Cell Culture Reagents

Een glycerol voorraad van Human Akt1 ORF werd verkregen als pENTR221 vector van GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). Gemodificeerde bestemming vector (pcDNA/FRT/TO), met SH Tag, was een gulle gift van Dr Matthias Gstaiger (Instituut voor Moleculaire Systeembiologie, ETH Zürich, Zürich, Zwitserland). Flp-In TREx HEK293 cellen (#R780-07), LR Clonase II enzym mix (#11791-100), pOG44 vector (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycine B (#10687-010), Tet (#550205) en Dynabeads Protein A (#100.02D) werden verkregen van Invitrogen. Xtremegene 9 (#06365787001) werd verkregen bij Roche. DMEM (#12430-054) en RPMI 1640 (#22400-089) werden verkregen van GIBCO. Trypsine (#CC5027.010L) werd aangekocht bij Genetics. Normale FBS (#SH30070.03) en Tet gescreende FBS (#SH30070.03T) werden verkregen van Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazole (#M1404-10MG), Propidium Iodide (#P4170-250 mg) en Lys C protease (#P3428) werden verkregen van Sigma. SILAC-labels werden verkregen van Cambridge Isotope Laboratories, Inc. Proteaseremmerscocktail (100X) (#78429) en Pierce anti-HA agarosekorrels (#26182) werden verkregen van Thermo Scientific. MagStrep ‘Type 2HC’-korrels (#2-1612-002) werden verkregen van IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, India synthetiseerde het HA-peptide. Nitrocellulosemembraan (#RPN303E) werd gekocht bij GE Healthcare. Trypsineprotease (#4370282) werd aangekocht bij AB Sciex. Volledige reeks regenboog eiwit molecuulgewicht marker (#RPN800E) was van Amersham. siRNAs, Dharmafect Transfection Reagent (# T-2001-03), RNase vrij water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) werden verkregen van Dharmacon. RNase A (#19101) was afkomstig van Qiagen.

Antilichamen voor Western Blot

Antilichamen gebruikt in de huidige studie waren: anti-HA (#SC-7392; muis monoklonaal, verdunning 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; muis monoklonaal, verdunning 1:1000) en anti-GAPDH (#SC-25778; polyklonaal konijn, verdunning 1:1000) van Santa Cruz; anti-CDC2 (# 77055; polyklonaal konijn, verdunning 1:1000); anti-CCNB1 (# 4138; polyklonaal konijn, verdunning 1:1000) van Cell Signalling Technology; anti-CCNB1 (#SC-5298; polyklonaal konijn, verdunning 1:1000) van Santa Cruz:1000) van Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; konijnmonoklonaal, verdunning 1:10000); anti-API5 (#ab56392; muismonoklonaal, verdunning 1:1000) en anti-SH3PX1 (#EPR14399; konijnmonoklonaal, verdunning 1:2000) van Abcam; secundaire anti-CCDC2 (#77055; konijn-polyklonaal, verdunning 1:1000) van Abcam:2000) van Abcam; secundaire antilichamen werden verkregen van Licor Biosciences-Odyssey geit-antimuis (#926-32210, verdunning 1:15000) en Odyssey geit-antibit (#926-32211, verdunning 1:15000).

Generatie van stabiele cellijn

In deze studie, gateway compatibele Akt1 ingang vector (pENTR221) werd gebruikt voor het genereren van een expressie construct door LR recombinatie reactie in aanwezigheid van een geschikte bestemming vector (pcDNA/FRT/TO). De doelvector werd gewijzigd om een Strep-HA (SH) tag te bevatten die een streptavidine-bindend peptide (Strep) en een hemagglutinine (HA) epitoop tag bevat. Deze SH tag werd uiteindelijk gebruikt om selectief Akt1 en zijn interagerende partners uit complexe cellysaten te trekken. Voor het genereren van een induceerbare Akt1 expressie cellijn, werd de expressie construct co-transfecteerde met pOG44 recombinase in Flp-In TREx HEK293 cellen, stabiel tot expressie brengen van de Tet repressor. Transfectie werd vergemakkelijkt door Xtremegene 9 transfectiereagens. Cellen die Akt1 construct tot expressie brengen werden geselecteerd over een periode van 15-20 dagen in hygromycine-B (75 µg/ml) bevattend RPMI medium, aangevuld met 10% Tet gescreend FBS. Deze geselecteerde cellen werden later gepoold om uit te breiden voor pulldown experimenten.

