Isozymen van zoogdier hexokinase: structuur, subcellulaire lokalisatie en metabolische functie | Journal of Experimental Biology
Type I isozyme
Zoals blijkt uit Fig. 1, dient hexokinase als de poort waardoor Glc in alternatieve metabolische routes terechtkomt. Desalniettemin is het waarschijnlijk veilig om te zeggen dat hexokinase het meest wordt beschouwd als een glycolytisch enzym, en glycolytisch metabolisme wordt over het algemeen beschouwd als een cytoplasmatisch proces. Het was dus opmerkelijk dat, in tegenstelling tot andere glycolytische enzymen, de activiteit van hexokinase (nu bekend als het Type I isozyme) voornamelijk werd gevonden in ‘particulaire fracties’ van hersenhomogenaten (Crane en Sols,1953). Later werk (Johnson, 1960;Rose en Warms, 1967; zie ook Wilson, 1995) toonde aan dat het hexokinase in deeltjes geassocieerd was met mitochondriën, en meer specifiek, met het buitenste mitochondriale membraan (Rose en Warms, 1967;Kropp en Wilson, 1970).Binding is kritisch afhankelijk van een hydrofobe N-terminale sequentie (Polakis en Wilson, 1985) die het Type I isozyme selectief naar mitochondriën richt (Gelb et al., 1992;Sui en Wilson, 1997) en wordt tijdens de binding in de hydrofobe kern van de buitenste mitochondriale membraan ingebracht (Xie en Wilson, 1988). Porin (ook wel `VDAC’ genoemd, het acroniem voor `voltagedependent anion channel’) vormt het kanaal waardoor metabolieten de buitenste mitochondriale membraan passeren, en werd geïdentificeerd als het buitenste membraaneiwit dat interageert met hexokinase (Felgner et al., 1979;Lindén et al., 1982;Fiek et al., 1982). Bovendien zijn er aanwijzingen dat binding van hexokinase bij voorkeur plaatsvindt aan porine dat zich bevindt op contactplaatsen, gebieden waar intiem contact bestaat tussen de binnenste en buitenste mitochondriale membranen (Dorbani et al., 1987;Kottke et al, 1988;BeltrandelRio and Wilson,1992a).
De klassieke studies van Johnson(1960) en van Rose and Warms(1967) werden spoedig gevolgd door rapporten van mitochondriaal gebonden hexokinase uit andere normale weefsels, naast de hersenen, alsmede uit verschillende tumorcellen (voor referenties, zie Wilson, 1985,1995). Over de mogelijke fysiologische betekenis van deze associatie van een `glycolytisch’ enzym metmitochondriën, de voornaamste plaats voor het oxidatieve metabolisme, is veel gespeculeerd. Vanaf het begin, en vooral na de erkenning dat het `hexokinase bindend eiwit’ van de buitenste mitochondriale membraan identiek was aan porine, en dus dat hexokinase zich zou kunnen bevinden nabij het punt waar ATP de mitochondriën verlaat (en ADP de mitochondriën weer binnenkomt), speculaties waren grotendeels gericht op de mogelijkheid dat deze nabijheid een intieme metabolische interactie zou kunnen bevorderen tussen intramitochondriale oxidatieve fosforylering als bron van ATP-substraat en Glc-fosforylering door het mitochondriaal gebonden hexokinase. Dit was inderdaad overwogen door Rose en Warms (1967), maar kon niet worden gestaafd door hun experimentele resultaten. Later werk van anderen (voor referenties zie Wilson,1985,1995), waarbij gebruik werd gemaakt van mitochondriaal gebonden hexokinase van verschillende bronnen, leverde echter bewijs op voor de opvatting dat mitochondriaal gebonden hexokinase `preferentiële’ of `bevoorrechte’ toegang had tot intramitochondriaal gegenereerd ATP.
Werk in ons laboratorium heeft een stevige basis gelegd voor de opvatting dat hexokinase gebonden aan actief fosforylerende hersen mitochondriën inderdaad nauw gekoppeld is aan een intramitochondriaal compartiment van substraat ATP, gegenereerd door oxidatieve fosforylering. De experimentele ondersteuning voor deze conclusie is beschreven in een reeks publicaties (Beltrandel-Rio and Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar and Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto and Wilson, 2000). Een volledig overzicht van dit werk is binnen de beperkingen van deze context niet mogelijk, maar wij zullen enkele van de belangrijkste bevindingen belichten om de verscheidenheid van experimentele benaderingen aan te tonen, die alle tot dezelfde conclusie leiden, die in deze studies zijn gebruikt.
