Abstract

De effecten van modafinil (MD) op gedrag en oxidatieve schade aan eiwit en lipide in de hersenen van ratten werden geëvalueerd. Wistar ratten kregen een eenmalige toediening via een maagsonde van water of MD (75, 150, of 300 mg/kg). Gedragsparameters werden geëvalueerd in open-veld toestellen 1, 2, en 3 uur na toediening van het geneesmiddel. Thiobarbituurzuur reactieve stoffen (TBARS) en proteïne carbonyl vorming werden gemeten in de hersenen. MD verhoogde de locomotorische activiteit bij de hoogste dosis 1 en 3 uur na toediening. MD toediening in de dosis van 300 mg/kg verhoogde het bezoek aan het centrum van het open veld 1 uur na toediening; echter, 3 uur na toediening verhoogden alle toegediende doses MD het bezoek aan het centrum van het open veld. MD 300 mg / kg verhoogde lipide schade in de amygdala, hippocampus, en het striatum. Bovendien verhoogde MD de eiwitschade in de prefrontale cortex, amygdala en hippocampus; dit effect varieert echter afhankelijk van de toegediende dosis. Daarentegen verminderde de toediening van MD 75 en 300 mg/kg de proteïneschade in het striatum. Deze studie toonde aan dat de toediening van MD gedragsveranderingen teweegbrengt, die afhankelijk waren van de gebruikte dosis. Bovendien leken de effecten van MD op oxidatieve schadeparameters in specifieke hersenregio’s en doses te zijn.

1. Inleiding

Modafinil (MD) is een niet-amfetaminerge psychoactieve drug die vaak wordt voorgeschreven voor de behandeling van slaap, zoals narcolepsie, obstructief slaapapneusyndroom, en slaapstoornis in ploegendienst . Bovendien is in de literatuur goed beschreven dat MD de functie in een aantal cognitieve domeinen verbetert, evenals het werkgeheugen en het episodisch geheugen . Deze effecten van MD op het geheugen zijn ook beschreven bij psychiatrische patiënten, wat suggereert dat dit geneesmiddel een uitstekend kandidaat-middel is voor de behandeling van cognitieve disfunctie bij psychiatrische stoornissen . Bovendien heeft klinisch onderzoek aangetoond dat MD symptomen verbetert bij patiënten met zware depressie, bipolaire stoornis, schizofrenie, en aandachtstekort/hyperactiviteitsstoornis (ADHD) .

Het werkingsmechanisme van MD wordt slecht begrepen; het is echter bekend dat dit geneesmiddel een belangrijk effect heeft op catecholamines, serotonine, glutamaat, gamma-amino-boterzuur, orexine, en histamine systemen in de hersenen . Bovendien blijkt uit onderzoek dat MD de dopaminetransporter remt, waardoor de dopaminerge neurotransmissie in de waakzaamheidscircuits toeneemt. Van psychostimulantia zoals amfetamine, die ook inwerken op verschillende neurotransmittersystemen, is aangetoond dat ze een uitgesproken effect hebben op het gedrag, waaronder het opwekken van angst, bezorgdheid en hyperactiviteit . MD heeft echter minder last van bijwerkingen zoals hyperactiviteit, angst, nervositeit of rebound-effecten dan de traditionele stimulantia.

Verschillende studies suggereerden dat toediening van psychostimulantia kan leiden tot oxidatieve stress in de hersenen van ratten. De hersenen zijn bijzonder kwetsbaar voor de productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), omdat ze 20% van de totale hoeveelheid zuurstof in het lichaam metaboliseren en een beperkte hoeveelheid antioxidantcapaciteit hebben. Chronische toediening van psychostimulantia zoals methylfenidaat, m-amfetamine en d-amfetamine bij ratten induceerde verhoogde superoxideproductie, oxidatieve schade aan eiwit, lipide en DNA, en veranderingen in enzymen antioxidanten en de mitochondriale ademhalingsketen complexen .

Daarom was het doel van deze studie het evalueren van het effect van MD op gedrag en oxidatieve stress parameters in de hippocampus, prefrontale cortex, amygdala, en het striatum van ratten.

