6.2.3 Cowpea Mozaïek Virus

Cowpea Mozaïek Virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) is het meest uitvoerig bestudeerde platform voor diverse conjugaties en biotechnologische toepassingen. Het is een 30 nm groot icosahedraal virus en bestaat uit een bipartiet positief-sense, enkelstrengs RNA-genoom met elk RNA-molecuul ingekapseld in een afzonderlijk deeltje. Het CPMV-capsidum bestaat uit 60 kopieën van elk twee verschillende CP-subeenheden (klein, 24 kDa, en groot, 42 kDa) met pseudo T = 3 icosahedrale symmetrie. Door de aanwezigheid van de zeer symmetrische en heteromere aard van het capsid biedt CPMV een opmerkelijke mogelijkheid om differentieel (op vijf- of drievoudige of beide posities) meerdere soorten functionaliteiten te introduceren door specifieke genetische en chemische engineering met controle over zowel de ruimtelijke distributie als de mate van multivalency (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). CPMV kan in grote hoeveelheden worden gezuiverd uit geïnfecteerde bladeren en is stabiel bij een breed temperatuurbereik (tot 60°C) en in het pH-bereik van 3,0-9,0 en is bestand tegen sommige organische oplosmiddelen (Steinmetz et al., 2009). CPMV-capsiden worden gebruikt voor de gecontroleerde immobilisatie van actieve enzymen. Door CPMV-capsiden te gebruiken voor getemperde fabricage van metalen nanodeeltjes door middel van elektoloze afzetting (ELD) en mineralisatie door middel van verschillende processen, konden dunne lagen metalen en legeringen met een uniforme dikte en samenstelling worden geproduceerd. CPMV virionen worden gebruikt als nanobouwstenen voor de gecontroleerde bouw van 2-D en 3-D structuren met behulp van een bottom-up, layer-by-layer (LbL) benadering voor potentiële toepassingen als nano-elektronische apparaten of elektrochemische meervoudige biosensoren (herzien in Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan en Han, 2017a).

Natieve CPMV en CPMV-deeltjes die zijn afgeleid met lanthanide metaalcomplexen bleken veilig en niet-toxisch te zijn, gebaseerd op de biodistributie, toxiciteit en pathologiestudies van deze deeltjes in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). CPMV werd in verband gebracht met ontstekingsgebieden en geïnduceerde verstoring van de bloed-hersenbarrière tijdens infectie van het centrale zenuwstelsel (CZS) bij muizen (Shriver et al., 2009). CPMV met PEGylering aan het oppervlak vertoonde een lage immunogeniciteit, en internalisatie werd verhinderd in verschillende celtypes door vermindering van niet-specifieke binding (Raja et al., 2003). Manchester en collega’s ontdekten dat fluorescent gelabeld CPMV een endogene capaciteit heeft om te worden opgenomen door vasculaire endotheelcellen en kan worden gebruikt als een intravitale beeldvormende sonde om de vasculatuur en de bloedstroom te visualiseren tot een diepte van 500 μm gedurende 72 uur in levende muis- en kuikenembryo’s (Lewis et al., 2006). CPMV bleek een natuurlijk vermogen te hebben om zich te binden aan het oppervlak van vimentine, een cytoskeletaal eiwit dat de architectuur en dynamiek van cellen moduleert, en bleek tot overexpressie te komen in endotheel-, kanker- en ontstekingscellen (Koudelka et al., 2009). De biocompatibele, natuurlijke interactie met vimentine en endotheelbevestigingskenmerken van CPMV zijn verder geëxploiteerd om tumorangiogenese en tumorhoming in vivo in beeld te brengen (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