Initiële studies (Beltrandel-Rio en Wilson,1991,1992a,b) werden uitgevoerd met behulp van spectrofotometrische methoden waarbij de ATP-productie door verschillende intramitochondriale processen (oxidatieve fosforylering, adenylaatkinasereactie, creatinekinase-reactie) en Glc-fosforylering door hexokinase werden gekoppeld aan de NADPH-productie, gecontroleerd bij 340 nm, door het gebruik van geschikte koppelingsenzymen. Het basisidee was dat door de snelheid van Glc-fosforylering te vergelijken met de snelheid van ATP-productie uit verschillende bronnen, men het relatieve belang zou kunnen afleiden van verschillende intramitochondriale ATP-genererende processen als bron van substraat-ATP voor hexokinase. De conclusie was dat wanneer oxidatieve fosforylering optrad, nochadenylaat kinase noch creatinekinase een belangrijke bron van substraat-ATP was. Bovendien werd slechts een fractie van het door oxidatieve fosforylering geproduceerde ATP door hexokinase benut, met als gevolg dat in hetxtramitochondriale medium de hoeveelheid ATP bleef toenemen naarmate de oxidatieve fosforylering voortduurde. De snelheid van Glc-fosforylering nam echter niet gestaag toe als reactie op de voortdurende toename van extramitochondriaal ATP, ondanks het feit dat deze laatste vergelijkbaar was met de Km voor ATP die werd waargenomen bij toevoeging van extramitochondriaal ATP in afwezigheid van oxidatieve fosforylering, d.w.z. dat de hexokinase niet `verzadigd’ zou zijn geweest met extramitochondriaal ATP als substraat (Fig.2). Dit suggereert sterk dat het niet extramitochondriaal ATP was dat als substraat werd gebruikt.
Glucose (Glc) fosforylering tot glucose-6-fosfaat (Glc-6-P) doormitochondriaal gebonden hexokinase met exogeen ATP of met ATP gegenereerd door oxidatieve fosforylering. De snelheid van Glc fosforylering werd bepaald atquivalent, hetzij exogeen toegevoegd in de afwezigheid van oxidatieve fosforylering (driehoeken) of gegenereerd door oxidatieve fosforylering (cirkels). Van beide bronnen, de was onderverzadigd, met de snelheid van Glc fosforylering ver onder die gezien wanneer de ATP niveaus werden acuut verhoogd door toevoeging van verzadigende niveaus van exogeen ATP (vierkantjes). Overgenomen met toestemming van Beltrandel-Rio en Wilson (1991).
Verder werd dit ondersteund door resultaten zoals die getoond in Fig. 3. Hier werd Glc-fosforylering gevolgd na initiatie van oxidatieve fosforylering door toevoeging van ADP, met toenemende concentraties van extramitochondriaal ATP aanwezig vanaf het begin. Zoals verwacht van de klassieke Michaelis-Mentenkinetiek, nam de aanvankelijke snelheid van Glc fosforylering toe met toenemende extramitochondriale. Echter, na verloop van tijd, een steady state snelheid van Glc-fosforylering werd bereikt die onafhankelijk was van de hoeveelheid residualextramitochondriale ATP aanwezig. Deze resultaten werden geïnterpreteerd als indicatie dat, terwijl de mitochondriaal gebonden hexokinase aanvankelijk gebruik maakte vanextramitochondriaal ATP, de initiatie van oxidatieve fosforylering leidde tot een verandering in substraatvoorkeur, waarbij hexokinase afhankelijk werd van een intramitochondriaal compartiment van ATP, dat werd bepaald door de snelheid van oxidatieve fosforylering en onafhankelijk was van het extramitochondriale ATP.
Glucose (Glc) fosforylering door mitochondriaal gebonden hexokinase, met ATP gegenereerd door oxidatieve fosforylering in aanwezigheid van toenemendeconcentraties exogeen ATP. ATP-productie door oxidatieve fosforylering werd geïnitieerd door toevoeging van ADP op het aangegeven tijdstip. Glc-fosforylering werd gekoppeld aan NADPH-productie, gecontroleerd door absorptie bij 340 nm (A), in de aanwezigheid van overtollig glucose-6-fosfaat (Glc-6-P) dehydrogenase. Deconcentraties van exogeen ATP, aanwezig op het moment van ADP toevoeging, waren 1,1, 0,66, 0,22 en 0 mmol l-1 voor curven A-D, respectievelijk. Merk op dat de bereikte steady state onafhankelijk was van de oorspronkelijkextramitochondriale . Overgenomen met toestemming van Beltrandel-Rio en Wilson (1992b).
