Gecalculeerde energieprofielen (ΔE) (A); interoxygeenafstanden d(O3-Or) (B); proton off-center afstanden (ΔrH(off-center)) (C); residu-gedreven energieverlaging ten opzichte van het oorspronkelijke systeem (ΔΔEa = ΔE – ΔEa) (D); en reactiepad-afhankelijke interoxygeen afstandverkorting ten opzichte van de ES-toestand (E). In B en C geven de stippellijnen voor f en g het tweede dichtstbijzijnde residu aan, Tyr-16.

Voor zure residuen met een lagere proton affiniteit (pA in de gasfase of pKa in het diëlektrische medium), zou de activeringsbarrière lager zijn voor de eerste stap en hoger voor de derde stap, terwijl basische residuen met een hogere pA of pKa een tegengesteld effect zouden veroorzaken. Bijgevolg wordt in het tweestaps-enzymmechanisme het optimale katalytische vermogen verkregen wanneer de residuen van het enzym een dubbele rol spelen van zeer sterke proton-donor/acceptor van/naar het substraat (te noemen amfi-zuur/base-katalysator of proton/elektronenbuffer) voor de totale reactie. In het diëlektrische medium van enzymen wordt het maximale katalytische effect verkregen in het geval van gelijke pKa’s van residuen en substraat. Deze situatie staat in contrast met eenstapsreacties, waarbij een groot verschil in pKa de reactiviteit verhoogt (47, 48). De voorwaarde van gelijke pKa’s tussen residuen en substraat voor het maximale katalytische effect komt overeen met de eis dat residuen in enzymen gelijkwaardige pKa’s moeten bezitten met het substraat om de maximale SSHB’s te vormen (4-7, 15, 23, 24). Dus, in het twee-staps reactiemechanisme van KSI, spelen de SSHBs als amfi-zuur/base katalysatoren samen met gedeeltelijke proton-shuttles en ladingsherverdelingen een cruciale rol in het sterk stabiliseren van EI’s met ≈15 kcal/mol in residu-gedreven stabilisatie-energie en in reactie-pad-afhankelijke interoxygeen afstand-verkorting ten opzichte van de ES toestand.

De residu-gedreven stabilisatie-energie ΔΔEa is tot op zekere hoogte gecorreleerd met de ΔdES tenzij de protonoverdracht plaatsvindt van het residu naar het substraat (d.w.z, tenzij de ΔrH zich in een negatief gebied bevindt in Fig. 2C). Daarom kan de stabilisatie bij EI’s en TS’s gecorreleerd worden met de verkorting van de H-bond afstand, en dus de H-bond sterkte, ten opzichte van de ES toestand. Dat wil zeggen dat de normale (of gewone) H-bindingen (tussen neutrale partners) bij ES de neiging hebben om SSHB’s te worden (waarbij ionische species betrokken zijn) bij EI’s en TS2. Deze korte bindingen zouden dus verantwoordelijk moeten zijn voor een deel van de residu-gedreven energieverlaging. Wat de protonoverdracht betreft, is de potentiaal bij ES een enkele put voor alle mutanten, terwijl de potentiaalvorm (bij EI’s of TS’en) in het gebied waar ΔrH bijna nul is (d.w.z. rond TS1/EI1 voor c en EI1/TS2 voor e en f in Fig. 2C) enkele kenmerken van een dubbele put vertoont. Voor een kleine absolute waarde van ΔrH (<≈0,5 Å) (Fig. 2C), blijkt de barrière voor protonoverdracht in onze berekening zeer klein te zijn, zodat de protonoverdrachten in de dubbel-potentiaal alleen de drastische verlaging van de activeringsbarrière niet kunnen verklaren. Inderdaad, geval g, waarin de dubbel-well-achtige kenmerken van de potentiaal bijna verdwijnen met weinig protonoverdracht, vertoont meer energieverlaging dan geval f, waarin sprake is van protonoverdracht in een dubbel-well-achtige potentiaal. Anderzijds moet in Fig. 2 D en E worden opgemerkt dat na de protonoverdrachten de ΔdES niet langer wordt verkort maar lichtjes verlengd, terwijl de ΔΔEa nog steeds wordt verlaagd. De verkorting van de H-bondlengte alleen (d.w.z. ΔdES) kan dus de drastische verlaging van de barrière bij TS en EI’s (d.w.z. ΔΔEa) niet verklaren. De barrièreverlaging bij TS’en en EI’s moet dus worden verklaard door bijkomende interactiekrachten, die zullen worden besproken in termen van moleculaire orbitaal (MO) interacties tussen substraten en residuen (waarbij door ladingsoverdracht veroorzaakte elektronische herschikkingen of ladingsherverdelingen optreden).