Het buitenoppervlak van het CPMV-capside is uitgebreid gemodificeerd met behulp van natuurlijk voorkomende of genetisch gemanipuleerde blootgestelde lysine-, cysteïne-, tyrosine-, en asparagine- en glutaminezuurresiduen door gebruik te maken van standaard chemische conjugatiemethoden en conjugerende cross-linkers om verschillende reagentia te bevestigen, zoals Au-nanopartikels, redox-reactieve methylvioleengroepen, organometaal ferroceen-carboxylaatgroepen, fluoroforen, biotine, PEG-ketens, stilbeenderivaten, koolhydraten, heterologe eiwitten (bv.g., menselijke holo-transferrine, T4 lysozym, het LRR-domian van internaline B en het Intron 8-genproduct van de HER2 tyrosinekinaserereceptor), antilichamen, oligonucleotiden, halfgeleider-quantumstippen en fullerenen. Integratie van onnatuurlijke aminozuren in CPMV-capsid werd uitgevoerd door middel van meerdere orthogonale chemiemethoden (zoals chemoselectieve hydrazon-ligatiestrategie en koper-gekatalyseerde azide-alkyne cycloadditie (CuAAC) of “klik”-reactie). Deze inspanningen hebben het gebruik van CPMV-deeltjes als optische sondes, kandidaat-vaccins en geheugen- en sensornanodevices vergemakkelijkt (besproken in Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso en Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff en Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan en Han, 2017a). CPMV en TMV werden geladen om contrastmiddelen te dragen voor dual-modaliteit magnetische resonantie (MR) en optische beeldvorming, en beide modaliteiten toonden in vitro specificiteit van fibrinebinding aan met de aanwezigheid van targeting peptiden. Preklinische studies in een halsslagader fotochemisch letsel model van trombose bevestigde trombus homing van de nanoprobes, met de langwerpige TMV staven vertonen een aanzienlijk grotere gehechtheid aan trombi dan icosahedral CPMV (Wen et al., 2015b,c). CPMV versierd met E7p72-peptiden (hoog-affiniteit epidermale groeifactor-achtig domein 7 (EGFL7) bindend peptide dat specifiek gericht is op menselijke endotheelcellen) gericht op tumor-geassocieerde neovasculatuur met hoge specificiteit zoals beoordeeld door intravitale beeldvorming (Cho et al., 2017).

In vitro en in vivo assemblageprotocollen voor CPMV-capsidubunits zijn nog niet goed vastgesteld. Dit heeft zijn potentieel voor gebruik als nanocontainer voor inkapseling van ladingmoleculen beperkt. Native nucleïnezuur inhoud van CPMV virionen werd gebruikt als een elektrostatische spons om beeldvormende middelen en therapeutische moleculen aan te trekken via een eenvoudige infusie techniek (Yildiz et al., 2013). Transiënte coexpressie van CPMV precursor (VP60) die bestaat uit gefuseerde grote en kleine eiwitten en 24K proteïnase voor proteolytische verwerking van VP60 in planten resulteerde in CPMV VLPs (eCPMV), die volledig verstoken waren van RNA (hetzij virus of gastheer) (Saunders et al., 2009). Dergelijke lege capsiden zijn gebruikt om een breed scala aan ladingmoleculen te vervoeren, zoals metalen, fluorescerende kleurstoffen of geneesmiddelen (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan en Han, 2017a). Fluoroforen, biotine affiniteitstags, PEG, en verschillende peptiden zijn selectief weergegeven op het inwendige oppervlak van de lege CPMV door zich te richten op reactieve lysines (Wen et al., 2012b). De doeltreffendheid van eCPMV als een in situ vaccin werd aangetoond in muismodellen van gemetastaseerd melanoom, borstkanker, eierstokkanker en colonkanker, waar het een antitumor immuunrespons induceerde door activering en infiltratie van neutrofielen, resulterend in een chemo/cytokine profiel dat leidt tot activering van adaptieve immuniteit. De meeste muizen die werden geherchallenged met tumoren op de tegenoverliggende flank verwierpen de geherchallengde tumor volledig (Lizotte et al., 2016). Intratumorale toediening van magnetische nanodeeltjes (mNP) om hyperthermie te induceren en eCPMV in combinatie verbeterde de lokale en systemische werkzaamheid van tumorbehandeling (vertraging van secundaire tumorgroei (abscopaal effect) en weerstand tegen tumor rechallenge) in de C3H muis/MTG-B mammacarcinoom en C57-B6 muis/B-16-F10 melanoom kankercelmodellen (Hoopes et al., 2017a). Met behulp van acht spontane kankers bij honden (twee orale melanomen, drie orale amelioblastomen en één carcinoom) toonden Hoopes et al. (2017b) aan dat hypofractioneerde bestraling en mNP-geïnduceerde hyperthermie en intratumorale eCPMV-behandeling in combinatie een verbeterde immuunrespons bleken op te wekken.