Tet concentratie die nodig is voor een optimale Akt1 expressie werd bepaald door het induceren van Akt1 expressie over een bereik van Tet concentraties (0,1 µg / ml tot 5 µg / ml) en eiwitexpressie niveaus van Akt1 werden gecontroleerd in aanwezigheid en afwezigheid van Tet met behulp van anti-Akt1 en anti-HA antilichaam. Tet werd elke 24 uur aan de kweekmedia toegevoegd om een gestage Akt expressie te behouden.

PDT Experiment

PDT voor HEK293 cellen werd gecontroleerd in normale versus Akt1-overexpresserende cellen over een duur van 72 uur na de eerste toediening van Tet. Voor elk observatiepunt werd een parallelle reeks van 104 normale en Akt1-overexpresserende HEK293 cellen in drievoud gezaaid, in een 96 wells plaat in 100 µl DMEM media die 10% serum bevat. Tet werd toegevoegd aan de kweekmedia 24 uur na het zaaien en na nog een incubatie-interval van 24 uur, werden de cellen geoogst als tijdstip 0. Hierna werd een set cellen, in parallelle kweek, elke 24 uur geoogst tot 72 uur. De PDT werd bepaald door de cellen op elk tijdstip te tellen met behulp van trypanblauwkleuring.

SILAC labeling te differentiëren celcyclus fase specifieke Akt1 interactome

Akt1-overexpressie van HEK293 cellen werden uitgebreid en gekweekt in SILAC media die “light” (K0R0), “medium” (K6R6) of “zware” (K8R10) isotopen van lysine (K) en arginine (R) voor ten minste 5 cel verdubbelingen om volledige label incorporatie mogelijk te maken. Bij 70% confluentie werd Tet (1 µg/ml) aan de media toegevoegd om Akt1-expressie te induceren. K0R0 gelabelde cellen werden gearresteerd in G0 fase door ’s nachts serum verhongering, dat is een veel gebruikte methode om cellen te arresteren in G0 fase 42. Om dit te doen, werd de normale volledige kweekmedia vervangen door serum beroofd RPMI en cellen werden in cultuur gehouden gedurende 16-18 uur bij 37 ° C in 5% CO2 atmosfeer. K8R10 gelabelde cellen werden gearresteerd in G1 / S fase door het kweken van cellen ’s nachts in aanwezigheid van 5 µg / ml van afidicoline, een omkeerbare remmer van eukaryote nucleaire DNA-replicatie 43. Evenzo werd voor G2-restatie 400ng/ml nocodazol toegevoegd aan de kweekmedia van met K6R6 gelabelde cellen en werd de incubatie 16-18 uur voortgezet alvorens de cellen te pelleteren. Nocodazole interfereert met de polymerisatie van microtubuli, waardoor de cellen in de G2/M-fase worden gestabiliseerd44. De gearresteerde cellen werden getrypsiniseerd en afzonderlijk geteld door trypan blauw kleuring. Cellen die in verschillende fasen van de celcyclus waren gearresteerd, werden vervolgens gepelletiseerd door centrifugatie bij 1500 rpm gedurende 10 minuten. Voor elke fase van de celcyclus werden meerdere celpellets gemaakt en bij -80 °C bewaard tot gebruik.

