Mathematische karakterisering van de dynamica van de TA

De dynamica van de TA wordt gedicteerd door hoe zijn componenten ruimtelijk en in de tijd georganiseerd zijn op de promotor. Omdat het TA vele verschillende configuratietoestanden kan aannemen en de toestandsontwikkeling in wezen stochastisch is, waarbij talrijke moleculen en complexe interacties betrokken zijn, gebruiken wij de theorieën van statistiek en waarschijnlijkheid om de dynamica van het TA te onderzoeken. Voor de eenvoud nemen wij aan dat de concentraties van transcriptie-geassocieerde soorten zoals GTFs constant blijven rond het modelgen en dat de moleculaire interacties waarbij de promotor betrokken is in dynamisch evenwicht zijn. De term “dynamisch evenwicht” betekent niet dat alle moleculaire interacties omkeerbaar zijn; het betekent alleen dat het TA na enige tijd zijn huidige toestand moet terugkrijgen. Een modelgen en alle soorten eromheen vormen een systeem. De bovenstaande veronderstellingen impliceren dat een dergelijk systeem zich in een stabiele toestand bevindt. Laten we een statistisch ensemble beschouwen dat bestaat uit een groot aantal van dergelijke in wezen identieke systemen, waarbij elk systeem onafhankelijk evolueert. Het aantal systemen is groot genoeg, zodat alle mogelijke configuratietoestanden van de TA door dit ensemble kunnen worden bestreken. Dat wil zeggen dat elke toestand die een individueel gen doormaakt de toestanden van andere genen in het ensemble in kaart brengt en dat de proportie genen in een speciale toestand X (bv. genen waarvan de enhancers gebonden zijn door activatoren), P(X), constant blijft in de tijd. Als een individueel gen op een bepaald tijdstip wordt geobserveerd, is de kans dat het gen zich in de toestand X bevindt ook P(X). In die zin is de toestand waarin een individueel gen zich bevindt een toevallige gebeurtenis.

Voor het minimale model (Fig. 1a) definiëren we alle configuratietoestanden van het TA als een universele verzameling Ω en de verschillende toestanden met dezelfde sleutelkenmerken als respectievelijk de volgende sub-reeksen (Fig. 1b). A geeft aan dat de versterker gebonden is door een activator. S betekent dat de kernpromotor gebonden is door de eiwitten van de SCF. M geeft aan dat een nascent mRNA in dracht is (inclusief het proces van PIC-vorming tot Pol II’s ontsnapping in elongatie). J betekent dat de aan de enhancer gebonden activator via de Mediator naar de SCF, PIC of OPC wordt geleid. Omdat voor eukaryote transcriptionele initiatie de aanwezigheid van de SCF op de kernpromotor vereist is4,12, is M⊂S. Volgens de definities, J⊂AS. In de set MJ zijn M en A gelijktijdig, d.w.z. dat de enhancer-gebonden activatoren de werking van Pol II direct kunnen beïnvloeden via de Mediator. De transcriptionele initiatie onder directe regulatie van activatoren wordt dus beschreven door de verzameling MJ, terwijl de basale, activator-onafhankelijke transcriptionele initiatie is opgenomen in de verzameling M-J. De waarschijnlijkheid van een nascent mRNA in de dracht, d.w.z. de waarschijnlijkheid dat een mRNA wordt gegenereerd, is

waar q een constante is die de basale transcriptionele initiatie vertegenwoordigt en Aj een deelverzameling van A is (zie S1 van de aanvullende informatie voor details). In Aj zijn de enhancer-gebonden activatoren verplicht om contact te maken met de SCF-, PIC-, of OPC-gekoppelde Mediator. Vergelijking (1) karakteriseert de relatie tussen mRNA-productie en de dynamische eigenschappen van de TA.

Gecodeerd voor de concentratie van transcriptionele activatoren

Op grond van verschillende architecturen van promotorchromatine in verschillende transcriptionele stadia, kunnen de enhancer-gebonden activatoren verschillende functies vervullen, zoals het bevorderen van histonacetylering en het rekruteren van GTF’s4,5,15. Specifiek betreft de set Aj de enhancer-gebonden activatoren die verantwoordelijk zijn voor het hanteren van de basale transcriptionele machinerie en het controleren van transcriptionele initiatie. Bovendien zijn de activiteiten van deze activatoren ook geassocieerd met de codering van de nucleaire concentratie van activatoren, want is de enige factor in vergelijking (1) die afhankelijk is van de concentratie van activatoren. Hier onderzoeken wij de dynamiek van dergelijke activatoren.