Om CPMV te gebruiken voor de gerichte levering van geneesmiddelen aan kankercellen en om de natuurlijke interactie tussen CPMV en zoogdiercellen te overwinnen, werd een “klik”-reactie gebruikt om PEG en folaatligandgroep (CPMV-PEG-FA) te conjugeren aan CPMV. Deze conjugatie maakte specifieke targeting van CPMV op folaatreceptoren (FRs) mogelijk die HeLa en KB cellen tot expressie brengen (Destito et al., 2007). De doelgerichtheid van CPMV op neuroblastoma tumorcellen werd bereikt door CPMV genetisch zo te modificeren dat het neuropeptide Y (NPY) analoog als doelwitligand werd weergegeven. Er werd aangetoond dat de CPMV-NPY specifiek interageerde met SK-N-MC-cellen die de Y1-receptor overexpergeerden (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). Receptorgerichte beeldvorming werd bereikt door het verankeren van korte peptide-sequenties (F56 en bombesine specifiek voor vasculaire endotheliale groeifactor receptor-1 (VEGFR-1)) en gastrine-releasing peptide receptoren (GRPR), respectievelijk, aan CPMV. Deze op CPMV gebaseerde sensoren bleken specifiek te binden aan de kankercellen die deze receptoren overexpresseren op het celoppervlak (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen en Steinmetz (2014) ontwikkelden een bottom-up benadering voor de synthese van CPMV nanodeeltjes, dimeren en assemblages met targeting liganden (cyclische RGD peptiden), en fluorescerende kleurstoffen en vonden dat symmetrische presentatie van RGD peptiden en de dimerisatie van nanodeeltjes de werkzaamheid van kankercel targeting verhoogde.

CPMV is met succes gebruikt voor de weergave van verschillende heterologe peptiden om immuunrespons te induceren. Immunisatie van dieren met elk van de chimera induceerde een sterke humorale immuunrespons die beschermend was tegen de uitdaging door de respectieve ziekteverwekker. Multivalente weergave van antivirale moleculen en koolhydraten op CPMV vergemakkelijkte het gebruik ervan voor therapeutische toepassingen (Lomonossoff en Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) stelden covalente conjugatie van dox aan CPMV vast via ofwel een amidebinding of een disulfidebrug met behulp van lysine- of cysteïneresiduen op het buitenoppervlak van het CPMV. De met dox beladen CPMV vertoonden een hoger celdodend effect dan vrije dox, zelfs bij lage doseringen. CPMV gemodificeerd met een corona van negatief geladen dendrons werd gebruikt om positief geladen fotosensitizers te laden (voor fotodynamische therapie (PDT)). Dit hybride PDT-CPMV dragersysteem was effectief in het doden van zowel melanoomcellen als macrofagen in vitro (Wen et al., 2016). Om de dosis-limiterende niet-specifieke toxiciteiten van driewaardig chroom (een heilzame minerale voedingsstof), die selectief de proliferatie van hoog-glucose-geïnduceerde humane aorta gladde spiercellen (HASMC) in vitro kan remmen, te overwinnen, chroomchloride werd via infusie in de binnenholte van de CPMV gebracht, en de resulterende met CrCl3 geladen CPMV-deeltjes (CPMV-Cr) verminderden de door glucose geïnduceerde HASMC-proliferatie aanzienlijk en vertoonden anti-atherogene effecten onder hyperglycemische omstandigheden (Ganguly et al., 2016).