SH-tagged Affinity Purification

Eenzelfde aantal Akt1-overexpresserende cellen gearresteerd in G0, G1/S en G2 fasen werden gemengd in 1:1:1 verhouding en gedurende 1 uur op ijs gelyseerd in IP buffer (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7.5; 1% NP-40; 1X protease inhibitor cocktail en 1 mM PMSF). Het cellysaat werd vrijgemaakt van debris na centrifugale scheiding bij 10.000 rpm gedurende 15 minuten bij 4 °C. Akt1 eiwitcomplexen werden selectief gezuiverd in parallelle sets door het richten van Strep en HA-tag tegelijk, zoals geïnstrueerd in de handleidingen van de respectieve kits. Kort gezegd werden strep-gemerkte Akt1-eiwitcomplexen gemengd met 100 µl streptactine-magneetkorrels en gedurende 1 uur geïncubeerd op een rondschudapparaat bij 4 °C. Eventuele niet-specifieke interactoren werden tijdens vijf opeenvolgende wasstappen weggespoeld met vijf volumes streptactine-wasbuffer. Akt1 eiwit en de interactoren werden uiteindelijk geëlueerd in twee elutie stappen met 125 µl strep elutiebuffer per elutie (invitrogen). Voor de zuivering van HA-getagd Akt1 eiwit complexen, werden gewiste cel lysaten geïncubeerd met 50 µl van vooraf gewassen HA agarose kralen gedurende 2 uur bij 4 ° C op een roterende schudder. Na 3 snelle wasbeurten, met tien kraalvolumes TBS-T buffer, werden Akt1 eiwitcomplexen driemaal geëlueerd met 50 µl HA peptide (250 µg/ml). De bovenstaande zuivering stappen werden uitgevoerd voor drie van dergelijke biologische replicaten te zuiveren Akt1 eiwit en zijn interagerende partners en de Strep en HA eluaten voor elk replicaat werden gepoold, gelyofiliseerd en opgeslagen bij -80 ° C tot verdere verwerking.

Proteïne Digestion en monstervoorbereiding voor LC-MS/MS

Alle drie biologische replicaten werden afzonderlijk verwerkt voor eiwit digestie. Aan het gelyofiliseerde monster werd 40 µl 100 mM ammoniumbicarbonaat toegevoegd, goed vortexen, gevolgd door toevoeging van 2 µl denaturerende buffer (AB Sciex). De monsters werden gereduceerd met 4 µl reducerend reagens (AB Sciex) gedurende 1 uur bij 60 °C. 2 µl cysteïneblokkeringsreagens werd gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur toegevoegd om de gereduceerde cysteïneresten te blokkeren. De proteïnedigestie werd gestart door 5 µl 0,1 µg/µl endo-proteïnase Lys C toe te voegen. De monsters werden gedurende 4 uur geïncubeerd in een waterbad van 37 °C. Na een korte centrifuge werd 1 µl trypsine (1 µg/µl) aan de monsters toegevoegd en werd de incubatie nog eens 12-16 uur bij 37 °C voortgezet. De proteïnedigestie werd beëindigd door toevoeging van een druppel mierenzuur (FA).

Gezuurde monsters werden gevriesdroogd en onderworpen aan peptidezuivering met behulp van monospin C-18 kolommen. Vóór gebruik werden de C-18 kolommen geconditioneerd met methanol en water en verder geëquilibreerd met 3% ACN in 0,1% FA. De gelyofiliseerde monsters werden opgelost in 3% ACN in 0,1% FA en op de C-18 kolommen geladen, waarna men ze 10 minuten liet binden. De monsters werden tweemaal door de kolommen gevoerd om een volledige binding te verzekeren. Na 10 strikte wasbeurten met 3% ACN in 0,1% FA werden de verteerde peptiden eerst geëlueerd in 40% ACN, gevolgd door twee eluties in 60% ACN. Tenslotte werden de drie eluaten gepoold en gevriesdroogd, voor elk replicaat.

De geëlueerde peptiden werden opnieuw opgelost in 500 µl van 5 mM ammoniumformiaat (pH 2,5) in 30% ACN en zachtjes geveerd. De kationenuitwisselingspatroon werd gefixeerd en geconditioneerd voordat het monster werd geladen. Na het laden van het monster werd de cartridge driemaal gewassen met 5 mM ammoniumformiaat (1 ml). De peptiden werden tweemaal gereelueerd met 400 µl 500 mM ammoniumformiaat (pH 2,5) in 30% ACN per elutie en de eluaten werden samengevoegd voor elk monsterreplicaat en gevriesdroogd.