2. Experimentele Methoden

2.1. Dieren

De proefpersonen waren volwassen mannelijke Wistar ratten (met een gewicht van 250-350 g) verkregen uit onze fokkolonie. Dieren werden gehuisvest als vijf in een kooi met voedsel en water beschikbaar ad libitum en werden onderhouden op een 12 h licht / donker cyclus (lichten aan om 7:00 uur) bij een temperatuur van °C. Alle experimentele procedures werden uitgevoerd in overeenstemming met de goedkeuring van de plaatselijke ethische commissie voor het gebruik van dieren aan de Universidade do Extremo Sul Catarinense. Alle experimenten werden uitgevoerd op hetzelfde tijdstip gedurende de dag om circadiane variaties te vermijden.

2.2. Geneesmiddelen en farmacologische procedures

De MD (Libbs Farmacêutica Ltda) werd gesuspendeerd in het voertuig-vehikel: 1% methylcellulose in water. De oplossingen werden onmiddellijk voor gebruik bereid en werden tijdens de experimentele sessie tegen het licht beschermd. De gesuspendeerde oplossing werd gedurende de gehele injectieperiode geagiteerd. De controlegroep kreeg het medium.

2.3. Experimentele opzet

Het totale aantal ratten dat in dit experiment werd gebruikt was 40 ( dieren per groep). De dieren kregen een eenmalige dosis MD (75, 100, of 300 mg/kg lichaamsgewicht) in een volume van 1 ml/kg, toegediend via een maagsonde. De controlegroep kreeg een medium in een volume van 1 ml/kg. Locomotorische activiteit werd gemeten 1, 2, en 3 uur na de injectie, en de ratten werden gedood door decapitatie direct na de open-veld taak.

2.4. Locomotorische activiteit

Locomotorische activiteit werd beoordeeld met behulp van de open-veld taak zoals eerder beschreven. Deze taak werd uitgevoerd in een 40 × 60 cm open-veld omgeven door 50 cm hoge muren, gemaakt van bruin multiplex, met de vloer verdeeld in 9 gelijke vierkanten door zwarte lijnen. De dieren werden voorzichtig geplaatst op de linker achterste rechthoek en vrijgelaten om de arena te verkennen gedurende 5 minuten. In de open-veld test, werden de volgende gedragsparameters beoordeeld.

Crossings (locomotorische activiteit/horizontale activiteit): het totale aantal vierkanten gekruist door ratten in de hele test periode werd geteld.

Rearings (verkennende activiteit/verticale activiteit): het totale aantal rechtopstaande houding van ratten in de hele test periode werd geteld.

Bezoeken aan het centrum van open-veld: het totale aantal bezoeken aan het centrum van open-veld werd geteld. Een vierkant van cm in het midden werd gedefinieerd als het “centrum”-gebied van het veld.

2.5. Meting van oxidatieve schade markers

Ratten werden behandeld met MD of water zoals hierboven beschreven en werden gedood door onthoofding 3 uur na de laatste injectie en hun hersenen werden verwijderd en ontleed voor de evaluatie van oxidatieve schade niveaus in de prefrontale cortex, amygdala, hippocampus, en het striatum. TBARS en proteïne carbonyl formaties werden gemeten zoals eerder beschreven. Thiobarbituurzuur Reactieve Stoffen (TBARS)

De vorming van TBARS tijdens een zuur-verwarmingsreactie werd gemeten als een index van ROS-productie, die algemeen wordt aangenomen als een gevoelige methode voor het meten van lipide peroxidatie, zoals eerder beschreven . Kort gezegd werden de monsters gemengd met 1 ml trichloorazijnzuur 10% (TCA) en 1 ml thiobarbituurzuur 0,67% (TBA) en vervolgens gedurende 15 minuten in een kokend waterbad verwarmd. TBARS werden bepaald door de extinctie bij 535 nm. De resultaten worden uitgedrukt als MDA (malondialdehyde)-equivalenten (nmol/mg eiwit).

2.7. De oxidatieve schade aan eiwitten werd beoordeeld door de bepaling van carbonylgroepen op basis van de reactie met dinitrofenylhydrazine (DNPH) zoals eerder beschreven. In het kort werden de proteïnen geprecipiteerd door toevoeging van 20% trichloorazijnzuur en opnieuw opgelost in DNPH en de extinctie werd afgelezen bij 370 nm.