In het geval van twee concurrerende residuen zoals in f en g, resulteert de cumulatieve stabilisatie van EI’s/TS’en in een sterkere kcat. Dit effect is echter enigszins subadditief (d.w.z. kleiner dan de som van de stabilisatie-energieën van elk residu) als gevolg van de verminderde proton-onttrekkingskracht van het oxyanion voor elk residu door de aanwezigheid van het andere residu. Deze subadditiviteit geeft aan dat de SSHB’s ladingsoverdrachten en polarisatie (d.w.z. geïnduceerde elektrostatische interacties) en mogelijk partiële covalente bindingen zouden impliceren. Inderdaad, de stabilisatie van EI’s en TS’s in aanwezigheid van katalytische residuen komt voornamelijk voort uit de delokalisatie van het overtollige elektron aanwezig in de actieve site door ladingsoverdracht en polarisatie, zoals hieronder zal blijken. De effectieve natuurlijke binding orbitale populatie ladingen (49) van het substraat in de gevallen a, c-e, en f bij TS1 zijn respectievelijk -0.57, ≈-0.43, en -0.37. De negatieve lading van het substraat is dus sterker gereduceerd in de aanwezigheid van twee katalytische residuen. Deze reductie is het gevolg van de overdracht van het overtollige elektron van het substraat naar de katalytische residuen met grote elektronenaffiniteit, die de bufferrol spelen voor het overtollige elektron. Hoewel Asp een sterker elektron-onttrekkend vermogen heeft dan Tyr, heeft Tyr een lagere elektronenaffiniteit dan Asp. Tyr is dus even effectief als, of iets effectiever dan, Asp in het verlagen van de activeringsbarrière. De stabilisatie van de TS en EI’s in aanwezigheid van katalytische residuen is sterk gecorreleerd met de energieverlaging van de overtollige elektron toestand, aangezien de ruimte om het overtollige elektron te huisvesten wordt vergroot met katalytische residuen naast het substraat. Deze energieverlaging is direct gerelateerd aan het onzekerheidsprincipe; hoe minder gelokaliseerd het overtollige elektron, hoe meer het gestabiliseerd is.

De berekende chemische verschuivingen (δ) blijken enigszins gecorreleerd te zijn met de kleinste waarde van d(O3-Or) voor hetzelfde aantal H bindingen , terwijl de aanwezigheid van een tweede H binding δ verhoogt vanwege het versterkte screening effect. Op basis van onze resultaten kan een grote waarde van δ vaak een goede indicator zijn van SSHB, maar δ is slechts gedeeltelijk gecorreleerd met kcat. Deze correlatie neemt vooral af voor grote δ (>16 ppm) of kleine absolute waarde van ΔrH (<0,5 Å), aangezien de afhankelijkheid van kcat van δ in twijfel is getrokken (50).

De verlaging van de activeringsbarrières in de aanwezigheid van katalytische residuen wordt goed begrepen uit MO-analyse (Fig. 3). Het opvallende verschil in TS2 MO energieniveaus tussen a en g is het gevolg van de kwantum aard van de overmatige elektronendichtheid die op het substraat wordt opgebouwd door deprotonatie door Asp-40. De resulterende stabilisatie die wordt verkregen door een deel van de elektronendichtheid af te voeren naar de katalytische residuen is te danken aan het eerder genoemde onzekerheidsprincipe, dat vergelijkbaar is met wat wordt waargenomen in het geval van een overmaat aan elektronen in wisselwerking met waterclusters (51, 52), wat in het voordeel is van een redelijk grote holte-ruimte. De aanwezigheid van de katalytische residuen (die de rol van ladingsbuffer spelen door gedeeltelijke elektronentransfer van het substraat naar de katalytische residuen) vermindert dus drastisch de ladingsopbouw op het oxyanion. Deze stabilisatie van de EI’s en TS’s wordt in wezen bijgestaan door SSHB’s. Dit effect wordt sterk versterkt in de aanwezigheid van zowel Asp-103 als Tyr-16/57. De MO-energieën van geval g zijn dus veel lager dan die van geval a. Het effect van het diëlektrische medium van het enzym is niet zo drastisch als het katalytische residu-effect waarbij elektronenoverdracht optreedt. Gedeeltelijke protonverschuivingen en ladingsherverdelingen, bevorderd door SSHB’s, zijn dus meer verantwoordelijk voor de verlaging van de TS’s en EI’s dan het diëlektrische effect van het enzym. Bijgevolg is het katalytisch effect het resultaat van een gunstige combinatie van winsten uit niet-geïnduceerde elektrostatische energieën en MO interactie-energieën (polarisatie, ladingsoverdracht, en covalente bindingsenergie). Terwijl de eerste het gevolg is van de gedeeltelijke protonverschuivingen door de aanwezigheid van geladen H-bindingen (en dus gerelateerd is aan de sterkte van de SSHB’s), is de laatste voornamelijk het gevolg van elektronische delokalisatie door de katalytische residuen, die de bufferrol spelen voor een overtollig elektron. De MO interactie energiewinst is nauw verwant aan de extra enzym-substraat interactie bevorderd door SSHB.

