Abstract

Bomen van het Copaifera genus zijn inheems in de tropische gebieden van Latijns-Amerika en West-Afrika. Copaifera sp wordt veel gebruikt als volksmedicijn en heeft verschillende etnofarmacologische indicaties, waaronder gonorroe, bronchitis, astma, huidzweren, zweren, keelpijn, baarmoederontstekingen, algemene ontstekingen, kanker, en leishmanioses. Kaurenoic zuur is een natuurlijk voorkomend diterpeen dat in de Copaifera wordt aangetroffen en is gebruikt als ontstekingsremmer, behandeling van zweren, leishmaniasis en kanker. Aangezien de Ames-test een uitstekend instrument is om de veiligheid van extracten, oliën en fytochemicaliën geïsoleerd uit medicinale planten te beoordelen, evalueren wij het mutagene potentieel van vier soorten, tussen oleoresinen (C. oblongifolia; C. langsdorffii) en bladextracten (C. lucens; C. multijuga), van het Copaifera-geslacht en ook van kaurenoic zuur, één van de belangrijkste verbindingen ervan. Uit de resultaten bleek dat de Copaifera spp. en kaurenoic zuur geen toename van het aantal terugmutantkolonies veroorzaakten, zonder mutagene werking in experimenten, in alle concentraties die met de Ames-test werden geëvalueerd. De resultaten verkregen in onze studie ondersteunen het veilige gebruik van de geselecteerde medicinale planten van het Copaifera geslacht en van kaurenoinezuur.

1. Inleiding

In de loop van de geschiedenis hebben verschillende culturen planten gebruikt voor medicinale doeleinden. Planten hebben inderdaad bewezen een bron van geneesmiddelen te zijn voor de behandeling van een breed spectrum van ziekten. Vandaag de dag spelen plantaardige systemen nog steeds een essentiële rol in de gezondheid en de belangstelling voor fytomedicinale producten is wereldwijd toegenomen, zozeer zelfs dat planten nog steeds worden onderzocht als bron van nieuwe medicinale middelen.

Bomen die behoren tot het geslacht Copaifera zijn inheems in de tropische gebieden van Latijns-Amerika en West-Afrika. Het geslacht Copaifera behoort tot de familie der Leguminosae en omvat 72 soorten. Er bestaan meer dan 20 Copaifera spp. op Braziliaans grondgebied, waar ze “copaibeiras”, “pau d’óleo”, of “copaíbas” worden genoemd. Copaifera spp. worden veel gebruikt in de volksgeneeskunde. Zij hebben verschillende etnofarmacologische indicaties, zoals behandeling van gonorroe, bronchitis, astma, huidzweren, zweren, keelpijn, baarmoederontstekingen, algemene ontstekingen, kanker, en leishmaniases .

De wetenschappelijke literatuur bevat talrijke rapporten over de farmacologische activiteiten van Copaifera-soorten, zoals hun ontstekingsremmende , antitumor , antiproliferatieve , anthelmintische , antituberculaire , gastroprotectieve , chemopreventieve , immunomodulerende , en antibacteriële acties, onder anderen.

Kaurenoic zuur is een diterpeen dat van nature voorkomt in sommige Braziliaanse planten, waaronder Copaifera oleoresins. Talloze farmacologische eigenschappen zijn gerapporteerd voor kaurenoic zuur, zoals zijn anti-inflammatoire werking, het gebruik ervan voor de behandeling van maagzweren, en zijn antiparasitaire, analgetische, en antikanker potentieel.

Omdat natuurlijke verbindingen van oudsher worden gebruikt, wordt vaak aangenomen dat ze veilig zijn. Vele studies hebben echter gerapporteerd dat verscheidene plantensoorten die in de traditionele geneeskunde worden toegepast, mutagene, carcinogene of toxische effecten vertonen. Desondanks wordt een aantal planten en fytotherapeutische producten nog steeds toegepast zonder dat de veiligheid ervan wetenschappelijk is aangetoond.

