Materialen en methoden

Sample collection

Deelnemers van 18 jaar en ouder werden uitgenodigd om deel te nemen aan de studie via e-mailberichten en advertenties op prikborden aan de University of British Columbia, Vancouver BC. Deelnemers werd gevraagd monsters te nemen met behulp van droge buccale swabs (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) en buccale swabs met sponsjes (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) aan de hand van instructies die ze zelf konden uitvoeren; de volgorde waarin deze monsters werden genomen, werd door de computer gerandomiseerd. Een onderzoeksassistent was aanwezig tijdens de staalafname om vragen te beantwoorden die deelnemers hadden over de instructies voor de staalafname. Alle monsters werden bewaard bij kamertemperatuur. Farmacogenetische rapporten werden niet aan de deelnemers gegeven, omdat dit buiten het bestek van deze studie viel.

DNA-extractie

DNA werd geëxtraheerd met de Ambion MagMAX bead-based DNA-extractiekit (Applied Biosystems, Foster City, CA) volgens de instructies van de fabrikant. Het DNA werd 3 dagen na de monsterafname geëxtraheerd en geëlueerd in 60 µl. De kwantiteit en kwaliteit van het DNA werden beoordeeld met behulp van de Qubit 2.0 fluorescentietest (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). De zuiverheid van de monsters werd bepaald aan de hand van de optische dichtheid A260/280 (ODA260/280) waarden met behulp van NanoVue spectrofotometer.

Genotypering

Genotypering werd uitgevoerd op het QuantStudio 12K Flex kwantitatieve polymerase kettingreactie (qPCR) instrument (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) op door de fabrikant gevalideerde assays (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). De inhoud van de assays omvatte 28 SNPs die de geneesmiddelenrespons beïnvloeden op het OpenArray-platform (zie aanvullend bestand 2) en een CYP2D6 CNV TaqMan-assay (Assay ID: Hs_00010001_cn). Om de assays te valideren, werden 44 DNA-controles van het National Institute of General Medical Sciences (NIGMS), Human Genetic Cell Repository van het Coriell Institute for Medical Research gegenotypeerd. De overeenstemming van de oproepen met het verwachte genotype werd bevestigd. Bovendien werden de resultaten geverifieerd door Sanger-sequencing van het controle-DNA. Voor elke run werden de deelnemermonsters in duplo uitgevoerd op de OpenArray en in viervoud op de CNV-assay, samen met Corriell DNA-monsters die als positieve controles en no template-controles (NTC’s) werden gebruikt.

Statistische analyse

De TaqMan Genotyper software v1.3.1 (Applied Biosystems) werd gebruikt om de oproeppercentages voor SNP-genotypering op de OpenArray te bepalen. Voor elke OpenArray assay werd het genotype-aanroeppercentage berekend door het totale aantal met succes toegewezen genotypen te delen door het totale aantal pogingen tot genotypetoewijzing.

Voor de CNV TaqMan assay werd CopyCaller v2.1 software (Applied Biosystems, Foster City, CA) gebruikt om CYP2D6-kopiegetalaanroepen en CNV-vertrouwensscores toe te wijzen. DNA-monsters kregen een wild-type diploïd kopiegetal toegewezen en kopiegetalvariatie (deletie- of duplicatiegebeurtenissen) werden gegroepeerd in respectievelijk de 2N- en CNV-groepen. Een 95% genotypering call rate en 95% vertrouwensscore werd ingesteld voor SNP en CNV genotyperingsresultaten, respectievelijk. Een twee-sample Student’s t-toets uitgaande van ongelijke varianties werd berekend om het significante verschil tussen DNA-opbrengst, zuiverheid en oproepingspercentages van de verschillende DNA-types in paren te bepalen. De genotyperingstoewijzingen gegenereerd uit het DNA-monstertype (sponge-tipped vs dry-flocked) van dezelfde deelnemer werden vergeleken om concordantie te berekenen.

Resultaten

Eénendertig deelnemers werden gerekruteerd en verzamelden sponge-tipped swabs en dry-flocked swabs. Deelnemers vonden de zelfbegeleide instructies voor het afnemen eenvoudig en gemakkelijk te volgen voor beide soorten swabs. Deelnemers stelden vragen over de benodigde druk voor het uitwrijven van de swabs en de juiste plaatsing van de swabs in de mond. De opmerkingen van de deelnemers over de twee swabs waren vergelijkbaar: sommigen gaven de voorkeur aan swabs met een sponsje en anderen aan swabs met een droog afsluitdopje; er was geen consensus.

