Introduction

Veel eigenschappen worden gereguleerd en gecoördineerd door meerdere genen en omgevingsfactoren. In de natuur evolueren deze eigenschappen voortdurend onder lokale selectiedruk en neutrale processen, wat leidt tot een rijke diversiteit aan fenotypische variëteiten en omgevings-capacing strategieën. Dobzhansky (1964) beschreef reeds de rijke diversiteit in de levende wereld als het resultaat van genetische diversiteit, heterogeniteit in het milieu, en aanpassingen die zich ontwikkelen op het raakvlak tussen moleculaire en organismische biologie. De moleculaire mechanismen in de evolutie zijn bijzonder moeilijk te karakteriseren. In de eerste plaats moet er een verband worden gelegd tussen het genotype en het fenotype. Deze link bestaat uit uitgebreide en ingewikkelde geninteractienetwerken (Ayroles et al., 2009; Lehner, 2013). Ten tweede moeten we de moleculaire veranderingen identificeren die verantwoordelijk zijn voor fenotypische aanpassingen. Dit hangt af van het ophelderen van de genetische variatie en de genetische veranderingen die overal in de gen-interactie netwerken kunnen optreden (bv. Edwards et al., 2009).

De manifestatie van genetische variatie in gen-netwerken is zeer complex. Veranderingen in afzonderlijke genen kunnen de activiteit en zelfs de topologie van het hele genetische netwerk beïnvloeden (bv. Knight et al., 2006). Genen en gen-interactie netwerken zijn vaak pleiotroop en reguleren verschillende eigenschappen en processen, wat impliceert dat veranderingen in een enkel gen zich kunnen manifesteren in verschillende eigenschappen (Stearns, 2010). Omgekeerd kunnen allelische variaties in vele genen bijdragen tot de variatie in een bepaalde fenotypische eigenschap (Manolio et al., 2009). Bovendien is epistasis alomtegenwoordig, wat impliceert dat allelische variaties op meerdere loci de fenotypische effecten van elkaar kunnen beïnvloeden (Phillips, 2008; Mackay en Moore, 2014; Moore en Williams, 2015). Deze overwegingen over de genetische basis van evolutie zijn niet nieuw, en worden al enkele decennia bestudeerd (bv. Wagner en Altenberg, 1996). Voorwaartse en omgekeerde genetica zijn zeer succesvol geweest in het ophelderen van de functies van afzonderlijke genen of mutaties voor een bepaalde eigenschap (Nagy et al., 2003). Deze technieken zijn echter beperkend bij het bestuderen van de complexiteit van moleculaire interactienetwerken die ten grondslag liggen aan een fenotype, of de moleculaire mechanismen van de evolutie van complexe eigenschappen.

De ontwikkelingen in de genomics-technologie hebben een belangrijke impuls gegeven aan ons vermogen om genetische complexiteit van fenotypische eigenschappen en hun evolutie te bestuderen (Stapley et al., 2010). De combinatie van deze technieken met de klassieke genetische benaderingen stelt ons in staat om de functionaliteit van genetische variatie voor fenotypische eigenschappen te beoordelen (Storz en Wheat, 2010). De eerste genomische studies op verschillende modelorganismen benadrukten dat evolutionaire aanpassingen, zelfs voor specifieke milieuomstandigheden, over het algemeen vele genen of loci beheersen, evenals de dynamische regulatie van genexpressiepatronen (Gasch et al., 2000; Fay et al., 2004; Pedra et al., 2004). In het daaropvolgende decennium werd in veel studies gebruik gemaakt van genomica om genen en eiwitten te identificeren die bijdroegen tot bepaalde eigenschappen en ecologische interacties. Aanvankelijk waren de kosten en de tijd die nodig waren voor het sequencen van één enkel genoom nog zeer beperkend. Next Generation Sequencing heeft het echter mogelijk gemaakt de genomen van veel meer soorten, en veel meer individuen per soort, te sequencen. Dit is een formidabel hulpmiddel om evolutie te bestuderen, omdat het ons voor het eerst in staat stelt de veranderingen in het hele genoom tijdens de evolutie in kaart te brengen.