De Ames-test is wereldwijd bekend om zijn vermogen puntmutaties op te sporen die door verschillende agentia worden veroorzaakt. Bij deze test worden indicatieve Salmonella Typhimurium-stammen gebruikt die gevoelig zijn voor stoffen die verschillende soorten mutaties induceren. Op basis van de Ames-test kan de mutagene werking van een verbinding worden bepaald als functie van de S. Typhimurium-concentratie. Deze test wordt wereldwijd gebruikt voor de initiële screening van het mutagene potentieel van nieuwe geneesmiddelen. Een mutagene reactie heeft een hoge voorspellende waarde voor carcinogeniteit . In de loop der jaren hebben de wetenschappelijke gemeenschap, overheidsinstanties en bedrijven de waarde van deze test erkend.

In de wetenschap dat de Ames-test een uitstekend instrument is om de veiligheid van extracten, oliën en fytochemicaliën geïsoleerd uit medicinale planten te beoordelen, hebben wij deze test gebruikt om het mutagene potentieel van de oleoharsen of bladextracten van vier Copaifera-soorten en van kaurenoïnezuur te evalueren.

2. Materialen en methoden

2.1. Plantmateriaal

Het plantmateriaal werd verzameld in verschillende Braziliaanse staten tussen augustus 2012 en mei 2014. De plantenbonnen werden geïdentificeerd door Dr. Regina Celia Vianna Martins da Silva van het botanisch laboratorium van de Braziliaanse Landbouwonderzoeksmaatschappij (Embrapa), Belém, State of Pará, Brazilië, of door Dr. Milton Groppo Junior van het Departement Biologie van de Universiteit van São Paulo, Campus Ribeirão Preto, State of São Paulo, Brazilië, waar de bonnen werden gedeponeerd. Tabel 1 bevat informatie over de voucherspecimens.

Om de C. oblongifolia en C. langsdorffii oleoresins te trekken, werd met een grondboor een gat geboord met een diameter van ongeveer één inch. Het gat werd geboord in het midden van de boomstam, drie voet boven de grond. De oleohars werd afgetapt in een amberkleurige fles door middel van een pijp die verbonden was met een filter. Nadat de oleoharsen waren verzameld, werd het gat goed afgesloten.

C. lucens en C. multijuga bladeren werden aan de lucht gedroogd bij 40°C gedurende 48 uur of gevriesdroogd en in een blender tot poeder vermalen. Het verkregen poeder werd gedurende 48 uur bij kamertemperatuur gemacereerd in ethanol/water 7:3. Na filtratie werd het oplosmiddel onder 40°C onder vacuüm ingedampt. Deze procedure werd viermaal herhaald, en de extracten werden gecombineerd, geconcentreerd onder vacuüm, en gevriesdroogd, wat een gemiddelde van 20% w/w aan ruwe hydroalcoholische extracten van de bladeren opleverde.

Kaurenoic acid (Figuur 1), zuiverheid boven 99%, werd geïsoleerd zoals gedetailleerd door Simão et al. . De Copaifera soorten oleoresins en bladeren werden verzameld en het onderzoek werd ontwikkeld na toestemming van de Braziliaanse regering via SISBIO (Biodiversity Information and Authorization System #35143-1) en CGEN (Genetic Heritage Management Council #010225/2014-5).

Figuur 1

Chemische structuur van kaurenoïnezuur.

2.2. Ames-test

De Ames-test werd gebruikt om de mutageniteit van Copaifera spp. te onderzoeken. De door Maron en Ames ontwikkelde preïncubatiemethode, met en zonder exogene activering (S9), is gebruikt om verschillende Salmonella Typhimurium-stammen (TA98, TA100, TA97a en TA102) te analyseren in een poging om agentia te identificeren die genmutaties veroorzaken. De testerstammen, die vriendelijk ter beschikking zijn gesteld door Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), zijn gekweekt uit diepvriesculturen gedurende 12-14 uur, ’s nachts, in Oxoid Nutrient Broth Number 2.