De stabilisatie-energie kan dus worden weergegeven als de som van de verhoogde energie van de geladen H binding (waarbij ionische soorten) van EI /TSs ten opzichte van de normale H binding (tussen neutrale partners) van de ES en de MO interactie energiewinst als gevolg van de lading herverdelingen waarbij elektron dissipatie aan de katalytische residuen. Omdat de twee energietermen niet gemakkelijk te scheiden zijn, is het moeilijk om elke term te schatten. Toch evalueren we deze termen in geval d met behulp van de volgende methode. Uit de vergelijking van de energieën van EI1 ten opzichte van ES in afwezigheid en aanwezigheid van Tyr-16 (Y16) blijkt dat de stabilisatie-energie van EI1 door Y16 8,7 kcal/mol bedraagt. Om de bijdrage van de niet-geïnduceerde elektrostatische interactie (die niet het elektrostatische inductie-effect van het substraat + Asp-40 (D40) op het residu Y16 omvat) aan de stabilisatie te onderzoeken, hebben we de berekeningen van de ES en EI1 uitgevoerd in het geval dat Y16 vervangen is door een spookresidu dat alleen bestaat uit zijn natuurlijke bindingsorbitaal (NBO) ladingen (Y16q), die berekend zijn voor één molecuul Y16 in de afwezigheid van substraat + D40. Dan is de niet-geïnduceerde elektrostatische interactie-energiewinst (of pre-organisatie-gedreven elektrostatische energiewinst) 4,4 kcal/mol, die verantwoordelijk is voor de verhoogde bindingssterkte van de geladen H-binding (d.w.z., SSHB zelf). Dan moet het verschil in stabilisatie-energie tussen het volledige kwantumeffect door Y16 en het niet-geïnduceerde elektrostatische effect door Y16q (4,3 kcal/mol) afkomstig zijn van de geïnduceerde elektrostatische interactie-energie, covalente energie, enz. De geïnduceerde elektrostatische interactie omvat polarisatie- en ladingsoverdrachtseffecten. Om de geïnduceerde elektrostatische energiewinst te verkrijgen, hebben we eerst de atomaire ladingen van Y16 (Y16qind) verkregen, waarin het inductie-effect in aanwezigheid van het substraat + D40 is opgenomen. Vervolgens hebben we de ES en EI1 berekend in het geval dat Y16 vervangen is door een spookresidu (Y16qind) dat alleen bestaat uit zijn atomaire puntladingen. Aangezien deze stabilisatie-energie 8,2 kcal/mol bedraagt, is de geïnduceerde elektrostatische energiewinst door de interactie tussen substraat + D40 en Y16 3,8 kcal/mol. De energiewinst door de ladingsoverdracht en polarisatie is dus groot en vergelijkbaar met de niet-geïnduceerde elektrostatische energiewinst. Het residu Y16 speelt een belangrijke katalytische rol als ladingsbuffer om een groot deel van de overtollige negatieve lading in het substraat te onttrekken en vast te houden, en ook van de corresponderende elektronische ladingsherverdeling tijdens de reactie. Deze geïnduceerde elektrostatische energie komt voort uit de MO interactie-energie door de kwantummechanische elektronische ladingsinteractie tussen het katalytische residu (Y16) en het substraat + D40 (d.w.z., de SSHB-gedreven substraat-residu interactie-energie). Tenslotte zou de resterende energiebijdrage van 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol grotendeels kunnen corresponderen met de niet-elektrostatische covalente energie. Deze energie is vrij klein, hetgeen verder wordt bevestigd door onze MO analyse dat de niet-elektrostatische baanoverlap in de SSHB zelf niet significant is.

In enzymen met een tweestapsreactiemechanisme is een substraat niet volledig negatief geladen, maar is het gedeeltelijk anionisch met elektronendissipatie naar de katalytische residuen. In dit geval blijkt de verhoging van de stabilisatie-energie (≈10 kcal/mol bij EI1) door SSHB ten opzichte van de normale H-binding dus niet klein te zijn. Als de SSHB-energie wordt uitgebreid met de substraat-residu interacties als gevolg van ladingsherverdelingen in zowel substraat als residu, dan is de stabilisatie-energie de som van de preorganisatie-gedreven SSHB-energie en de SSHB-gedreven MO interactie-energie. Als we echter alleen de sterkte van de SSHB zelf in beschouwing nemen, is de bindingsenergie toename veel kleiner (tot ≈5 kcal/mol).