Hoewel de ATP produktie vrijwel onmiddellijk begon na de initiatie van oxidatieve fosforylering door toevoeging van ADP, was er een duidelijke vertraging in de initiatie van Glc fosforylering door het mitochondriaal gebonden hexokinase (Fig. 3D) voor het bereiken van een steady state snelheid die gedurende een langere periode aanhield. Deze initiële vertragingsperiode werd geïnterpreteerd als de tijd die nodig is om een intramitochondriaal compartiment te vullen met ATP gegenereerd door oxidatieve fosforylering en waaruit de mitochondriaal gebonden hexokinase zijn substraat ATP haalde. Remming van elektronentransport door toevoeging van KCN resulteerde in het vrijkomen van ATP, vermoedelijk uit het intramitochondriale compartiment, en de eigenschappen van dit compartiment (kinetiek van het vullen, verband met intramitochondriale ATP-produktie, enz.) waren in bevredigende overeenstemming met de verwachtingen op basis van deze interpretatie (Beltrandel-Rio en Wilson,1991,1992a,b).Helaas is overeenstemming met de verwachtingen geen onfeilbare gids voor de ware toedracht, en de `schijnbare afgifte van ATP’ bleek later een artefact te zijn (Laterveer et al.,1993), waarvan de bron nog steeds niet begrepen is en die in later werk niet gereproduceerd kon worden (deCerqueira Cesar and Wilson, 1998). Ondanks deze ontmoedigende, en beschamende, tegenslag, werd het basisconcept van koppeling mitochondriaal gebondenhexokinase aan een intramitochondriale compartiment van ATP ondersteund door ander bewijsmateriaal en heeft latere experimentele tests doorstaan.
Een dubbele isotopische etikettering methode werd ontwikkeld als een alternatief voor de spectrofotometrische procedures (deCerqueira Cesar en Wilson, 1995). 14C-gelabeld Glc werd gebruikt als substraat voor hexokinase, en 32Pi leverde een assubstraat voor ATP synthese door oxidatieve fosforylering. De32P/14C-verhouding in Glc-6-P was dus een maat voor de specifieke activiteit van het substraat ATP dat door hexokinase werd gebruikt. De32P/14C-verhouding van Glc-6-P geproduceerd door mitochondriaal gebonden hexokinase werd vergeleken met die geproduceerd door gist-hexokinase, dat zich niet bindt aan mitochondriën en dus noodzakelijkerwijs extramitochondriaal ATP als substraat gebruikt. De kinetiek van het labelen van de ATP-pools gebruikt als substraat door mitochondriaal gebonden en gist hexokinases waren opvallend verschillend, weer consistent met de opvatting dat de mitochondriaal gebonden hexokinase geen gebruik maakt van extramitochondriaal ATP als substraat, maar eerder, putten uit een intramitochondriale compartiment van ATP geleverd door oxidatieve fosforylering.Bijvoorbeeld (Fig. 4), toevoeging van een overmaat 31Pi, waardoor de specificiteit van het door oxidatieve fosforylering gesynthetiseerde 32P-ATP duidelijk afnam, resulteerde in een snelle afname van de 32P/14C verhouding vanGlc-6-P geproduceerd door gisthexokinase, gebruik makend van extramitochondriaal ATP. Daarentegen was er een vertraging en vervolgens een iets langzamere daling in de32P/14C -verhouding van Glc-6-P geproduceerd door mitochondriaal gebonden hexokinase. De laatste waarnemingen waren weer consistent met de opvatting dat de mitochondriale hexokinase gebruik maakte van een intramitochondriaalcompartiment van ATP dat niet vrij geëquilibreerd was met extramitochondriaal ATP.
Effect van toevoeging van overmaat ongelabeld Pi op de32P/14C verhouding van glucose-6-fosfaat (Glc-6-P) gevormd doormitochondriaal gebonden hexokinase of nietmitochondriaal gebonden gist hexokinase.Oxidatieve fosforylering werd gestart met 32Pipresent als substraat voor oxidatieve fosforylering, en Glc assubstrate voor hexokinase. Na 3 minuten werd een overmaat aan 31Pi toegevoegd, waardoor de specifieke activiteit van ATP die vervolgens door oxidatieve fosforylering werd geproduceerd, verminderde. Dit resulteerde in een snelle daling van de32P/14C verhouding van Glc-6-P gevormd door gist hexokinase (vierkanten) met extramitochondriale ATP als substraat, maar een veel langzamere daling van de 32P/14C verhouding van Glc-6-P geproduceerd doormitochondriaal gebonden hexokinase (open cirkels). Gevulde cirkels, totaal Glc-6-P geproduceerd door mitochondriaal gebonden hexokinase. Overgenomen met toestemming van de Cerqueira Cesar en Wilson (1995).