Massaspectrometrie Experimenteel ontwerp en statistische rationale

LC-MS/MS analyse

Alle monsters werden geanalyseerd door nano-flow vloeistofchromatografie op een nanoflex systeem (Eksigent Technologies, AB Sciex) gekoppeld aan een triple TOF 5600 Mass Spectrometer (AB Sciex; Concord, Canada). Elk biologisch replicaat werd tweemaal als technische replicaten geïnjecteerd. Het systeem werd bediend met een binaire fase gradiënt, met oplosmiddel A (2% ACN in 0,1% FA) en oplosmiddel B (98% ACN in 0,1% FA). Voor een optimale reproduceerbaarheid van de monsterafgifte werd de automatische monstername gebruikt in de volledige injectiemodus, waarbij de lus van 1 µl werd overvuld met 3 µl monster. Voor de metingen van elke monsterinjectie werden peptiden gevangen op een cHiPLC-val, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) en gescheiden op een cHiPLC-kolom, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) bij een debiet van 300 nl/minuut, met gebruikmaking van een lineaire gradiënt: 5-60% oplosmiddel B in 80 minuten, 60-90% gedurende 2 minuten. De kolom werd geregenereerd door wassen met 90% oplosmiddel B gedurende 6 minuten en opnieuw geëquilibreerd met 5% oplosmiddel B gedurende 22 minuten.

De massaspectrometer was gekoppeld aan een Nano Spray Ion Source (AB Sciex), gecontroleerd door Analyst software (v.1.6). De ionenbron was uitgerust met een 10 μm SilicaTip electrospray PicoTip emitter (AB Sciex) en de geëlueerde peptiden werden gemonitord met de volgende ionenbron parameters-IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gordijngas = 25. De massaspectrometer werd bediend in informatie-afhankelijke acquisitie (IDA) top10-modus en hoge gevoeligheid modus met 500 en 200 ms accumulatie tijd voor de MS1 en MS2 scans respectievelijk, en 12 s dynamische uitsluiting, wat resulteert in een totale duty cycle van ~ 2,55 s. Massaspectrometer analyse werd uitgevoerd met behulp van TOF-MS1 en MS2 survey scans variërend van 350-1250 en 140-1600 m / z, respectievelijk. De rollende botsingsenergie werd automatisch gecontroleerd door het IDA rollende botsingsenergie parameterscript. Selectiecriteria voor de te fragmenteren moederionen waren onder meer intensiteit, waarbij de ionen groter dan 150 cps moesten zijn, massatolerantie van 50 mDa, met een ladingstoestand van +2 tot +5. Een auto kalibratie van spectra werd gedaan na acquisitie van elke 2 monsters met behulp van dynamische LC-MS en MS / MS acquisities van 25fmol β-galactosidase.

Data Processing and Analysis

MS-MS acquisitie van Akt1 en zijn interagerende eiwitpartners werd gemedieerd in 3 verschillende celcyclus fasen dat wil zeggen G0, G1 / S en G2 fase. SILAC gelabelde cellen die elke fase vertegenwoordigen werden samengevoegd in drie afzonderlijke sets en onderzocht als biologische replicaten. Verwerving van elke biologische replicaat resulteerde in 2 wiff en 2 wiff.scan bestanden, die de technische replicaten. Wiff-bestanden werden opnieuw gepoold voor elke biologische replicaat voor het zoeken tegen UniProtKB/SwissProt Human database (release april 2015) met behulp van eiwit pilot software, versie 4.5 (revisie nr.1656). De referentiedatabase bestond uit 20.204 eiwitingangen in de gespecificeerde release. Protein pilot search was gebaseerd op het paragon algoritme, een onderdeel van de standaard statistieken van de software. De volgende instellingen werden gebruikt voor paragon zoekopdrachten-(a) Soort als Homo sapiens, (b) Lys C en Trypsin als enzym categorieën voor verschillende runs, (c) Maximale gemiste splitsingen = 2, (d) Vaste modificaties als SILAC labels-K6R6 en K8R10; cysteïnealkylering door methylmethanethiosulfonaat (MMTS), (e) Variabele modificaties als oxidatie op methionine, wat een standaardoptie is in eiwitpilot, (f) Identificatie, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) en SILAC (Lys + 8, Arg + 10) als monstertypes, en (g) “Zoekinspanning” parameter “Grondige ID”, wat ons een brede zoektocht geeft naar verschillende eiwitmodificaties, (h) Massatolerantie voor precursor- en fragmentionen waren 0.05 en 0.1 Da, respectievelijk. Voor elke biologische replicaat per SILAC-label Lys C en Trypsine verteerde bestanden werden gegenereerd. Volgende parameters werden gebruikt om de gegevens te filteren om een betrouwbare dataset voor verdere analyse te verkrijgen – (a) Automatische bias correctie algoritme voor zware tot lichte verhouding werd toegepast. Het corrigeert voor ongelijke menging tijdens de combinatie van de verschillende gelabelde monsters in één experiment en verwijdert elke experimentele of systematische bias. De auto bias factor verhoogt de nauwkeurigheid van de kwantificering door het normaliseren van variaties in de initiële eiwit hoeveelheden45, (b) Eiwitten op 1% Global false discovery rate (FDR) van fit (G-FDR-fit) werden behouden. De FDR-analyse werd uitgevoerd met behulp van Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) die is geïnstalleerd met eiwit pilot software; (c) Minimum eiwit vertrouwensdrempel cutoff werd ingesteld op 95%; (d) Identificatie van ten minste een unieke peptide met 95% vertrouwen over alle drie replicates.