Activatoren bewegen zich snel binnen de kern en de kans dat zij de versterker bereiken is evenredig met hun nucleaire abundantie9. Laten we een tijdsperiode beschouwen waarin de activatoren die betrokken zijn bij de reeks Aj zich gedurende m (m = 1, 2, 3, …) cycli aan de enhancer binden en vervolgens weer van de enhancer vertrekken. We definiëren de temporele bezettingsgraad RTOR van die activatoren als , waarbij en respectievelijk de bind- en ontbindtijd van de j-de cyclus aangeven. Voor het vaste aantal na van activatoren in de kern, hebben we

waar aon en aoff zijn de neiging functies van binding en ontbinding, respectievelijk (zie S2 van de Aanvullende Informatie voor details). aon is een functie van na, terwijl aoff is onafhankelijk van na. Vergelijking (2) geeft aan dat als m stijgt, convergeert naar een deterministische waarde, die een monotoon toenemende functie van na is (Fig. 1c-d en Fig. S1; dit is een algemene eigenschap en kan worden toegepast op gevallen waarin het aantal cognate bindingsplaatsen op de enhancer groter is dan één (zie vergelijkingen S13-S18)). Deze convergentie impliceert dat zelfs de in de tijd variërende concentratie van activatoren door RTOR kan worden gecodeerd, op voorwaarde dat de activatoren frequent genoeg over een tijdvenster met een vrijwel onveranderde concentratie op en van de enhancer fietsen. Er bestaan inderdaad actieve disassociatiemechanismen die een snelle cyclus van activatoren garanderen9,19,20,21,22. De bindingstijd werd geschat op seconden tot tientallen seconden9,10. Bovendien werd voor het endogene CUP1-gen aangetoond dat een dergelijke snelle cyclus functioneel is10. Vermoedelijk codeert de RTOR de concentratie van transcriptionele activatoren. Anderzijds, gedurende de periode waarin de activatoren m keer aan en uit de enhancer fietsen, is de kans dat de enhancer door zo’n activator gebonden wordt gevonden . Omdat het gemiddelde van over het ensemble ook f(na) is, hebben we

De beperkingsvoorwaarden die een betrouwbare transcriptionele respons garanderen

Gezien de stochasticiteit in het optreden van transcriptionele gebeurtenissen, vereist het bereiken van een betrouwbare transcriptionele respons dat de RTOR-code, die tijdig de concentratie van activatoren weergeeft, met hoge getrouwheid in de hoeveelheid transcripten wordt omgezet. Idealiter, als P(S), en allemaal gelijk zijn aan 1, zou de exacte informatie transductie worden bereikt. In het volgende presenteren we de voorwaarden waaronder deze drie factoren groot genoeg kunnen zijn om betrouwbare transcriptionele reacties te garanderen in aanwezigheid van willekeurige fluctuaties (Figs. S2 en S3 geven intuïtieve verklaringen voor deze subsectie).

Vergelijking (3) impliceert dat de concentratie van activatoren niet voldoende kan worden gecodeerd zonder de persistentie van de SCF op de promotor. De SCF zou zich dus snel moeten verzamelen wanneer de chromatine-architectuur dat toelaat en veel stabieler moeten zijn dan de enhancer-gebonden activatoren (conditie I). Een dergelijke stabiliteit van de SCF is experimenteel waargenomen en de bindingstijd van TBP (TATA-bindend eiwit, de kerncomponent van de SCF) op de promoter kan in menselijke cellen oplopen tot 20 min11. Voor is Aj een voorwaarde voor het optreden van J. Omdat RTOR wordt bepaald door de afzonderlijke korte bindingstijden van activatoren, moet J onmiddellijk na het optreden van Aj plaatsvinden (Fig. S3). Anders gaat de informatie over RTOR grotendeels verloren of wordt zelfs ten onrechte gebruikt om de transcriptionele initiatie te sturen (merk op dat J een voorwaarde is voor M). Daarom, om de RTOR code correct over te dragen, zou de Mediator moeten handelen door te wachten om de fietsende activators te binden en de informatie door allostery23,24,25 over te brengen (Conditie II). Dit komt omdat andere soorten moleculaire interacties zoals vrije botsingen de informatie over de bindingstijd van activatoren niet precies kunnen overbrengen. Dergelijk allosterisme van de Mediator wordt ondersteund door het eerdere werk26. bepaalt hoe de door J geërfde informatie over RTOR wordt omgezet in sturing van de hoeveelheid transcripten. Omdat RTOR afhankelijk is van de intermitterende binding van activatoren, vereist een grote dat tijdens de korte bindingsperioden vrij snel transcripten moeten worden geproduceerd (Fig. S2) (Conditie III). Dit kenmerk wordt ook geverifieerd door computationele schattingen van de experimentele gegevens (zie S3 van de Aanvullende Informatie). Aan alle drie voorwaarden kan dus op natuurlijke wijze worden voldaan.