Voor de mutagene activiteitstest werden verschillende concentraties van elke oleohars, elk extract of kaurenoïnezuur opgelost in DMSO toegevoegd aan 0,1 ml bacteriecultuur in 0,5 ml fosfaatbuffer 0,2 M of 0,5 ml 4% S9-mengsel en geïncubeerd bij 37°C gedurende 20-30 min. De concentraties varieerden van 62,5 tot 500 μg/plaat voor C. lucens (extract), van 120 tot 1000 μg/plaat voor C. multijuga (extract), van 125 tot 1000 μg/plaat voor C. oblongifolia (oleohars), 500 tot 4000 μg/plaat voor C. langsdorffii (oleohars), en van 25 tot 200 μg/plaat voor kaurenoïnezuur. Deze concentraties werden gekozen op basis van een voorafgaande toxiciteitstest. In alle volgende tests was de bovengrens van het geteste dosisbereik de hoogste niet-toxische dosis of de laagste toxische dosis die in de voorafgaande test was bepaald. Toxiciteit werd gedetecteerd als een vermindering van het aantal histidine-revertanten (His+) of als een verdunning van het auxotrofe achtergrondgazon.

Het metabolische activeringsmengsel (S9-fractie) bereid uit de levers van Sprague Dawley-ratten die waren behandeld met het polychloorbifenylmengsel Aroclor 1254 (500 mg/kg) werd gekocht bij Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, VS) en vóór elke test vers bereid. Het metabool activeringssysteem bestond uit 4% S9-fractie, 1% magnesiumchloride 0,4 M, 1% kaliumchloride 1,65 M, 0,5% D-glucose-6-fosfaat dinatrium 1 M, en 4% nicotinezuuramide adenine dinucleotide fosfaat natriumzout (NADP) 0.1 M in 50% fosfaatbuffer 0,2 M en 39,5% steriel gedestilleerd water.

Na incubatie werd 2 mL top agar toegevoegd, en het mengsel werd op een plaat met minimale agar gegoten. De platen werden gedurende 48 uur bij 37°C geïncubeerd, en de His+ terugmutantkolonies werden handmatig geteld.

De resultaten werden geanalyseerd met het statistische softwarepakket Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, van Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); het model van Bernstein et al. werd aangenomen. De gegevens (terugmutanten/plaat) zijn beoordeeld met behulp van een variantieanalyse (ANOVA), gevolgd door lineaire regressie. Ook werd voor elke geteste concentratie de mutagene index (MI) berekend, die overeenkomt met het gemiddelde aantal terugmutanten per testplaatje gedeeld door het gemiddelde aantal terugmutanten per controleplaatje met oplosmiddel. Een monster werd als mutageen beschouwd wanneer een dosis/respons-relatie werd geconstateerd en de MI bij een of meer concentraties hoger was dan twee (MI > 2).

De volgende standaardmutagenen werden als positieve controles gebruikt bij experimenten zonder S9-mix: 4-nitro-O-phenylenediamine (10 μg/plaat) voor TA98 en TA97a, natriumazide (1,25 μg/plaat) voor TA100, en mitomycine C (0,5 μg/plaat) voor TA102. In experimenten met S9 activering, 2-anthramine (1,25 ug / plaat) werd gebruikt als positieve controle voor TA98, TA97a, en TA100, en 2-aminofluorene (10 ug / plaat) werd gebruikt als positieve controle voor TA102. DMSO diende als oplosmiddelcontrole (100 μL/plaat) en de negatieve controle komt overeen met de spontane terugmutatiesnelheid van elke stam.

3. Resultaten

Tabel 2 toont het gemiddelde aantal terugmutanten/plaat (M), de standaardafwijking (SD) en de mutagene index (MI) waargenomen voor S. Typhimurium-stammen TA98, TA100, TA102 en TA97a in aanwezigheid (+S9) of afwezigheid (-S9) van metabole activering na behandeling van het monster met de beoogde oleohars, het extract of de verbinding.

