleculaire biologie in ons eBook Plasmiden 101!

Onderzoekers gebruiken verschillende technieken om eiwitexpressie te controleren voor experimentele, biotechnologische, en medische toepassingen. Onderzoekers kunnen eiwitten in vivo visualiseren door ze te taggen met fluorescerende eiwitten om lokalisatie te bestuderen of eiwitten zuiveren om hun structuur, interacties en functies te bestuderen. Eiwitten kunnen ook worden gezuiverd voor gebruik in moleculair biologisch onderzoek (b.v. polymerasen en andere enzymen kunnen worden gezuiverd en gebruikt om DNA te manipuleren), of in de geneeskunde (b.v. insuline).

Eiwitten moeten, in tegenstelling tot DNA dat betrekkelijk gemakkelijk kan worden gesynthetiseerd, worden geproduceerd met behulp van complexe mengsels die afkomstig zijn van cellen of met behulp van levende cellen. Er zijn verschillende soorten expressiesystemen die voor de produktie en zuivering van proteïnen worden gebruikt. Deze omvatten zoogdier-, insecten-, bacterie-, planten-, gist- en celvrije expressiesystemen.

In het algemeen bestaat de algemene strategie voor eiwitexpressie uit het transfecteren van cellen met het door u gekozen DNA-sjabloon en deze cellen het door u gewenste eiwit te laten transcriberen, vertalen en modificeren. Gemodificeerde eiwitten kunnen vervolgens worden geëxtraheerd uit gelyseerde cellen door het gebruik van eiwit tags en gescheiden van verontreinigingen met behulp van een verscheidenheid van zuiveringsmethoden. De keuze van het expressiesysteem hangt af van verschillende factoren:

1. Het eiwit dat u probeert uit te drukken
2. Hoeveel eiwit u nodig hebt
3. Uw plannen voor downstream-toepassingen

In deze blogpost zullen we een aantal van de meer gebruikelijke expressiesystemen samenvatten, inclusief hun voordelen en waarschuwingen om in gedachten te houden voordat u een systeem kiest.

Mammalia-expressiesystemen

Mammalia cellen zijn een ideaal systeem voor de expressie van zoogdiereiwitten die meerdere post-translatie modificaties vereisen voor een goede eiwitfunctie. De meeste DNA-constructies ontworpen voor zoogdierexpressie maken gebruik van virale promotors (SV40, CMV, en RSV) voor robuuste expressie na transfectie. Zoogdiersystemen kunnen eiwitten zowel transiënt als via stabiele cellijnen tot expressie brengen. Beide methoden produceren hoge eiwitopbrengsten als de transfectie succesvol is.

Sommige zoogdiersystemen maken ook controle mogelijk over wanneer een eiwit tot expressie komt door het gebruik van constitutieve en induceerbare promotors. Induceerbare promotors zijn uiterst nuttig indien een gewenst eiwitproduct bij hoge concentraties toxisch is voor de cellen. Ondanks hun voordelen vereisen zoogdierexpressiesystemen veeleisende celcultuuromstandigheden in vergelijking met andere systemen.

Insectenexpressiesystemen

Insectencellen kunnen ook worden gebruikt om complexe eukaryote eiwitten te produceren met de juiste post-translationele modificaties. Er zijn twee soorten expressiesystemen voor insecten: met baculovirus geïnfecteerde en niet-lytische insectencellen.

Baculovirus expressiesystemen zijn zeer krachtig voor recombinante eiwitexpressie op hoog niveau. Deze systemen maken een hoge expressie mogelijk van zeer complexe, geglycosyleerde eiwitten die niet in E. coli- of gistcellen kunnen worden geproduceerd. Het enige probleem met baculovirussystemen is dat de geïnfecteerde gastheercel uiteindelijk wordt gelyseerd. Cellyse stopt de eiwitproductie, maar er zijn niet-lytische expressiesystemen voor insectencellen (sf9, Sf21, Hi-5 cellen) die continue expressie mogelijk maken van genen die in het genoom van de insectencel zijn geïntegreerd. Beide soorten insectenexpressiesystemen kunnen worden opgeschaald voor de productie van grote hoeveelheden eiwit.

De nadelen van expressiesystemen met insectencellen zijn onder meer dat de virusproductie vrij tijdrovend kan zijn en dat insectencellen veeleisende kweekomstandigheden vereisen, vergelijkbaar met expressiesystemen met zoogdieren.

Bacteriële expressiesystemen

Wanneer men snel en goedkoop grote hoeveelheden eiwitten wil produceren, is een bacteriële gastheercel bijna altijd het antwoord. E. coli is zeker een van de meest populaire gastheren voor eiwitexpressie met verschillende stammen die gespecialiseerd zijn voor eiwitexpressie. Eiwitexpressie in bacteriën is vrij eenvoudig; DNA dat codeert voor het gewenste eiwit wordt in een plasmide-expressievector ingebracht, die vervolgens in een bacteriecel wordt getransformeerd. Getransformeerde cellen planten zich voort, worden geïnduceerd om het gewenste eiwit te produceren, en worden vervolgens gelyseerd. Eiwit kan dan worden gezuiverd uit de cellulaire debris.