Het dynamische mechanisme van activator-gereguleerde transcriptie

De bovenstaande drie constraint-condities bepalen samen hoe de TA werkt. Er ontstaat herhaaldelijk een toestand waarin een relatief stabiele klem-achtige ruimte wordt gevormd tussen de Mediator en de enhancer (Fig. 2; volgens condities I en II). Aangezien experimenteel is aangetoond dat de SCF niet erg stabiel is11 , wordt deze ruimte tijdelijk opgebouwd. De klem-achtige ruimte trekt vrije activatoren aan en pelt ze vervolgens snel af, waarbij RTOR wordt bepaald door de concentratie van de activatoren (volgens vergelijkingen (2-3)). Zodra één activatormolecuul in deze ruimte terechtkomt, ontstaat er allosterie in de Mediator, waardoor de omstandigheden voor de GTF’s en andere verwante eiwitten om hun functies uit te voeren, worden vergemakkelijkt. Dientengevolge kunnen Pol II’s de transcriptie zeer snel (volgens condities II en III) initiëren/herinitiëren, waarbij de RTOR de hoeveelheid transcripten regelt.

Illustratie van het dynamische mechanisme voor de TA die een betrouwbare transcriptionele respons orkestreert.

Er ontstaat herhaaldelijk een toestand waarin een relatief stabiele klem-achtige ruimte wordt gevormd tussen de mediatoren en de enhancer. Transcriptionele activatoren fietsen snel in en uit deze ruimte. Alleen wanneer deze ruimte door activatoren wordt bezet, initieert/reïnitieert Pol II de transcriptie met een hogere snelheid dan de cyclussnelheid van de activatoren.

Dit mechanisme suggereert dat de moleculaire interacties waarbij de promotor betrokken is, als volgt aan elegante dynamische principes gehoorzamen. De klemachtige ruimte wordt tijdelijk gevormd, maar is veel stabieler dan de activatoren die zich erin vestigen. De activatoren kunnen vele malen in en uit de ruimte fietsen, zelfs gedurende korte perioden waarin hun concentratie vrijwel onveranderd blijft; de concentratie van activatoren kan dus tijdig door RTOR worden weergegeven. Omdat de Mediator de informatie via allosterie doorgeeft en de snelheid van transcriptionele reïnitialisatie veel groter is dan de cyclische snelheid van activatoren, wordt de RTOR-code effectief gebruikt om de mRNA-synthese te sturen. In één woord, de klem-achtige ruimte is de structurele basis voor betrouwbare transcriptionele reacties. De stochastische aard van de moleculaire interacties vormt geen belemmering, maar wordt ten volle benut om op betrouwbare wijze transcriptie te induceren; dit hangt grotendeels af van de verschillende mate van stabiliteit van de componenten van de RTOR, die verscheidene orden van grootte omspannen. Bovenstaande argumenten worden ondersteund door experimentele gegevens en de typische tijdschalen zijn als volgt: de halveringstijd van de klem-achtige ruimte is ongeveer 5 min11, de bezettingstijd van activatoren in de ruimte ligt binnen het bereik van seconden tot tientallen seconden10, allosterie treedt meestal op binnen de tijd van milliseconden tot niet meer dan 1 seconde23,24,25 en het duurt slechts enkele seconden om een transcript opnieuw te initiëren (zie S3 van de aanvullende informatie).

Validatie van het mechanisme door numerieke simulaties

Om verder te verifiëren het voorgestelde dynamische mechanisme, bouwen we een vereenvoudigd stochastisch model van gen transcriptie met fysiologisch realistische parameters (zie Fig. S4 en S4 in Supplementary Information voor details). Dit model geeft de belangrijkste toestand overgangen van de TA en beschrijft ook eenvoudig de bijbehorende chromatine dynamiek, waardoor in staat van het karakteriseren van de transcriptionele respons op transcriptionele activatoren. In het volgende, de “input” en “output” duiden op de nucleaire concentratie van activatoren en de hoeveelheid genproducten, mRNA of eiwit, respectievelijk.

Eerst onderzoeken we de temporele evolutie van het aantal cellulaire mRNA’s bij constante ingangsniveaus (Fig. 3a). Met name mRNA’s worden geproduceerd in een burst-achtige manier, in overeenstemming met de heersende opvatting 14,27,28,29,30,31,32. Voor laag-niveau ingangen, een allel wordt getranscribeerd, terwijl de andere is stil in een diploïde cel en dus het uitbarsten fenomeen is duidelijk. Voor inputs van hoog niveau barsten beide allelen echter vaak, zodat de som bijna constant wordt. Dit suggereert dat het fenotype van aanhoudende verhoogde transcriptionele responsen kan worden waargenomen bij hoge inputniveaus14.