Niet de bladextracten van C. lucens en C. multijuga, noch de oleoharsen van C. langsdorffii en C. oblongifolia veroorzaakten genetische mutaties, zoals blijkt uit de Ames-test. Ook bij Kaurenoïnezuur nam het aantal terugmutantkolonies niet toe, zodat het bij geen van de onderzochte concentraties of bij geen van de beoordeelde stammen een mutagene werking had. De oplosmiddelcontrole (DMSO) verschilde qua aantal terugmutanten niet significant van de negatieve controle.

4. Discussie

De mutagene effecten van planten zijn bij de mens niet gemakkelijk waarneembaar, terwijl zich op lange termijn nadelige gevolgen zoals kanker kunnen voordoen. In de wetenschappelijke literatuur is dan ook gewezen op het belang van het screenen van medicinale planten op hun mutagene potentie. In deze zin hebben we hier het mutageen potentieel van de Copaifera spp. en kaurenoic zuur onderzocht met behulp van de Ames test. Akyıl en Konuk benadrukten dat de opsporing van genotoxische agentia vaak berust op het gebruik van bacteriën als testorganismen. De Ames-test (of Salmonella-microsoomtest) is dan ook de methode die het meest wordt gebruikt om mutagene effecten van genotoxische agentia op te sporen.

De prestaties van de Ames-test bij gebruik van verschillende stammen zijn van groot belang, gezien de eigenaardigheden van elk van deze stammen met betrekking tot de test. Zo is de hisG46-marker in stam TA100 het gevolg van de substitutie van een leucine (GAG/CTC) door een proline (GGG/CCC). Deze mutatie wordt teruggebracht tot de wildtype toestand door mutagenen die primair bij een van de GC-paren substitutiemutaties van basenparen veroorzaken. De hisD3052-mutatie van stam TA98 is een -1-frameshiftmutatie die het leeskader van een nabije repetitieve -C-G-C-G-C-G-sequentie beïnvloedt. De omkering van de hisD3052-mutatie naar het wildtype wordt geïnduceerd door diverse “frameshift”-mutagenen, zoals 2-nitrofluoreen en diverse aromatische nitroso-derivaten van aminecarcinogenen. De hisD6610-mutatie in stam TA97a bevat ook een +1 frameshift-mutatie (cytosine) die leidt tot een reeks van 6 cytosines (-C-C-C-C-). Aangenomen wordt dat deze stam gevoeliger is voor sommige van de mutagenen die stam TA98 doen muteren. Stam TA102 is ontwikkeld met AT-basenparen op de mutatieplaats van hisG428. De mutatie is aangebracht op het multicopy plasmide pAQ1. Het plasmide verleent tetracycline-resistentie, wat een handige marker is om de aanwezigheid van het plasmide aan te tonen. De hisG428-mutatie is een okermutatie, TAA, in het hisG-gen die kan worden teruggedraaid door alle zes mogelijke basenpaarveranderingen; zowel transities als transversies. Deze mutatie wordt ook teruggedraaid door mutagenen die oxidatieve schade veroorzaken, naast het opsporen van cross-linking agents .

Daarnaast kan een biologisch actieve chemische stof in een inactieve metaboliet worden gebiotransformeerd. Evenzo, kan een inactieve chemische stof in een actieve metaboliet worden biotransformed. Daarom is het belangrijk om de S9-fractie in de Ames-test te gebruiken: het maakt het mogelijk om analyses uit te voeren in de aanwezigheid van metabolisme, waardoor betrouwbaardere resultaten worden verkregen.

Wat de veiligheid betreft, bleek uit onze bevindingen dat noch kaurenoïnezuur, noch de onderzochte planten (extracten en oleoharsen) mutagene effecten hadden in de verschillende stammen van Salmonella Typhimurium, ongeacht de S9-activering.

De meeste artikelen over het genus Copaifera hebben betrekking op oleoharsen die uit de boomstam zijn gehaald. Bestudering van bladextracten is echter ook relevant omdat zij veelbelovende bioactieve moleculen bevatten. Het zoeken naar genezing van ziekten door aftreksels van bladeren is wellicht een van de eerste manieren geweest om natuurlijke producten te gebruiken, een praktijk die ook nu nog wordt toegepast. Veel Copaifera spp. worden in verschillende landen als geneeskrachtige planten gebruikt omdat deze soorten talrijke farmacologische eigenschappen bezitten. Zoals voor kaurenoic zuur, zijn ook verschillende biologische effecten gerapporteerd.