Lijsten van eiwitten verkregen na Lys C en trypsine digestie werden gepoold per biologische replicaat. Kwantificeringsverhoudingen tussen medium en zware SILAC gelabelde eiwitten ten opzichte van hun lichtere tegenhangers werden gemiddeld. Vervolgens kregen we drie eiwitlijsten per SILAC-label-K0R0, K6R6 en K8R10. Dit werd gevolgd door de voorbereiding van een unie lijst van de geïdentificeerde eiwitten; kwantitatieve schatting werd handmatig samengesteld door het samenvoegen van bestanden van drie biologische replicaten voor elke SILAC voorwaarde. Eiwitten die werden geïdentificeerd in alle drie repliceren sets werden behouden voor verdere analyse en kwantitatieve verhoudingen tussen medium en zware labels ten opzichte van lichte labels voor deze eiwitten werden gemiddeld. Een definitieve gecombineerde bestand werd vervolgens bereid voor K0R0 (G0 fase), K6R6 (G2 fase) en K8R10 (G1 / S fase). Een eiwit gekwalificeerd om te worden in de uiteindelijke Akt1 interactoren lijst alleen als het werd geïdentificeerd in alle 3 repliceren sets voor een van de celcyclus fase. Eiwitten die werden geïdentificeerd, maar niet gekwantificeerd in alle drie replicaten kregen een kwantificeringswaarde van 0,01 (minimum) of 100 (maximum) na het binnendringen in de peptide SILAC ratio’s.

Om de lijst van Akt1 interactoren verder van alle niet-specifieke interacties met affiniteitsmatrix of tag per se, SH getagd GFP werd overgeëxpresseerd in HEK293 cellen. Interagerende partners van GFP eiwit werden selectief geëlueerd zoals beschreven voor Akt1 eiwitcomplexen. Eiwitten die overlapten met Akt1 celcyclus fase specifieke interactome werden verwijderd uit de Akt1 interactors lijst als niet-specifieke eiwitten. Dit gaf ons uiteindelijk een betrouwbare dataset voor interagerende partners voor Akt1. Een samenvatting van de informatie over de Akt1 interagerende eiwitten en hun kwantitatieve schattingen wordt gegeven in de supplementaire tabel 3. Door ze te delen met die van Akt1 ratio in de respectieve fase genormaliseerde kwantitatieve verhoudingen voor alle Akt1 interactoren. Dit gaf uniformiteit aan Akt1 als 1 in de G0, G1/S en G2 fasen.

