Gen targeting in embryonic stem cells

Door het proces van gene targeting in ES-cellen kan potentieel elke gewenste genetische manipulatie in de kiembaan van muizen worden ingebracht. Specifieke gensequenties kunnen constitutief of conditioneel worden verwijderd (Knock-out), specifieke mutaties of basenpaarwijzigingen kunnen precies binnen een gen van belang worden aangebracht en reportergenen of andere expressiecassettes kunnen op gedefinieerde plaatsen in het genoom worden ingebracht (Knock-in). Met behulp van deze technologie kunnen sequenties in muizen worden vervangen door sequenties in mensen om gehumaniseerde muismodellen te genereren.

De ontwikkeling van deze techniek kan tot een jaar in beslag nemen, zodat het van essentieel belang is om aan het begin van het project veel tijd te investeren om ervoor te zorgen dat de meest geschikte technologie en genetische strategie voor het vereiste model worden geselecteerd. De transgene kern kan bij dit soort beslissingen advies verlenen en het is van essentieel belang dat alle targeting-projecten in detail met de kern worden besproken voordat met het werk in het laboratorium wordt begonnen.

Wanneer een strategie is bepaald, wordt een targeting-vector geconstrueerd en wordt een robuuste screening-strategie ontworpen en getest om ervoor te zorgen dat de vereiste genomische manipulatie op genomisch niveau kan worden gedetecteerd. De doelvector wordt vervolgens getransfecteerd in ES-cellen en recombinante klonen worden gescreend op de gewenste homologe recombinatie. Deze cellen worden vervolgens geïnjecteerd in pre-implantatie-embryo’s en de resulterende chimere muizen worden gebruikt voor het fokken van de genetisch gemodificeerde muizenlijn.

Dienst

Er wordt een flexibele dienst aangeboden die kan worden opgesplitst in de specifieke stadia van modelontwikkeling, afhankelijk van de beschikbare middelen.

Initiëring van een project – gratis

• Advies met de groep om een geschikte technologie te vinden om tot een veilig, bruikbaar model te komen
• Screening van gene trap databanken voor reeds bestaande ES cel klonen
• Screening van Knock-out consortium bronnen voor reeds bestaande targeting vectoren, ES cel klonen en modellen

Advies voor de constructie van targeting vectoren – gratis

• Genomische sequentie analyse om regio’s te identificeren die een hoge waarschijnlijkheid hebben om bruikbare homologie regio’s te zijn voor gen targeting
• Advies met de groep om de genetische strategie te bepalen die nodig is om een veilig, bruikbaar model
• Bouw van de doelvector wordt niet door de kern verzorgd, maar de kern kan helpen bij de levering van cassettes en methodologisch advies
• Opstelling van de screeningstrategie wordt niet door de kern verzorgd, maar de kern kan helpen bij de levering van cassettes en methodologisch advies advies

Gene Targeting in Embryonale Stamcellen

• Transfectie van de voltooide targetingvector in embryonale stamcellen
• Isolatie en opslag van ten minste 192 onafhankelijke recombinante celklonen
• DNA-preparatie en levering van 96 wells platen voor screening
• Dooiing, expansie van vermeend positieve klonen
• Voorbereiding van extra DNA van vermeend positieve klonen voor bevestigingsscreening
• Karyotype-analyse van de doelklonen

Blastocyst-injectie van ES-celklonen

• Injectie van ES-cellen in pre-implantatie-embryo’s
• Generatie en huisvesting van chimaera’s gedurende ten hoogste 3 weken.
• Aanbevelingen voor kweekstrategie