Genomicstechnologie heeft enorme mogelijkheden om ons inzicht in evolutionaire processen te verbeteren. Vergelijkende benaderingen zijn toegepast om de veranderingen in de genoomsequenties of geninteractienetwerken op lange evolutionaire tijdschalen in kaart te brengen (Drosophila 12 Genomes Consortium et al., 2007; Nowick et al., 2009; Jones et al., 2012). Experimentele selectie of experimentele evolutie benaderingen, gevolgd door hetzij transcriptomics of genoom sequencing, zijn gebruikt om evolutionaire veranderingen op veel kortere tijdschalen in kaart te brengen (Hunt et al., 2010; Turner et al., 2011; Wertheim et al., 2011; Tenaillon et al., 2012; Linnen et al., 2013; Jalvingh et al., 2014). Deze studies toonden bijvoorbeeld aan hoe genverdubbelingen, mutaties en sterke sequentieverschillen in een kleine subset van genen een diepgaande invloed kunnen hebben op de transcriptionele activiteit van grote geninteractienetwerken en meerdere fenotypische eigenschappen.

In dit perspectief presenteer ik recente bevindingen en ontwikkelingen over de genomische basis van evolutie, waarbij ik evoluerende immuniteit als casestudy gebruik. Immuniteit is een eigenschap die snel evolueert, waardoor het zich goed leent om de genomische basis van evolutionaire processen te bestuderen (Obbard et al., 2009; Sironi et al., 2015). Bovendien zijn moleculaire netwerken in immuniteit vrij goed gekarakteriseerd vanwege hun belang voor de menselijke gezondheid (Schadt, 2009; Lazzaro en Schneider, 2014; Zak et al., 2014). Eerst geef ik een zeer korte samenvatting van onze huidige kennis over de moleculaire netwerken van aangeboren immuunresponsen en de selectieprocessen die inwerken op immuunresponsen. Vervolgens beschrijf ik de genomische veranderingen, geassocieerd met de winst, het verlies en de modulatie van bepaalde aspecten van immuunresponsen in Drosophila. Tenslotte stel ik toekomstige richtingen voor om de genetische architectuur van complexe eigenschappen en evolutionaire processen te bestuderen.

Immuunresponsen

Het immuunsysteem bestaat uit een combinatie van fysiologische processen die gezamenlijk optreden bij de verdediging tegen ziekteverwekkers en parasieten. De aangeboren immuniteit is een oude eigenschap die bij alle meercellige organismen kan worden aangetroffen, terwijl gewervelde dieren ook een verworven immuniteit bezitten. Beide immuunsystemen combineren cellulaire en humorale componenten: de cellulaire component omvat gespecialiseerde cellen die een beschermende functie vervullen. Dit omvat, klassen van bloedcellen voor fagocytose van microben, inkapseling van grotere vreemde lichamen of herkenning van antigenen (bij verworven immuniteit), en de bekleding van de darm met epitheelcellen die een fysieke barrière vormen en afweerstoffen kunnen afscheiden. De humorale component bestaat uit het vrijkomen van extracellulaire factoren die de binnendringende ziekteverwekkers bestrijden, vaak vanuit gespecialiseerde weefsels of celpopulaties. Dit omvat het vrijkomen van antimicrobiële peptiden (AMP’s) door de lever (of het vetlichaam bij ongewervelden) en darm-epitheelcellen, reactieve zuurstofspecies in fagocyterende en epitheelcellen, en antilichamen van witte bloedcellen (bij verworven immuniteit; Lemaitre en Hoffmann, 2007; Buchmann, 2014).