2.8. Statistische analyse

Alle analyses werden uitgevoerd met het statistisch pakket voor sociale wetenschappen versie 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Alle gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde ± SEM. Verschillen tussen groepen in gedragsanalyse werden gecontroleerd met behulp van herhaalde maatregelen analyse van variantie om de tijd-respons curve te openen, gevolgd door Tukey’s post hoc tests. Om verschillen tussen groepen in biochemische analyse te testen, gebruikten we ANOVA, gevolgd door Tukey post hoc tests. In alle experimenten, waarden < 0,05 werden beschouwd als statistische significantie.

3. Resultaten

3.1. Gedrag Analyse

Voor de analyse van de voortbeweging (kruisingen) (figuur 1 (a)), de herhaalde maatregelen analyse van variantie bleek significante verschillen voor MD toediening (F(3,35) = 7,91, ) en voor de gedragsherhalingen (F(2,7) = 54,82, ). Verdere analyse met Tukey’s post hoc test toonde aan dat MD van 300 mg/kg de spontane locomotie van de rat deed toenemen in vergelijking met de controlegroep 1 uur na toediening. Bovendien vertoonden de controlegroep, MD bij 75 mg/kg, en MD bij 150 mg/kg een verminderd aantal oversteekbewegingen wanneer ze 3 uur later opnieuw werden blootgesteld aan het open veld, wat duidt op gewenning aan de omgeving. MD bij 300 mg/kg behandelde ratten vertoonden echter een verminderd aantal oversteekbewegingen wanneer ze 2 en 3 uur later opnieuw werden blootgesteld aan het open veld. Dit verschil kan worden verklaard door de motorische hyperactiviteit die 1 uur na toediening van MD bij een dosis van 300 mg/kg werd veroorzaakt.

(a)

(b)

(c)

(a)
(b)
(c)

Voor de analyse van exploratie (opfokken) (Figuur 1(b)), onthulde de herhaalde maatregelen analyse van variantie significante verschillen voor de gedragsherhalingen (F(2.7) = 32.7, ). Verdere analyse met Tukey’s post hoc test toonde aan dat de controlegroep, MD bij 75 mg/kg, en MD bij 150 mg/kg een verminderd aantal ophoudingen vertoonden wanneer ze 3 uur later opnieuw werden blootgesteld aan het open-veld. MD bij 300 mg/kg verminderde het aantal achterblijvers bij herbelichting 2 en 3 uur later aan het open veld.

Voor de analyse van bezoeken aan het midden van het open veld (figuur 1(c)), onthulde de herhaalde maatregelen analyse van variantie significante verschillen voor MD toediening (F(3.34) = 15.70, ). Verdere analyse met Tukey’s post hoc test toonde aan dat MD bij 300 mg/kg het bezoek aan het midden van het open-veld deed toenemen in vergelijking met de controle 1 uur na toediening. Bovendien verhoogde MD bij alle toegediende doses het bezoek aan het midden van het open-veld 3 uur na toediening.

3.2. Biochemische analyse

Zoals blijkt uit figuur 2(a), waren de TBARS-niveaus significant verhoogd in de amygdala (F(3) = 4,18, ), hippocampus (F(3) = 44,9, ), en striatum (F(3) = 7,07, ) van ratten die werden behandeld met MD bij 300 mg/kg in vergelijking met de controlegroep.

(a)

(b)

(a)
(b)

Figuur 2

Effecten van MD toediening of water (controlegroep) op TBARS (a) of proteïne carbonyl (b) niveaus in de prefrontale cortex, amygdala, hippocampus, en striatum van ratten. versus controlegroep, volgens ANOVA gevolgd door de Tukey’s test.

Zoals kan worden waargenomen in figuur 2(b), werd na toediening van MD een significante toename van de carbonylgeneratie waargenomen in de prefrontale cortex (F(3) = 29,9, ) bij een dosis van 300 mg/kg en in de amygdala (F(3) = 9,74, ) en hippocampus (F(3) = 17,99, ) bij 75 mg/kg. Omgekeerd verminderde de behandeling met MD bij 75 en 300 mg/kg de carbonylvorming in het striatum (F(3) = 21,93, ) in vergelijking met de controlegroep.

