Generatie van knock-out muizen

Technieken die worden gebruikt om knock-out muizen te genereren omvatten homologe recombinatie (of gen targeting) en gen trapping. Bij beide benaderingen worden embryonale stamcellen (ES-cellen) van muizen gebruikt, die ongeveer vier dagen na de bevruchting uit muizenembryo’s worden geïsoleerd. Bij de eerste benadering, homologe recombinatie, wordt kunstmatig DNA met flankerende sequenties die homoloog (identiek) zijn aan die welke zich stroomopwaarts en stroomafwaarts van de DNA-sequentie van het doelgen bevinden, in de kern van een ES-cel van de muis ingebracht. De ES-cel herkent de homologe flankerende sequenties en verwisselt het bestaande DNA van het doelgen voor segmenten van het vreemde DNA. Het vreemde DNA is echter inactief. De opname ervan in het genoom van de ES-cel inactiveert dus het doelgen, of schakelt het uit. Het vreemde DNA is typisch ontworpen om een reportergen te dragen, dat de locatie van het bestaande gen markeert of labelt, zodat onderzoekers de aanwezigheid ervan in het genoom van de muiscel kunnen opsporen terwijl de cellen zich repliceren. Homologe recombinatie is de methode bij uitstek wanneer een specifiek allel (gen) moet worden vervangen door een gemanipuleerde DNA-sequentie zonder dat andere genen in het genoom worden aangetast.

Gene trapping maakt ook gebruik van kunstmatig DNA dat een reportergen draagt. In plaats van zich te richten op een specifiek gen, wordt het vreemde DNA echter willekeurig ingebouwd in een gen in het ES-celgenoom van de muis. De vreemde sequentie verhindert dat het verstoorde gen zijn eiwitproducten codeert, waardoor het gen inactief wordt. Activering van het reportergen na inbouw in het genoom van de ES-cel stelt onderzoekers in staat de genactiviteit te volgen en de functie van het verstoorde gen af te leiden.

Kunstmatige DNA-sequenties worden gewoonlijk in ES-cellen van muizen ingebracht met behulp van een retrovirus of een andere virale vector, en de gewijzigde ES-cellen worden vervolgens in celculturen gekweekt. Na enkele dagen worden de cellen geïnjecteerd in vroege muizenembryo’s, die vervolgens worden geïmplanteerd in de baarmoeder van een draagmoederpoes, waar zij uiteindelijk tot ontwikkeling komen en worden voldragen. De op deze wijze geboren muizenjongen bevatten zowel gemodificeerd als niet-gemodificeerd weefsel en zijn dus geen volledige knock-out-muizen. Om een paar echte knock-out-muizen (homologe knock-outs) te genereren, moeten de muizen over verschillende generaties worden gefokt. In eerste instantie worden de dieren gekruist met andere muizen om heterozygote individuen te produceren (muizen met één kopie van het doelgen); heterozygote dieren worden vervolgens gekruist om homozygote individuen te produceren.