Complexe netwerken van moleculaire interacties coördineren de immuunreacties (figuur 1A). Dezelfde paden staan centraal in immuunreacties van ongewervelde tot gewervelde dieren, wat een sterke instandhouding impliceert van de kernelementen van moleculaire netwerken in immuniteit (Silverman en Maniatis, 2001; Evans et al., 2003; Buchmann, 2014). Een verscheidenheid aan receptormoleculen kan pathogenen of parasieten herkennen, bijvoorbeeld op basis van pathogeen-geassocieerde moleculaire patronen (bijv. lipopolysacchariden die specifiek zijn voor bacteriële membranen). Zodra receptoren geactiveerd zijn, induceren zij specifieke signaaltransductie pathways, zoals de Toll, Imd, en Jak/Stat pathways (besproken in Lemaitre en Hoffmann, 2007; Buchmann, 2014). Deze routes bestaan uit proteasen, kinasen, cytokinen en andere eiwitten die uiteindelijk transcriptiefactoren en co-factoren activeren. Inductie van deze transcriptiefactoren resulteert in de productie van humorale effectormoleculen (bv. AMP’s) en het kan de proliferatie en differentiatie induceren van cellen die betrokken zijn bij immuniteit. De productie van verschillende klassen bloedcellen is een prominent aspect van de cellulaire component van de immuunrespons, zowel bij aangeboren als verworven immuniteit. In deze bloedcellen worden ook signaaltransductiecascades gereguleerd om celeigenschappen en eiwitten te induceren die de opruiming van de parasiet bewerkstelligen. Om de sterkte, specificiteit, timing en duur van immuunreacties te reguleren, worden de moleculaire netwerken gemoduleerd door cytokinen, proteasen, en cross-talk met andere signaalwegen (Liew et al., 2005; Aggarwal and Silverman, 2008). Dit omvat ook diverse post-transcriptionele regulatorische netwerken (Ivanov en Anderson, 2013; Carpenter et al., 2014).

De drijfveren van de evolutionaire veranderingen in de immuunresponsen zijn de gecombineerde effecten van de hoge fitness kosten van infectie op de gastheren, de kosten van immuniteit, de rijke diversiteit van pathogenen en parasieten die de gastheren bedreigen, en de dynamische co-evolutionaire wapenwedloop tussen gastheren en pathogenen (Schmid-Hempel, 2003). Elk van deze aspecten of al deze aspecten kunnen in de lokale omgeving van de gastheer werkzaam zijn en tot een sterke selectiedruk leiden. Het type selectie varieert echter van directioneel tot zuiverend tot balancerend, afhankelijk van de kosten en baten die de gastheerpopulatie in zijn lokale omgeving ervaart. Zo kan bijvoorbeeld een zeer virulente ziekteverwekker die een lokale gemeenschap binnendringt, een selectieve sweep of gerichte selectie voor bepaalde resistentie-allelen veroorzaken, aangezien alleen de gastheren met deze allelen aan de volgende generaties kunnen bijdragen. Anderzijds kan een diverse of co-evoluerende gemeenschap van ziekteverwekkers frequentie-afhankelijke of balancerende selectie veroorzaken, die het behoud van genetische variatie bevordert. Evolutie van de immuunresponsen weerspiegelt zowel deze co-evolutionaire dynamiek met de parasiet, als de fysiologische en ecologische kosten van het immuunsysteem (Kraaijeveld et al., 2002; Rolff en Siva-Jothy, 2003; Schmid-Hempel, 2005; Lazzaro en Little, 2009).

Genomic Basis of Evolutionary Change in Drosophila Immunity

Terwijl de centrale machinerie van immuunreacties sterk geconserveerd is, kunnen verschillende componenten van de uitgebreide moleculaire netwerken snel evolueren of diversifiëren (Figuur 1B). In Drosophila is snelle evolutionaire verandering gerapporteerd voor de receptoren en de effectoren van de immuunrespons (Sackton et al., 2007; Obbard et al., 2009; Salazar-Jaramillo et al., 2014). Deze moleculen opereren op het raakvlak tussen de gastheer en de ziekteverwekker, en zijn daarom cruciaal voor de herkenning door de gastheer van een binnendringend organisme, en voor het bemiddelen van de doelgerichte en antagonistische effecten van de immuunrespons op de ziekteverwekker. Tegelijkertijd is de parasiet onderhevig aan selectie om onopgemerkt te blijven, om de antagonistische effecten van de immuunrespons te vermijden of te verzachten. Daarom wordt een Rode Koningin-dynamiek verwacht voor deze moleculen op het raakvlak, en voor de moleculen die de immuunreacties moduleren. Elke partij probeert de bovenhand te krijgen in de antagonistische wapenwedloop, waarbij wederzijds veranderingen in de genetische netwerken van de partijen worden gestimuleerd. De diversificatie in receptor-, modulator- en effectormoleculen wordt meestal bereikt door genverdubbelingen en snelle sequentieveranderingen (Drosophila 12 Genomes Consortium et al., 2007; Sackton et al., 2007; Salazar-Jaramillo et al., 2014).