4. Discussie

In de huidige studie hebben we waargenomen dat een eenmalige injectie van MD in een hoge dosis (300 mg/kg) hyperlocomotie bij ratten induceert, die 2 en 3 uur na toediening niet blijft. Volgens onze resultaten verhoogde MD significant de locomotorische activiteit en verhoogde striatale extracellulaire dopamine niveaus bij resusapen . Young en collega’s toonden aan dat MD de activiteit, het steigeren en de soepelheid van locomotorische paden verhoogde bij C57BL/6J en 129/SJ muizen. Deze door MD veroorzaakte gedragsveranderingen hielden verband met een verhoogd synaptisch dopaminegehalte en secundaire effecten die door dopamine drd1 en drd4 receptoren werden bemiddeld. In tegenstelling tot de bovenstaande studie, zien wij geen significante toename van het exploratief gedrag na MD toediening, hoewel er een trend is. Deze discrepantie kan worden verklaard door verschillen in methodologie, diersoort en behandelingsduur.

Hierbij stelden we vast dat de controlegroep en MD bij lage doses (75 en 150 mg/kg) het aantal crossings en rearings verminderden wanneer ze 3 uur later opnieuw werden blootgesteld aan het open-veld, wat wijst op gewenning aan de omgeving. MD bij de hoge dosis (300 mg/kg) verminderde het aantal keren oversteken en achterop gaan wanneer de dieren 2 en 3 uur later opnieuw aan het open veld werden blootgesteld. Deze discrepantie kan worden verklaard door het feit dat 1 uur na toediening van MD (300 mg/kg) het aantal oversteekbewegingen aanzienlijk toenam en een tendens tot toename van het aantal steigeren. Gewenning aan een nieuwe omgeving wordt beschouwd als een van de meest elementaire vormen van niet-associatief leren. De herhaalde blootstelling aan dezelfde omgeving induceert een vermindering van het exploratief gedrag, wat kan beschouwd worden als een index van gewenning. Een interessante bevinding van de huidige studie was dat MD angst-gerelateerd gedrag moduleerde. In de open-veld test, waren MD behandelde ratten minder angstig en hadden zelfs de neiging om het aversieve centrum gebied meer te verkennen dan de controles. MD van 300 mg/kg verhoogde het aantal bezoeken aan het centrum van het open-veld 1 uur na toediening. Bovendien verhoogde MD bij alle toegediende doses het bezoek aan het centrum van het open veld 3 uur na toediening. In de literatuur zijn studies controversieel over het effect van MD op angst. Preklinische studies hebben ofwel geen effecten van modafinil op angst of een anxiolytisch effect aangetoond. Evenzo toont MD in de klinische studies ofwel een anxiolytisch effect ofwel geen effect op angst aan, terwijl andere studies een anxiogeen effect aantonen. Dit verschil tussen de studies kan worden verklaard door variatie in de gebruikte doses (100 mg, 200 mg, of 400 mg) en in het doseringsschema (eenmalige versus chronische dosering gedurende een week of langer). De anxiolytische effecten van MD kunnen worden verklaard door de effecten op de amygdala, een hersengebied dat betrokken is bij angst, voor bedreigende stimuli. Een eerdere studie toonde aan dat MD de amygdala-reactiviteit op angstige stimuli vermindert. Het is bekend dat de amygdala rijk is aan catecholaminerge en serotoninerge projecties, en dan waarschijnlijk vermindert MD de amygdala reactiviteit door veranderingen in de intra-amygdala signalering als gevolg van veranderingen in noradrenaline, dopamine, serotonine, of GABA systemen of door een combinatie van deze effecten.