Er was een significant verschil in gemiddelde DNA-opbrengst tussen DNA afgenomen met swabs met een droog afsluitdopje en met swabs met een sponsje (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabel 1). De gemiddelde DNA-zuiverheid voor alle afnametypes lag binnen het aanvaarde bereik voor zuiver DNA (gemiddelde (SD)) 1,72(0,78) en 1,85(0,39) voor respectievelijk droge swabs en swabs met sponsjes.

Er waren drie monsters van spons-getipte swabs met een lage DNA-concentratie (< 5 ng/µl). Deze drie monsters hadden 100% genotyperingscalls op de OpenArray en 100% CNV-betrouwbaarheidsscores (Fig. 1). Omgekeerd had één van de monsters met een DNA-concentratie van 79 ng/µl de laagste OpenArray-call rate (18%). De hoogste oproeppercentages op de OpenArray (> 95%) voor droog-gesloten swabs werden waargenomen voor zeven monsters met een concentratie variërend tussen 1,2 en 8,9 ng/µl (fig. 1a). De hoogste CNV-betrouwbaarheidsintervallen (> 95%) werden waargenomen voor monsters met een concentratie tussen 1,0 en 24,4 ng/µl (fig. 1b).

Voor alle assays op de OpenArray, DNA-monsters afgenomen met sponsvormige swabs resulteerden in een hoger percentage genotyperingsoproepen (97%) in vergelijking met droog gevouwen swabs (54%) (afb. 2). Met een toegevoegde stap van een 0,5 × verdunning van het geëxtraheerde DNA hadden de swabs met sponsjes een consistent genotyperingscallpercentage > 95%. Sample call rate op de OpenArray varieerde per individu met 29 (93,5%) deelnemers met sample call rates > 95% van sponge-tipped swab DNA en 4 (12,9%) met sample call rates > 95% van dry-flocked swab DNA. Een concordantie van 94% van succesvol genotypeerde tests werd waargenomen tussen sponsstaafjes en droog-locked swabs verzameld bij dezelfde persoon.

Copy number calls voor CYP2D6 werden toegewezen aan 2 (6,5%) van de monsters van sponsuitstrijkjes met een algemene betrouwbaarheidsscore van 0,99. Ter vergelijking, 8(25,8%) van de monsters van droge-locked swabs kregen copy number calls toegewezen met een algemene vertrouwensscore van 0,91 (zie Additional file 3).

Discussie

Het doel van dit onderzoek is om onderzoekers, en bedrijven, te helpen bij het identificeren van een optimale afnamemethode die DNA van hoge kwaliteit oplevert voor genotypering. Deze studie levert nieuwe informatie over de DNA-kwaliteit voor twee soorten swabs, die hoog was (gedefinieerd als ODA260/A280 1,8) hoewel er een significant verschil was in DNA-opbrengst (p-waarde = 4,4-7). Op het OpenArray-platform hadden swabs met sponsstaafjes het hoogste algemene genotyperingscallpercentage (97% vs. 54%) en de hoogste vertrouwensscore voor CYP2D6 CNV TaqMan Assay (0,99 vs. 0,91). Een > 95% SNP-genotyperingscall van 95% wordt beschouwd als gegevens van aanvaardbare kwaliteit en een CNV-betrouwbaarheidsscore van 99% wordt beschouwd als gegevens van hoge kwaliteit.

Eén DNA-monster geïsoleerd uit de spons-tip swab had een call rate van minder dan 95%. In de routine-laboratoriumpraktijk zouden monsters met een laag belpercentage worden teruggenomen als gevolg van onvolledige resultaten voor patiëntenrapporten. Het weglaten van dit monster verhoogde het totale genotyperingscijfer tot 99,5% voor de sponsstaafjes.

CYP2D6 CNV-resultaten toonden een toename van het aantal CNV-toewijzingen voor DNA afgenomen van droog-locked swabs 8(25,8%) in vergelijking met sponzen swabs 2(6,5%). Een hoger aantal CNV-toewijzingen correleerde met lagere vertrouwensscores. De meerderheid van de deelnemers 30(97%) waren in staat om monsters te verzamelen die resulteerden in hoge genotypering call rates voor de spons-tip swab, terwijl slechts een paar individuen 4(13%) in staat waren om hoge call rate monsters te verzamelen voor beide soorten swabs. Concluderend kan worden gesteld dat swabs met een sponsje acceptabel waren voor patiënten, en DNA van goede kwaliteit leverden met voldoende opbrengst voor farmacogenetische qPCR-tests.