We hebben de immuunrespons van Drosophila tegen parasitoïde wespen bestudeerd als een modelsysteem om de genomische basis van evolutionaire processen te begrijpen. Drosophila larven zijn gastheer voor een verscheidenheid van parasitoïde soorten die een ei leggen in deze larven (Fleury et al., 2009). Zodra het parasitoïdenei uitkomt (∼2-4 dagen na de parasitoïdenaanval, afhankelijk van de parasitoïdensoort en de temperatuur), begint de parasitoïdenlarve zich te voeden met de gastheer en doodt deze. Sommige soorten Drosophila hebben een verdedigingsmechanisme tegen parasitoïden door middel van een aangeboren immuunrespons, melanotische inkapseling genoemd. Deze immuunrespons bestaat uit cellulaire en humorale componenten die gezamenlijk het ei van de parasitoïde insluiten en doden. De aanval van de parasitoïde zet immuun-signaal transductie pathways in gang die (i) de proliferatie en differentiatie van twee klassen van hemocyten (d.w.z., insecten bloedcellen) induceren die zich aan het parasitoïde ei en aan elkaar hechten, en (ii) de afzetting van melanine op het parasitoïde ei en de cellulaire capsule rond het parasitoïde ei (Lemaitre en Hoffmann, 2007). De gastheer moet de volledige inkapseling en melanisatie voltooien voordat het parasitoïde ei uitkomt om de parasitoïde plaag te overleven.

Vóór het genomics tijdperk, waren verschillende genen geïdentificeerd die betrokken waren bij de immuunrespons tegen parasitoïde wespen. De Toll en Jak/Stat pathways waren geïdentificeerd als centrale componenten van de hemocyte proliferatie en differentiatie, en de prophenoloxidase pathway voor melanisatie (besproken in Brennan en Anderson, 2004). Twee microarray studies werden vervolgens uitgevoerd om bijkomende genen te identificeren die mogelijk betrokken zijn bij de melanotische inkapseling na een parasitoïde aanval. Deze aanpak bracht veel extra genen aan het licht die nog niet eerder in verband waren gebracht met de immuunrespons tegen parasitoïden, en onthulde hun werkingsmoment (Wertheim et al., 2005; Schlenke et al., 2007). De studies onthulden verschillende gecoördineerde en functioneel samenhangende clusters van genen die tijdelijk werden geüp- of gedownreguleerd tijdens een deel van de immuunrespons (Wertheim et al., 2005). Interessant was dat werd aangetoond dat de virulentiemechanismen van twee parasitoïdesoorten verschilden in de manier waarop ze ingrepen in het genetische netwerk van de gastheerreacties: één soort schakelde de initiële activering van het hele netwerk uit, terwijl een andere soort zich richtte op de laatste stap in de cascade (Schlenke et al., 2007).

Soorten van Drosophila verschillen sterk in immuniteit tegen parasitoïden. Sommige soorten zijn volledig vatbaar voor parasitoïden en dit werd gerapporteerd als een immunodeficiëntie (Eslin en Doury, 2006). Bij nadere beschouwing bleek echter dat parasitoïdenresistentie niet algemeen voorkomt bij alle Drosophila soorten, maar beperkt is tot een paar clades. We toonden aan dat in een van die clades, de melanogaster subgroep, de evolutionaire winst van parasitoïdenresistentie geassocieerd was met de winst van een nieuw type bloedcel, de lamellocyten, dat ook beperkt is tot dezelfde clade (Salazar-Jaramillo et al., 2014). Sommige Drosophila soorten buiten de melanogaster subgroep kunnen ook parasitoïde eitjes inkapselen, maar zij lijken verschillende typen bloedcellen te hebben geëvolueerd voor de inkapselingsrespons (Havard et al., 2012; Márkus et al., 2015). De immuunrespons tegen parasitoïden is onafhankelijk geëvolueerd in verschillende insectentaxa, vaak met iets andere mechanismen en typen bloedcellen (Lavine en Strand, 2002). De evolutie van het aangeboren immuunsysteem omvat dus de toevoeging van nieuwe componenten of “modules”. Dit roept de vraag op hoe het genoom verandert tijdens de verwerving van een nieuwe module.