Nog een andere experimentele benadering was gebaseerd op een vergelijking van de mitochondriaal gebonden hexokinase en de niet-gebonden gist enzym (de Cerqueira Cesar en Wilson, 1998,2002). De onderliggende logica wordt geïllustreerd in fig. 5. Een vaste hoeveelheid hersenmitochondriën, met gebonden hexokinase, wordt gemengd met toenemende hoeveelheden levermitochondriën van ratten, die geen gebonden hexokinase bevatten. Zowel hersen- als levermitochondriën fosforyleren actief en er is dus een toenemende ATP-productie in het systeem naarmate de hoeveelheid levermitochondriën toeneemt. Door het ontwerp wordt de concentratie van extramitochondriaal ATP onderverzadigd gehouden, d.w.z. ÅKm van hexokinasewith extramitochondriaal ATP als substraat (in afwezigheid van oxidatieve fosforylering). Als het mitochondriaal gebonden hexokinase extramitochondriaal ATP als substraat gebruikt, wordt een progressieve toename van de Glc-fosforylatiesnelheid verwacht naarmate de ATP-productie toeneemt door toevoeging van steeds grotere hoeveelheden levermitochondriën. In feite is dit niet wat wordt waargenomen; integendeel, de snelheid van Glc fosforylering door henitochondriaal gebonden hexokinase wordt niet significant beïnvloed door toename van de snelheid van ATP productie (Fig.6). Daarentegen wordt de verwachte toename van de Glc-fosforylering waargenomen als de mitochondriale hexokinase wordt vervangen door een equivalente hoeveelheid gisthexokinase. Deze resultaten zijn dus opnieuw consistent met de opvatting dat mitochondriaal gebonden hexokinase gebruik maakt van intramitochondriaal ATP, intrinsiek aan de mitochondriën waarmee de hexokinase is geassocieerd, maar onafhankelijk van een toename inextramitochondriaal ATP afkomstig van de hexokinase-vrije levermitochondriën.
Schematische weergave van de experimentele strategie voor het vergelijkenutilisatie van extramitochondriaal ATP door mitochondriaal gebonden hexokinase of niet-gebonden gist hexokinase. (A) Mitochondriaal gebonden hexokinase (HK) is vertegenwoordigd in het midden van het paneel, met extra mitochondriën, die weinig of geen gebonden hexokinase, getoond in meer perifere regio’s. Voor de laatste, rat hersenen mitochondriën die waren uitgeput van hexokinase door behandeling met glucose-6-fosfaat, die vrijlating van themitochondriaal gebonden hexokinase veroorzaakt, werden gebruikt in eerdere experimenten. Latere experimenten, echter, gebruikten rat lever mitochondriën die, zoals geïsoleerd, geen gebonden hexokinase bevatten. Extramitochondriaal ATP is verdeeld over de hele extramitochondriale ruimte. (B) Analoge situatie, maar met een gelijkwaardige hoeveelheid niet-mitochondriaal gebonden gist hexokinase (YHK) in plaats van deitochondriaal gebonden hexokinase. De basisstrategie is om de snelheid van glucose fosforylering bepalen door een vaste hoeveelheid gebonden of niet-gebonden hexokinase als de snelheid van extramitochondriale ATP productie wordt verhoogd door toevoeging van steeds meer mitochondriën verstoken van gebonden hexokinase. Overgenomen met toestemming van de Cerqueira Cesar and Wilson(2002).
Snelheid van glucose (Glc) fosforylering door mitochondriaal gebonden en niet-gebonden hexokinase, met toenemende snelheid van ATP productie uit oxidatieve fosforylering. De snelheid van Glc-fosforylering (v̇) wordt uitgedrukt ten opzichte van de maximale snelheid van fosforylering (V̇), de laatste bepaald met verzadigde niveaus van exogeen ATP in de afwezigheid van oxidatieve fosforylering. De snelheid van Glc-6-P productie doornonmitochondriaal gebonden gisthexokinase (cirkels) is nauw gecorreleerd met de snelheid van ATP-productie. Daarentegen is de snelheid van Glc-fosforylering doormitochondriaal gebonden hexokinase (vierkanten) ongevoelig voor toenemende niveaus van extramitochondriaal ATP, geproduceerd door niethexokinase-dragende mitochondriën, consistent met de opvatting dat het mitochondriaal gebonden enzym zich beperkt tot intramitochondriaal ATP, geproduceerd door de mitochondriën waaraan het enzym is gebonden, als substraat. Overgenomen met toestemming van de Cerqueira Cesar en Wilson (1998).