Transcriptionele responsen op activatoren op basis van het voorgestelde dynamische mechanisme.

De input is gelijk aan aon/aoff, die positief gerelateerd is aan de nucleaire concentratie van activatoren. (a) Temporele evolutie van het aantal cellulaire mRNA’s in een enkele diploïde cel met verschillende inputniveaus. mRNA’s geproduceerd door twee allelen worden afzonderlijk getoond in rood en zwart. De transcriptionele uitbarsting wordt dichter naarmate de ingangssterkte toeneemt. (b) De gemiddelde input/output verhouding in individuele diploïde cellen. De maximale uitgangen zijn genormaliseerd tot 1. Foutbalken geven de standaardafwijking van de output, SDout. De inzet toont de verhouding van SDout aan de gemiddelde output vs de input. Omdat de overvloed van mRNA’s of eiwitten ook afhangt van hun degradatie / inactivatie tarieven, die worden gemoduleerd door cellulaire signalering, de snelheid van mRNA productie directer weerspiegelt de dynamiek van de TA (zie ook Fig. S9, waar de productie snelheid van eiwitten wordt ook getoond44,45). (c) De curven van de SDout vs. de input. Deze curven blijven bijna klokvormig, zelfs bij verschillende degradatiesnelheden van mRNA’s of eiwitten (zie ook Fig. S10). (d) De verdeling van de mRNA-niveaus over een celpopulatie voor verschillende ingangsniveaus. De bin grootte is 10. (e) De toestandsontwikkeling van een promotor in reactie op een periodiek variërende input. G1 betekent dat de promotor gebonden is door een activator. SCF geeft aan dat de kernpromotor gebonden is door de SCF. OPC geeft aan dat de kernpromotor zich in de OPC-toestand bevindt. De curven beschrijven respectievelijk de input, de overeenkomstige toestanden van de promotor en de productie van mRNA’s (van boven naar beneden). (f) ChIP-simulatie van de transcriptionele respons. De input en de symbolen zijn dezelfde als in paneel (e). TATAn en Pol II geven aan dat de kernpromotor gebonden is door respectievelijk histonen en Pol II.

Een recente experimentele analyse sloot de mogelijkheid uit dat de chromatine-omgeving een centrale rol speelt bij het vormgeven van transcriptionele bursting32. Hier tonen we aan dat een uitbarsting van transcripten ontstaat uit aanhoudende reïnitiatie door Pol IIs wanneer de klem-achtige ruimte wordt bezet door de activatoren (Fig. 4). Dat wil zeggen, de initiatie van mRNA is zelf burst-achtig. De bursting is niet louter ruis; in plaats daarvan is het een directe manifestatie van de RTOR-code, die de concentratie van activatoren weergeeft en de mRNA-productie stuurt.

De essentie van transcriptionele burst.

Afgebeeld is een microscopische weergave van een transcriptionele burst. CA’ geeft aan dat een activator zich in de klemvormige ruimte bevindt. OPC’ geeft aan dat de transcriptiemachine zich in de OPC-toestand bevindt (er wordt ook een inzoompaneel getoond). Wanneer een activatormolecuul in de klemachtige ruimte aanwezig is, resulteert een snelle reïnitiatie van de transcriptie in een uitbarsting van mRNA’s.

Ten tweede onderzoeken we de gemiddelde input/output-relatie van de transcriptionele respons. De gemiddelde output lijkt op een Hill-functie van de input, die veel wordt gebruikt in de systeembiologie om genexpressie te modelleren3,33,34 (Fig. 3b). De curve van de standaardafwijking SDout van de output tegenover de input is bij benadering klokvormig (fig. 3c). De intensiteit van de intrinsieke ruis, gedefinieerd als de verhouding van SDout tot de gemiddelde output35 , is omgekeerd gecorreleerd met de input (de inzet van Fig. 3b). Bovendien zijn de bovengenoemde kenmerken ongevoelig voor de lichte fluctuaties in de input (d.w.z. extrinsieke ruis) (Fig. S5), wat de robuustheid van de transcriptionele respons op ruis suggereert. Al deze resultaten komen goed overeen met de experimentele metingen in zowel Saccharomyces cerevisiae36 als Drosophila embryo’s37. Met name de linkerkant van de SDout curve lager is dan de rechterkant, dit kenmerk is bijna kwantitatief in overeenstemming met de experimentele gegevens37 (zie S5 van de Supplementary Information voor verdere besprekingen). Daarentegen zouden afwijkingen van de hierboven voorgestelde dynamische principes (met inbegrip van de omstandigheden waaronder de cycli van de activatoren traag zijn, het scaffoldcomplex/clamp-achtige ruimte niet stabiel is, of/en de snelheid van transcriptionele reïnitiatie laag is) het vermogen van de TA verminderen om betrouwbaar te reageren op de input (Fig. S6).