Onze studie is de eerste om de veiligheid van de C. lucens en C. oblongifolia soorten te onderzoeken en ook om C. langsdorffii in oleoresin te gebruiken voor de studie van mutageniciteit. De effecten van C. multijuga (oleoresine/extract) op het DNA zijn in eerdere studies onderzocht, waarbij echter andere technieken werden gebruikt dan in onze studie, waarin de Ames-test werd gebruikt. Onze resultaten bevestigen dus de gegevens die zijn gepubliceerd door andere auteurs, die andere soorten Copaifera en hun chemische bestanddelen hebben getest, of andere experimentele modellen hebben gebruikt, en hebben aangetoond dat zij het DNA niet beschadigen.

Op deze manier kunnen de oleoresine van C. multijuga en zijn chemische marker, het diterpeen copalinezuur, geëvalueerd door Alves et al. door middel van de micronucleus assay (V79 cel) en de Ames test voor in vitro onderzoek, alsmede micronucleus en comet assays (Zwitserse muizen) voor in vivo onderzoek. Uit de verkregen gegevens blijkt dat geen van beide onder de gebruikte experimentele omstandigheden een genotoxisch/mutageen effect heeft. Bij vergelijking met onze resultaten blijkt uit deze gegevens dat voor C. multijuga zowel het extract, dat in onze studie werd geëvalueerd, als de oleoresine, zoals geëvalueerd door Alves et al. , geen invloed hebben op het aantal terugmutantkolonies in vergelijking met de negatieve controle in de Ames-test; hetzelfde geldt voor copalinezuur en kaurenoïnezuur. Deze bevindingen suggereren dat mutageniciteit afwezig is, ongeacht de metabole activering.

In een recente studie evalueerden Furtado et al. het genotoxisch potentieel van C. multijuga en de resultaten toonden aan dat er geen schade aan het DNA was, gezien het feit dat de behandeling met zowel oleoresine als het bladextract van C. multijuga de micronucleus-frequentie niet significant verhoogt in vitro (V79-cel) en in vivo (Zwitserse muizen). Bovendien evalueerden de auteurs ook extracten en oleoresines van andere soorten van dit geslacht, zoals C. duckei, C. reticulata, C. paupera en C. pubiflora en evenals de voor C. multijuga gevonden resultaten werd voor alle geteste soorten de afwezigheid van genotoxiciteit gerapporteerd.

De resultaten verkregen in studies van Alves et al. en Batista et al. toonden aan dat C. langsdorffii extract de frequentie van micronuclei (Zwitserse muizen) in respectievelijk perifeer bloed en beenmerg niet significant deed toenemen. In een andere studie bracht de comet-test met Wistar ratten geen significante verschillen aan het licht tussen dieren die alleen met het C. langsdorffii extract waren behandeld en de negatieve controlegroep. Deze gegevens tonen aan dat het extract geen genotoxiciteit vertoont.

Recentelijk toonden de in vivo micronucleustest en de komeetproef met Wistar ratten aan dat het Copaifera malmei-extract niet genotoxisch is en antimutagene activiteit heeft. Bovendien bracht de subchronische toxiciteitstest geen toxicologisch relevante veranderingen aan het licht, zoals bleek uit gedragsmatige, biochemische en hematologische analyses gedurende maximaal 30 dagen. Deze resultaten wijzen op een hoge veiligheidsmarge van het Copaifera malmei-extract voor therapeutisch gebruik. Toxiciteits- en genotoxiciteitsbepalingen toonden aan dat het gebruik van Copaiba olie eveneens veilig is: histopathologisch onderzoek bracht geen veranderingen aan het licht bij met Copaiba olie behandelde dieren, en mutageniteitsbepalingen (micronucleustest; 2000 mg/kg lichaamsgewicht) toonden geen genotoxische effecten aan.