Naast het induceren van gedragsveranderingen, is het goed beschreven in de literatuur dat psychostimulantia oxidatieve schade veroorzaken in zowel diermodellen als mensen. Onze resultaten tonen aan dat MD oxidatieve schade aan lipiden en eiwitten in de hersenen van ratten verhoogt. TBARS niveaus waren verhoogd in de amygdala, hippocampus en striatum van ratten behandeld met MD in hoge dosis (300 mg/kg). Bovendien zagen we na toediening van MD een toename van de carbonylproductie in de prefrontale cortex bij een dosis van 300 mg/kg en in de amygdala en hippocampus bij 75 mg/kg. Studies tonen aan dat MD de dopamine transporter remt, waardoor de dopaminerge neurotransmissie toeneemt. De door MD veroorzaakte verhoging van de extracellulaire dopamineconcentratie kan leiden tot overproductie van de toxische metaboliet dopamine-oxidatie , wat leidt tot oxidatieve schade aan eiwitten en lipiden in de hersenen van ratten. In de literatuur zijn er geen studies die hersenletsel beoordelen na toediening van MD; deze studies zijn echter zeer belangrijk gezien het feit dat de toegankelijkheid van MD, zoals alertheidsverhogend, geheugenverhogend en antivermoeidheidsmiddel, voor gezonde mensen toeneemt .

Omgekeerd verminderde de behandeling met MD (75 en 300 mg/kg) de carbonylgeneratie in het striatum in vergelijking met de controlegroep. Sommige studies hebben het striatale neuroprotectieve potentieel van MD aangetoond. Eerdere studies tonen verbetering van de overleving van 1-methyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine vergiftigde dopaminerge neuronen in het striatum na MD behandeling, in diermodel van de ziekte van Parkinson. Raineri en collega’s hebben aangetoond dat de toediening van MD de door methamfetamine veroorzaakte neurotoxiciteit in het striatum van muizen verzwakt, wat wijst op een mogelijk beschermende rol van MD in dit hersengebied. Er is aangetoond dat MD het leren verbetert bij methamfetamine-afhankelijke patiënten. De hier gepresenteerde resultaten suggereren dat MD toediening antioxiderende eigenschappen zou kunnen vertonen in het striatum; het beschermende effect van MD op het striatum is echter nog onbekend. Het striatum integreert glutamaterge inputs van cortex en thalamus met dopaminerge afferenten van de middenhersenen. Dopamine signalering speelt een voorname rol in striataal afhankelijk leren en in synaptische plasticiteit van de medium spiny projectie neuronen. Rossato en collega’s toonden aan dat infusie van de D1 receptor agonist de brain-derived neurotrophic factor (BDNF) niveaus verhoogde en bijgevolg ook de synaptische plasticiteit. Aldus kan MD synaptische plasticiteit bevorderen door het dopaminerge systeem te activeren en bijgevolg het striatum te beschermen tegen oxidatieve schade.

Concluderend zijn we in staat aan te tonen dat (1) MD hyperactiviteit induceert bij hoge dosis (300 mg/kg) 1 uur na toediening, die niet blijft 2 en 3 uur na toediening. (2) MD bij ratten anxiolytische effecten vertoont, waardoor het aantal bezoeken aan het centrum van het open-veld toeneemt. (3) MD induceerde oxidatieve schade aan lipide en proteïne in de hersenen van de rat; de oxidatieve schade is echter afhankelijk van het geanalyseerde hersengebied en de toegediende dosis MD. (4) Tenslotte zou MD het striatum kunnen beschermen tegen oxidatieve schade aan eiwitten. Voorzichtigheid is geboden bij het interpreteren van de resultaten. Ten eerste werd de antioxidantverdediging niet gemeten; aangezien dit de eerste studie is die de invloed van MD op oxidatieve stress onderzoekt, erkennen wij dat dit had kunnen helpen bij de interpretatie van de resultaten. Echter, ten tweede, MD werd toegediend aan gezonde ratten; de effecten van MD op de oxidatieve schade in diermodellen van psychische aandoeningen kunnen andere resultaten laten zien.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat er geen belangenconflict is met betrekking tot de publicatie van dit artikel.

Acknowledgments

Laboratory of Neurosciences (Brazilië) is een van de centra van het Nationaal Instituut voor Translationele Geneeskunde (INCT-TM) en een van de leden van het Center of Excellence in Applied Neurosciences van Santa Catarina (NENASC). Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente, en UNESC. João Quevedo is CNPq Research Fellow en Roger B. Varela, Wilson R. Resende, en Amanda V. Steckert zijn houders van een CAPES-studentschap; Samira S. Valvassori is houder van CNPq-studentschappen.