De input/output-relatie die in Drosophila-embryo’s werd waargenomen, werd verondersteld te worden gerealiseerd door maximaal gebruik te maken van de limiet van moleculaire interacties37,38,39. De eigenschappen van dergelijke microscopische interacties zijn geïntegreerd om macroscopisch gemanifesteerd te worden als SDout. De SDout curve is nog steeds klokvormig in vergelijking met de SDin curve (cf. Fig. 1d). Dat wil zeggen, de handtekening van de RTOR code kan direct worden doorgegeven aan de uitgang. Dit bevestigt dat de temporele bezettingsgraad van activatoren werkelijk wordt benut om transcriptie te reguleren en dat de Mediator de informatie door allostie doorgeeft. Anderzijds is de SDout-curve asymmetrisch, waarbij de rechterkant hoger is dan de linkerkant. De reden ligt voor de hand. Wanneer de input erg hoog is, is de enhancer bijna de hele tijd gebonden door de activatoren en dus weerspiegelen de fluctuaties voornamelijk de dynamische eigenschappen van de SCF en de transcriptionele reïnitiatie door Pol IIs. Onze verdere simulaties tonen aan dat de rechterkant van de SDout curve daalt naarmate de stabiliteit van de SCF of de snelheid van transcriptionele reïnitiatie toeneemt; alleen bij het verhogen van hun sterkte voorbij de fysiologische bereiken kan de curve symmetrisch worden (Fig. S6F). Dit verifieert ook dat zowel P(S) als inderdaad groot genoeg zijn. Daarom zouden de eigenschappen van SDout onomstotelijk het microscopische transcriptionele mechanisme moeten bewijzen.

Ten derde sonderen we de verdeling van de mRNA-niveaus over een grote celpopulatie die aan dezelfde input wordt blootgesteld (Fig. 3d). Voor kleine ingangen, het uitbarsten fenomeen is vooral duidelijk en de meeste cellen hebben geen of weinig mRNAs. Dit is in overeenstemming met de experimentele waarneming 27,30,31. Maar de verdeling wordt geleidelijk normaal als de input toeneemt. Voor aon/aoff >1 wordt de verdeling scherper naarmate de input toeneemt. Deze resultaten wachten op experimentele identificatie.

Vierde, we simuleren de transcriptionele respons op een periodiek variërende input. Het microscopische proces op een promotor is nogal dynamisch en stochastisch, waarbij verschillende componenten van de TA verschillende stabiliteiten vertonen (Fig. 3e). De hoeveelheid mRNA’s kan echter de input volgen. Deze resultaten komen goed overeen met de resultaten van FRAP, d.w.z. dat het TA een zeer dynamisch apparaat is8,10,11,22. Anderzijds onthullen chromatine immunoprecipitatie assays (ChIP) simulaties, die de temporele evolutie van de verdeling van verschillende toestanden van de promotor onder een celpopulatie karakteriseren, een sterke regelmatigheid in de verdelingen (Fig. 3f). De patronen van zowel de activatoren die aan de enhancer binden als de SCF en Pol II die aan de promotor binden, volgen de input. mRNA-transcripten worden in fase met de input geproduceerd, terwijl histonen de promotor in omgekeerde fase bezetten. Al deze resultaten komen goed overeen met de experimentele bevindingen22,40. Daarom kunnen de waargenomen discrepanties tussen de resultaten van FRAP en ChIP experimenten hun oorsprong vinden in verschillende resoluties die betrokken zijn bij de metingen. ChIP metingen integreren moleculaire interacties zowel in de tijd als over de celpopulatie, terwijl FRAP meer de momentane interacties weergeeft. Bovendien is de transcriptionele respons op de tijdsvariërende input robuust voor extrinsieke ruis, maar gevoelig voor samengestelde ingangssignalen en afwijkingen van de dynamische principes (zoals de gevallen met een lage cyclussnelheid van activatoren, de onstabiele scaffold complex / clamp-achtige ruimte, of / en een lage snelheid van transcriptionele reïnitialisatie) zou het reactievermogen verminderen (zie Figs. S7 en S8).