Leandro et al. gebruikten de Ames-test om aan te tonen dat het C. trapezifolia-extract niet mutageen is tegen dezelfde Salmonella Typhimurium-stammen die hier getest zijn, onafhankelijk van metabole activering.

In verband met de chemische samenstelling van de verschillende Copaifera soorten, hebben UPLC-MS/MS en CG/MS analyses van de oleoharsen zure diterpenen en belangrijke vluchtige sesquiterpenen geïdentificeerd, terwijl hoge gehaltes aan fenolische verbindingen, waaronder flavonoïde heterosiden en galloylchinzuurderivaten, in de bladeren zijn geverifieerd. Onder de oleoharsbestanddelen zijn diterpenen veruit de belangrijkste componenten, waaronder ent-agathinezuur, ent-copalinezuur en ent-kaurenoïnezuur, gevolgd door sesquiterpenen zoals β-bisaboleen, α-humuleen en trans-β-caryofylleen. De hydro-alcoholische extracten van de bladeren van de Copaifera-soorten bevatten hoofdzakelijk quercetine, afzeline en chininezuren. zijn Copaiba-oleohars (commercieel product) en de fracties daarvan, die sesquiterpenen, methylesters van diterpeenkarboxylzuren en een hoog gehalte aan β-caryofylleen bevatten, niet genotoxisch, zoals blijkt uit de in vivo comet-test of de micronucleustest. β-caryofylleen, het hoofdbestanddeel van oleoresinen en vluchtige fracties, bevordert geen cytotoxische of genotoxische effecten in menselijke lymfocytenculturen, en het beschermt tegen DNA-schade geïnduceerd door ethylmethaansulfonaat . Evaluatie van negen sesquiterpenen, waaronder trans-caryofylleen, met de Ames-test heeft aangetoond dat geen van de verbindingen mutageen is.

In een recente studie, behandeling van maagkanker en normale maagslijmvlies cellijnen met kaurenoic zuur toonde aan dat het zuur concentratie sterk correleert met de DNA schade-index en met de micronucleus frequentie, zoals bepaald door comet assay en micronucleus test, respectievelijk . Anderzijds meldden Cavalcanti et al. dat lage concentraties kaurenoic zuur, een bioactief diterpenoïde geëxtraheerd uit C. langsdorffii, evenmin DNA-schade veroorzaakt of de micronucleus-frequentie in V79-cellen wijzigt. Significant verhoogde DNA-schade werd pas duidelijk na celblootstelling aan hogere kaurenoic zuur concentraties (30 of 60 μg/mL).

Hier bepaalden we de kaurenoic zuur toxiciteit voor elke geëvalueerde Salmonella Typhimurium stam door gebruik te maken van zuurconcentraties beginnend vanaf de toxiciteitsgrens. Hogere kaurenoëzuurconcentraties verhinderen de groei van bacteriën, waardoor wij het mutagene potentieel van deze verbinding konden beoordelen. Op basis van onze resultaten zijn de hierin geteste oleoharsen zelfs bij de hoogste onderzochte concentraties niet mutageen.

Volgens de literatuur kan het gebruik van verschillende organismen of uiteenlopende testsystemen uiteenlopende resultaten opleveren. Dit komt doordat genotoxiciteits- en mutageniciteitstestsystemen in twee groepen worden ingedeeld. Cytogenetische methoden analyseren eukaryoten en leveren informatie op die varieert van genmutatie tot chromosoombeschadigingen en aneuploïdieën. Met bacteriële methoden daarentegen worden prokaryoten geanalyseerd en wordt informatie verkregen over genmutatie en primaire DNA-beschadiging door een agens.

Zo zijn tests als verwisseling van zusterschromatiden, chromosoomafwijking en micronucleus toegepast om DNA-beschadiging op chromosomaal niveau bij de humane biomonitoring op te sporen, terwijl de Ames Salmonella/microsoom-mutageniciteitstest op grote schaal is gebruikt om de mutagene werking van talloze chemische stoffen en ruwe plantenextracten te verifiëren.