Tot slot, verder bewijs voor de opvatting dat mitochondriaal gebondenhexokinase kan discrimineren tussen intra- en extramitochondriaal ATP komt uit het onderzoeken van remming door de Glc-6-P analoog, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P). In afwezigheid van oxidatieve fosforylering en met extramitochondriaal ATP als substraat, is 1,5-AnG6P een tamelijk krachtige remmer, concurrerend met ATP (Fig.7) (Hashimoto en Wilson,2000). Wanneer ATP daarentegen door oxidatieve fosforylering wordt geleverd, is 1,5-AnG6P veel minder effectief als remmer. Het is duidelijk dat ATP dat door oxidatieve fosforylering wordt geleverd, niet gelijkwaardig is aanxtramitochondriaal ATP. Vergelijkbare resultaten zijn onlangs gerapporteerd met behulp van themitochondriale hexokinase van runderhersenen (de Cerqueira en Wilson, 2002).
Remming van mitochondriaal gebonden hexokinase door de glucose-6-fosfaatanaloog, 1,5-anhydroglucitol-6-P (1,5-AnG6P), met intramitochondriaal gegenereerd (open cirkels) of extramitochondriaal (gevulde cirkels) ATP-assubstraat. Overgenomen met toestemming van Hashimoto en Wilson (2000).
Kortom, het huidige standpunt is dat, in de afwezigheid van oxidatieve fosforylering, mitochondriale hexokinase gemakkelijk extramitochondriaal ATP kan gebruiken, volgens de klassieke Michaelis-Menten kinetiek. Tijdens actieve oxidatieve fosforylering is het mitochondriaal gebonden enzym echter gekoppeld aan een intramitochondriale pool van ATP, waarbij de snelheid van Glc-fosforylering nauw gecorreleerd is met de snelheid van oxidatieve fosforylering. Het lijkt moeilijk te geloven dat, in normaal weefsel, mitochondriën zich ooit in een volledig niet-fosforylerende toestand bevinden. Veranderingen in de snelheid? Ja, natuurlijk, afhankelijk van fluctuaties in energie vraag. Maar echt niet fosforylerend? Waarschijnlijk alleen onder de meest erge – en uiteindelijk dodelijke – omstandigheden. Hieruit volgt dat, onder normale omstandigheden, de snelheid van Glc-fosforylering nauw gecoördineerd is met de terminale oxidatieve stadia van Glc-metabolisme in de mitochondriën, met de bijbehorende productie van ATP door oxidatieve fosforylering. Zoals eerder opgemerkt (Beltrandel-Rio en Wilson,1992a), kan een dergelijke coördinatie zorgen voor de introductie van Glc in het glycolytisch metabolisme met een snelheid die evenredig is met de eindoxidatiefasen, waarbij de productie van neurotoxisch lactaat wordt vermeden (Marie en Bralet, 1991), terwijl de netto flux door het cytoplasmatische en mitochondriale deel van de route voldoende is om aan de energiebehoeften te voldoen (Fig. 8).
Coordinatie van glycolytische en oxidatieve fasen van het glucose(Glc)metabolisme. De snelheid van Glc fosforylering door mitochondriaal gebonden hexokinase, met intramitochondriaal gegenereerd ATP als substraat, is gecorreleerd met de snelheid van oxidatieve fosforylering. Dit mechanisme wordt gesuggereerd om de coördinatie te verzekeren van Glc fosforylering, de eerste stap in het glycolytisch metabolisme, met de terminale oxidatieve stadia (tricarbonzuurcyclus, met bijbehorend elektronentransport en oxidatieve fosforylering; vetgekromde pijlen) die plaatsvinden in de mitochondriën, waardoor de opbouw van potentieel toxisch lactaat wordt vermeden.
Het is niet bekend hoe deze opmerkelijke verandering in substraatspecificiteit (intramitochondriaal versus extramitochondriaal ATP) wordt geïnduceerd door oxidatieve fosforylering, maar het is duidelijk dat de conformatie van het aan de mitochondriën gebonden enzym wordt beïnvloed door de mitochondriale membraanpotentiaal, alsmede door andere factoren die verband houden met de mitochondriale functie, wat wijst op een nauwe interactie tussen de binnenste (waar de membraanpotentiaal overheen loopt) en buitenste (waaraan hexokinase is gebonden) membranen van dit organel (Hashimoto en Wilson, 2000).Eerder werd verondersteld (de Cerquiera en Wilson, 1998) dat conformatieveranderingen in de delen van het molecuul die betrokken zijn bij de binding van ATP verantwoordelijk zijn voor veranderingen in de substraatspecificiteit (8651>).