Polyacrylamide Gel Elektroforese en Western blotting

Van de lijst van geïdentificeerde Akt1 interactoren, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 en SH3PX1 werden willekeurig geselecteerd om hun associatie met Akt1 door western blotting te valideren. Gesynchroniseerde Akt1 expressiecel pellet werd gelyseerd in IP buffer en onderworpen aan affiniteitzuivering gericht op SH tag zoals eerder beschreven. Eluaten werden gepoold en verdund in 1X SDS sample buffer en verwarmd gedurende 10 minuten en opgelost op 10% SDS-PAGE. Eiwitbanden werden overgebracht op nitrocellulosemembraan en dit laatste werd geblokkeerd met 1:1 odyssey blocking buffer: PBS gedurende een uur bij kamertemperatuur. Vervolgens werd het membraan doorgesneden zodat eiwitten van verschillende grootte konden worden gesondeerd met respectieve primaire antilichamen om samen met anti-HA-antilichaam te valideren. De primaire antilichaam verdunning werd gemaakt in odyssey buffer: PBST en ’s nachts geïncubeerd bij 4 °C op een schudapparaat. Na grondig wassen werden de blots blootgesteld aan respectieve IR gelabelde anti-muis of anti-rabbit secundaire antilichamen in een verdunning van 1:15000; verdund in odyssey buffer: PBST. De banden werden gedetecteerd met behulp van odyssey infrarood scanner.

Reverse co-immunoprecipitatie werd ook gedaan met behulp van Dynabeads eiwit A. De eerder gedetecteerde Akt1 interactoren werden gebruikt als lokaas eiwitten en Akt1 werd gesondeerd als hun interagerende partner met behulp van anti-Akt1 antilichaam. Antilichamen tegen de geselecteerde Akt1 interactoren werden gemengd met 50 µl dynabeads in aparte buisjes in een concentratie van 1:20-1:70; verdund in 200 µl PBST. De korrel-antilichaammengsels werden gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur geïncubeerd. De korrel-antilichaamcomplexen werden gepelleteerd met een magnetische separator en geresuspendeerd in 200 µl PBST om te spoelen. Daarna werd aan elk buisje 250 µl lysaat toegevoegd en gedurende 2 uur bij 4 °C geïncubeerd op een rondschudapparaat. De korrels samen met de respectieve antilichaam-antigeencomplexen werden opnieuw gepelleteerd en driemaal gewassen met 200 µl PBST, per wasbeurt. Daarna werden de korrels 10 minuten gekookt in 50 µl 1X SDS-monsterbuffer en vervolgens afgekoeld. Het supernatant werd op 10% SDS-PAGE geladen en met behulp van western blotting gescreend. Anti-Akt1 antilichaam werd gebruikt om te sonderen voor Akt1 in elutie van API5, CCNB1, CDK1, BUB3 en SH3PX1.

GO Classificatie

GO klassen uitbeeldende functie van elke Akt1 interactor werden bepaald van UniProt (http://www.uniprot.org/) en EnrichR databases (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Na uitgebreide handmatige curatie, werden de geïdentificeerde Akt1 interactoren onderverdeeld in 3 grote functionele klassen, namelijk proliferatie en overleving, metabolisme en eiwitsynthese. De rest werden afgebeeld als een gemeenschappelijke klasse genaamd ‘anderen’ die eiwitten opgenomen met functies zoals transport, hematopoëse, etc.

Gene Knockdown met behulp van siRNA

Standardization

Om de optimale concentratie van siRNA voor transfectie te bepalen, werden 1,2 × 105 HEK293 cellen gezaaid in een 12-well plaat. siRNA tegen PLK1 werd gebruikt als een positieve controle in alle knockdown assays. Een reeks van siRNA concentraties van 10 nM tot 50 nM werd getransfecteerd met behulp van dharmafect transfectiereagens, volgens protocol van de leverancier. Veranderingen in eiwitexpressie niveaus werden gecontroleerd door western blotting op 24 uur, 48 uur en 72 uur, respectievelijk (Supplementary Figuur 2). Enkele andere doelwitten (SH3PX1, AKT1, CCNB1 en SLC25A5) werden neergehaald en het effect van het neerhalen werd bepaald door Western blotting. GAPDH werd gebruikt als controle voor het laden.