Volgens Ferguson kunnen stoffen clastogeen zijn in het geval van zoogdiercellen, hetgeen het geval is bij stoffen die bij de micronucleustest worden gebruikt. Dezelfde stoffen kunnen echter negatief testen in bacteriële tests zoals de Ames-test. Het is dus van belang de veiligheid van planten of hun chemische verbindingen te evalueren door de verschillende soorten genetische schade te evalueren. Het verdient aanbeveling de Ames-test te combineren met in vitro onderzoek met zoogdiercellen, omdat hiermee verschillende essentiële mutagene parameters (genetische mutaties, structurele chromosoombeschadigingen en aneuploïdie) kunnen worden bestreken en ook de tests in prokaryotische en eukaryotische systemen kunnen worden uitgevoerd. Daarnaast wordt er in de literatuur ook op gewezen dat het onderzoek met de Ames-test niet mag worden weggelaten, omdat met de bacteriële-genmutatietest alle relevante werkingsmechanismen die specifiek tot genmutaties leiden, worden gesignaleerd.

Vorige werkzaamheden hebben uitgewezen dat verbindingen uitsluitend positief kunnen zijn in een of meer van de zoogdiercellijnen, d.w.z. dat de positieve resultaten niet door de Ames-test of in-vivotests werden gestaafd. In feite worden de resultaten die eerst met de Ames-test zijn verkregen, vervolgens gereproduceerd in dierproeven; het ontbreken van mutageniteit in de Ames-test heeft het dus mogelijk gemaakt nieuwe geneesmiddelen met minder bijwerkingen te produceren . Deze gegevens onderstrepen het belang van studies zoals de onze, die met de Ames-test de afwezigheid van mutageniteit van planten en hun voornaamste bestanddelen aantonen.

5. Conclusies

Over het geheel genomen ondersteunen onze resultaten het veilige gebruik van de geselecteerde medicinale planten behorende tot het geslacht Copaifera. Niettemin kunnen de mutagene effecten van afzonderlijke verbindingen worden gemaskeerd door antagonistische effecten van andere verbindingen die aanwezig zijn in extracten of oleoresinen. Dus, onze bevindingen tonen ook aan dat zowel kaurenoic zuur en de geëvalueerde medicinale planten kunnen worden beschouwd als potentieel veilig voor therapeutisch gebruik.

Beschikbaarheid van gegevens

De gegevens die worden gebruikt om de bevindingen van deze studie te ondersteunen zijn opgenomen in het artikel.

Disclosure

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende, en Jaqueline Lopes Damasceno hadden volledige toegang tot alle gegevens in de studie en nemen de verantwoordelijkheid voor de integriteit van de gegevens en de nauwkeurigheid van de gegevensanalyse.

Conflicts of Interest

De auteurs hebben geen belangenconflicten bekend te maken.

Bijdragen van de auteurs

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani, en Jairo Kenupp Bastos leverden substantiële bijdragen aan concept en ontwerp, acquisitie, analyse, en interpretatie van gegevens. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende, en Carlos Henrique Gomes Martins hebben meegewerkt aan het opstellen van het manuscript of hebben het kritisch herzien op belangrijke intellectuele inhoud. Carlos Henrique Gomes Martins en Flávia Aparecida Resende hebben ermee ingestemd verantwoordelijk te zijn voor alle aspecten van het werk. Alle auteurs hebben het definitieve manuscript gelezen en goedgekeurd.

Acknowledgments

De auteurs danken CAPES (Coördinatie voor de Verbetering van het Hoger Onderwijs Personeel), CNPq (Nationale Raad voor Wetenschappelijke en Technologische Ontwikkeling), en São Paulo Research Foundation (FAPESP, Grants nos. 2011/13630-7 en 2012/25237-0) voor financiële steun en de Universiteit van Franca voor de ontvangen steun. Jaqueline Lopes Damasceno ontving een CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personeel) doctoraatsbeurs.