Comparatieve genomics onthulde dat, ondanks de verwerving van een nieuw type bloedcel in de melanogaster subgroep, de genen die bekend zijn voor lamellocyte differentiatie grotendeels geconserveerd zijn over de hele fylogenie. Ook soorten die geen lamellocyten produceren als reactie op parasitoïde aanvallen bezitten deze genen die nodig zijn voor lamellocyte differentiatie. Bovendien vertonen deze genen weinig divergentie of tekenen van selectie, terwijl dat wel verwacht zou worden voor genen die een nieuwe functie hebben gekregen. Dit wijst erop dat de bestaande signaaltransductieroutes voor hemocytdifferentiatie gemoduleerd worden door het omringende geninteractienetwerk om een nieuw type bloedcel te produceren in de melanogaster subgroep. Deze coöptatie van de bestaande kern hemocyte proliferatie pathway wordt waarschijnlijk bereikt door het toevoegen van andere of nieuwe componenten aan het gen interactie netwerk (Salazar-Jaramillo et al., 2014). We identificeerden verschillende nieuwe genen die ontstonden rond de tijd van lamellocytaire verwerving en differentieel tot expressie komen tijdens de immuunrespons tegen parasitoïden, waaronder receptormoleculen en serine-type proteasen (Salazar-Jaramillo et al., 2014). Wij veronderstellen dat vooral de serine-type endopeptidases een cruciale rol kunnen spelen in deze uitbreiding van het gen interactie netwerk. Een aanzienlijk aantal van deze moleculen ontstond op het moment van lamellocytenverwerving, ze komen tot expressie op het juiste moment in de immuunrespons, en ze vertonen sterke signaturen van positieve selectie (Wertheim et al., 2005; Salazar-Jaramillo et al., 2014).

Ook binnen één soort, D. melanogaster, vertonen immuunresponsen grote genetische variatie. Veldpopulaties verzameld uit heel Europa vertonen aanzienlijke verschillen in het vermogen om parasitoïde-eieren succesvol in te kapselen (Kraaijeveld en van Alphen, 1995; Kraaijeveld en Godfray, 1999; Gerritsma et al., 2013). Blijkbaar verschillen de kosten en baten van een sterke immuunafweer geografisch, wat leidt tot modulatie en differentiatie van co-adaptieve genetische netwerken. Dit werd ook weerspiegeld in de hemocytische respons na parasitoïde aanval. De veldlijnen varieerden aanzienlijk in de absolute en relatieve aantallen van de verschillende hemocyten die ze produceerden als reactie op een parasitoïde aanval, zelfs onder de lijnen die zeer succesvol waren in inkapseling (Gerritsma et al., 2013). Dit benadrukt opnieuw dat de genetische achtergrond van een populatie en de gecombineerde lokale selectiedruk leiden tot alternatieve evolutionaire reacties. Het vergelijken van de genomen van resistente en vatbare individuen uit verschillende populaties kan de adaptieve variatie in de genetische architectuur van deze eigenschap onthullen.

Om de veranderingen in het genoom tijdens de evolutie van verhoogde resistentie in kaart te brengen, voerden we experimentele evolutie uit voor parasitoïdenresistentie. In het laboratorium stelden we een grote outbred populatie bloot aan parasitoïden. Alleen de larven die erin slaagden de parasitoïde aanval te overleven, mochten bijdragen aan de volgende generatie. Met deze aanpak verhoogden we het resistentieniveau van 20 tot ∼50% van de larven die een parasitoïde aanval overleefden na slechts vijf generaties van selectie. Toen we de veranderingen in genexpressie in de geselecteerde populaties maten, vergeleken met de genexpressie in de controlelijnen, zelfs vóór de parasitoïde aanval, vonden we enkele honderden genen die licht verschillend gereguleerd werden (Wertheim et al., 2011). De veranderingen betroffen vooral genen die niet differentieel tot expressie kwamen tijdens de immuunrespons, wat aangeeft dat de evolutionaire veranderingen de immuunrespons niet pre-activeerden in afwachting van een parasitoïde aanval, maar dat ze de canonieke ontwikkelingsroute moduleerden, wat (ook) leidde tot een toename van de verdedigingscapaciteiten van de parasitoïde. We herhaalden dit experiment, en sequencieerden vervolgens de genomen van de geselecteerde en controle populaties. In de genomen van de lijnen die een verhoogde resistentie evolueerden, vonden we handtekeningen van selectie op meerdere nauw gedefinieerde regio’s van het genoom (Jalvingh et al., 2014). Sommige van deze regio’s overlapten ook met de regio’s die veranderde expressie vertoonden na selectie voor verhoogde resistentie (Wertheim et al., 2011; Jalvingh et al., 2014). Een snelle en sterke selectieve sweep op een complexe eigenschap als immuniteit kan dus nog steeds meerdere, maar zeer gelokaliseerde, genomische regio’s beïnvloeden.