Knockdown van de doeleiwitten

Eiwitten die een verstoorde associatie met Akt1 vertoonden terwijl de cel van G0 naar G1/S fase van de celcyclus vorderde, werden individueel in HEK293 cellen neergeklopt en onderzocht met FACS. Elke siRNA werd geresuspendeerd in 1x siRNA buffer om een stockconcentratie van 20 µM te bekomen. Transfectie werd gemedieerd in drievoud 24 uur na het zaaien van de cellen, samen met de nodige positieve en negatieve controles. Elke siRNA werd verdund tot een werkconcentratie van 25 nM in RPMI tot een eindvolume van 50 µl en bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten incubatie gehouden. Evenzo werd transfectiereagens ook verdund in RPMI tot een volume van 50 µl en bewaard voor incubatie in vergelijkbare omstandigheden. Zowel siRNA als transfectiereagens werden voorzichtig gemengd om complexen te vormen en verdere incubatie gedurende nog eens 20 minuten bij kamertemperatuur. Het uiteindelijke volume werd op 500 µl gebracht met media die 10% serum bevatten. Deze complexen werden vervolgens voorzichtig toegevoegd aan de cellen en verder geïncubeerd bij 37 °C. De celkweekmedia werden na 24 uur vervangen door verse 10% media. Ten slotte werd 48 uur na de transfectie de transfectie-efficiëntie bepaald door siGLO te controleren onder Nikon Ti omgekeerde microscoop.

FACS acquisitie en analyse

Op 48 uur na de transfectie werden de cellen kort gecentrifugeerd en de media werd opgezogen. De cellen werden gekleurd met 300 µl propidiumjodide-oplossing met 0,1 mg/ml propidiumjodide (Sigma), 3 µl/ml Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml natriumcitraat (Sigma) en 20 µg/ml RNase (Sigma) gedurende 30 minuten bij 4 °C. De gekleurde cellen werden onmiddellijk overgebracht naar BD FACS buisjes en verworven in BD FACS Canto.

De verkregen gegevens werden geanalyseerd met behulp van FlowJo software. DNA histogrammen werden geanalyseerd om sub G0, G0 / G1, S en G2 / M populaties te kwantificeren. Kleine verschuivingen werden waargenomen in de G0 / G1 en G2 / M populaties en dus handmatige gating werd gedaan om deze populaties te analyseren.

PDT en RT Berekening

PDT en RT op G1, S en G2 fasen van de celcyclus werden berekend na siRNA knockdown van de set van eiwitten vertonen verstoord associatie met Akt1 in G1 / S fase. PDT voor de 23 genen, samen met controles, werd gecontroleerd in HEK293 cellen gedurende 72 uur. Kort gezegd werden 10.000 cellen gezaaid in een 96-well plaat, in 100 µl RPMI media met 10% serum. siRNA transfectie werd gemedieerd de volgende dag in drievoud voor elk doeleiwit en werd beschouwd als 0 uur tijdpunt. De celtellingen werden bepaald voor onbehandelde HEK293 cellen door trypan blauw kleuring methode. Na 24 uur werden de celkweekmedia met siRNA-complexen vervangen door verse RPMI met 10% serum. Daarna werden de cellen geteld voor elk van de met siRNA getransfecteerde cellen om het tijdstip van 24 uur weer te geven. Vervolgens werd een reeks cellen, in parallelle cultuur, geoogst en geteld op de tijdstippen 48 uur en 72 uur respectievelijk.

Toen PDT was bepaald voor alle gerichte set van verstoorde genen, RT (in uren) voor elk werden berekend voor G1, S en G2 fase als volgt:

where; % van de celpopulatie werd bepaald door FACS-acquisitie.

Beschikbaarheid van gegevens

De massaspectrometrie gegevens werden gedeponeerd als een dataset “Het definiëren van de Akt1 interactome en het afbakenen van veranderingen in de samenstelling als functie van celcyclus progressie.” naar ProteomeXchange via de PRIDE database. Het is voor het publiek beschikbaar via ProteomeXchange met identificatiecode ProteomeXchange: PXD005557. De dataset bestaat uit 12 ruwe bestanden (wiff en wiff.scan) en bijbehorende 18 eiwit pilot bestanden.