Er zijn verschillende populaire DNA-vectoren die kunnen worden gebruikt om grote hoeveelheden eiwit te produceren in bacteriële cellen: de pET, pRSET, Gateway pDEST, en pBAD vectoren bijvoorbeeld. Eiwitexpressie van elk van deze vectoren wordt gecontroleerd door een verschillende promotor, wat resulteert in verschillende expressieniveaus van elke vector; lagere expressie kan nodig zijn als uw eiwit toxisch is voor E. coli. Van alle vectoren levert pET, onder de controle van de T7 lac promoter en geïnduceerd door lactose, het hoogste niveau van eiwitexpressie.

Ondanks hun gebruiksgemak is het belangrijk op te merken dat bacteriën gewoonlijk geen functionele multi-domein zoogdiereiwitten kunnen produceren, aangezien bacteriële cellen niet zijn uitgerust om de juiste post-translationele modificaties toe te voegen. Bovendien worden vele door bacteriën geproduceerde eiwitten onoplosbaar en vormen insluitlichamen die moeilijk te extraheren zijn zonder agressieve reagentia en geduld.

Plantaardige expressiesystemen

Planten bieden een goedkoop en low-tech middel voor massale expressie van recombinante eiwitten. Veel cellen van verschillende soorten planten, zoals maïs, tabak, rijst, suikerriet, en zelfs knollen van aardappelen zijn gebruikt voor eiwitexpressie.

Plant systemen hebben veel van dezelfde kenmerken en verwerkingseisen als zoogdiercel expressiesystemen, met inbegrip van de meerderheid van complexe post-translationele modificaties. Extractie en zuivering van recombinante eiwitten uit planten kan echter duur en tijdrovend zijn, aangezien plantenweefsels zelf biochemisch complex zijn.

Om deze problemen te omzeilen, hebben wetenschappers gebruik gemaakt van de natuurlijke afscheiding van biochemicaliën en eiwitten door plantenwortels. Door recombinante eiwitten te taggen met een natuurlijk afgescheiden plantenpeptide kan een gewenst eiwit gemakkelijker worden opgezuiverd. Ondanks het feit dat het een vrij opkomende technologie is, zijn plantencellen gebruikt om een breed scala van eiwitten tot expressie te brengen, waaronder antilichamen en farmaceutische producten, met name interleukines.

Gist expressiesystemen

Gist is een geweldig expressiesysteem om grote hoeveelheden recombinante eukaryotische eiwitten te genereren. Hoewel vele soorten gist voor eiwitexpressie kunnen worden gebruikt, is S. cerevisiae de betrouwbaarste en meest gebruikte soort vanwege zijn gebruik als modelorganisme in de genetica en biochemie.

Wanneer S. cerevisiae wordt gebruikt, plaatsen onderzoekers recombinante eiwitten vaak onder de controle van de galactose-induceerbare promotor (GAL). Andere veelgebruikte promotors zijn de fosfaat- en koperinduceerbare PHO5- respectievelijk CUP1-promotors. Gistcellen worden gekweekt in goed gedefinieerde media en kunnen gemakkelijk worden aangepast aan fermentatie, waardoor een grootschalige, stabiele productie van eiwitten mogelijk wordt.

In het algemeen zijn expressiesystemen van gist gemakkelijker en goedkoper om mee te werken dan zoogdiercellen, en zijn ze vaak in staat om complexe eiwitten te modificeren, in tegenstelling tot bacteriële systemen. Gistcellen hebben echter een tragere groeisnelheid dan bacteriële cellen en de groeiomstandigheden moeten vaak worden geoptimaliseerd. Gistcellen staan er ook om bekend eiwitten te hyperglycosyleren, wat een probleem kan zijn, afhankelijk van het door u gekozen eiwit.

Cell free expression systems

In cell-free expression systems worden eiwitten in vitro geassembleerd met gezuiverde componenten van de transcriptie- en translatiemachine. Hiertoe behoren ribosomen, RNA-polymerase, tRNA’s, ribonucleotiden en aminozuren. Celvrije expressiesystemen zijn ideaal voor snelle assemblage van meer dan één eiwit in één reactie. Een groot voordeel van deze systemen is dat zij eiwitten kunnen assembleren met gelabelde of gemodificeerde aminozuren die bruikbaar zijn in verschillende downstream-toepassingen. Celvrije expressiesystemen zijn echter duur en technisch zeer uitdagend in het gebruik.

Alyssa D. Cecchetelli is een wetenschapper bij Addgene. Ze is gepromoveerd aan de Northeastern University en is vooral geïnteresseerd in celsignalering en communicatie. Ze vindt het geweldig om de wetenschappelijke gemeenschap te kunnen helpen bij het delen van plasmiden.

Aanvullende bronnen

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Recombinante eiwitexpressie in Escherichia coli: vooruitgang en uitdagingen
• Productie van recombinante eiwitten in plantenwortelexudaten