Toekomstige uitdagingen

Hoe gaan we de evolutionaire veranderingen op lange termijn, zoals de verwerving van nieuwe genen in geninteractienetwerken, en de evolutionaire veranderingen op korte termijn, zoals sequentievarianten die door een populatie kunnen worden geveegd, met elkaar in overeenstemming brengen? De sleutel hiertoe is (i) het reconstrueren van het gen-interactie netwerk dat ten grondslag ligt aan complexe eigenschappen, en (ii) het karakteriseren van de rol van genetische variatie binnen deze netwerken. Genetische netwerken kunnen zich uitbreiden met nieuwe genen door bijvoorbeeld duplicaties, kunnen onderling verbonden raken met andere netwerken of modules, en kleine sequentievariaties kunnen de activiteit en topologie van de netwerken moduleren. Als we de genetische netwerken kunnen ontleden, en de rol van genetische varianten in een netwerkcontext kunnen beoordelen, zal dit ons uiteindelijk in staat stellen te bepalen hoe genetische variatie wordt vertaald in fenotypische variatie. Dit zal ook ons begrip van de moleculaire basis van complexe menselijke ziekten en de evolutie van aangeboren en verworven immuniteit verbeteren (Cooper en Alder, 2006; Manolio et al., 2009; Star et al., 2011; Mackay en Moore, 2014; Sironi et al., 2015).

Systeembiologische benaderingen zullen van onschatbare waarde zijn voor het ontrafelen van de complexe gen-interactie netwerken. Daar worden wiskundige modellen ontwikkeld om de moleculaire mechanismen te beschrijven die ten grondslag liggen aan een eigenschap en om de dynamiek te voorspellen van groepen van interacterende componenten van het netwerk. De modellen zijn gebaseerd op gegevens uit de moleculaire genetica en de genomica. Momenteel wordt systeembiologie vooral toegepast op specifieke eigenschappen in eencellige organismen, en dit wordt beschouwd als de grens van wat kan worden bereikt (Papp et al., 2011). Het is echter waarschijnlijk dat dit model niet representatief is voor de evolutie in zich seksueel voortplantende meercellige organismen. In plaats van te wachten tot de vereenvoudigde modellen kleine subnetwerken accuraat weergeven, moeten we onze methoden ontwikkelen en verfijnen om de opkomende eigenschappen uit de enorme hoeveelheid genomics data te gebruiken en te kwantificeren. We kunnen gen-interactie netwerken afleiden uit eiwit-eiwit of transcript correlatie of co-expressie matrices (Shannon et al., 2003; Langfelder en Horvath, 2008), en deze samenvoegen met natuurlijke variant analyses (Nuzhdin et al., 2012). We moeten deze methoden en alternatieve benaderingen verder ontwikkelen om onze metingen aan genomics-data volledig te benutten, en om deze kwantitatieve metingen om te zetten in netwerkanalyses. Hoewel genomicagegevens op zich niet het volledige antwoord zullen geven op de vraag wat het aanpassingsvermogen van het leven bepaalt, stellen ze ons wel in staat om te kwantificeren en te observeren wat er op moleculair niveau tijdens de evolutie gebeurt. Wanneer we dit combineren en integreren met de heterogeniteit van het milieu als drijvende kracht achter de aanpassingen, kunnen we wellicht de complexe moleculaire mechanismen van aanpassing en evolutie blootleggen.

Conflict of Interest Statement

De auteur verklaart dat het onderzoek is uitgevoerd in afwezigheid van enige commerciële of financiële relaties die zouden kunnen worden opgevat als een potentieel belangenconflict.

Acknowledgments

Ik dank Kirsten Jalvingh, Laura Salazar-Jaramillo, en Sylvia Gerritsma voor waardevolle discussies. BW werd ondersteund door financiering van de Nederlandse Organisatie voor Wetenschappelijk Onderzoek (NWO; subsidie 864.08.008).