mecA gene PCR

Een fragment van 188 bp binnen het mecA-gen en een fragment van 178 bp binnen het S. aureus-specifieke Sa442-gen werden voor de isolaten 1 en 2 in afzonderlijke reacties op een LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Duitsland) geamplificeerd met SYBR-groen met de primers Mec-S en Mec-A, respectievelijk Sa442-F en Sa442-RS, zoals eerder beschreven (5). mecA-positieve isolaten genereren SYBR-groene smelttemperaturen van 79°C. Sa442-positieve isolaten genereren ook een SYBR-groene smelttemperatuur van 79°C. S. aureus ATCC 29213 (oxacilline-gevoelig) en S. aureus ATCC 43300 (oxacilline-resistent) werden gebruikt als controles voor het Sa442-gen en als negatieve en positieve controles, respectievelijk, voor het mecA-gen. In tegenstelling tot de controles werd voor de isolaten 1 en 2 geen mecA- of Sa442-product gegenereerd. Er werd een extra PCR uitgevoerd om een groter fragment van 533 bp van het mecA-gen op te sporen (4). Er werd geen product gegenereerd in de isolaten 1 en 2 of S. aureus ATCC 29213, maar een product van de verwachte grootte werd gegenereerd in S. aureus ATCC 43300. Het 16S rRNA-gen, gebruikt als positieve controle, werd geamplificeerd van alle stammen (gegevens niet weergegeven).

Nauwkeurige en tijdige detectie van methicillineresistentie in S. aureus is een belangrijke functie van het klinisch microbiologisch laboratorium (20). Hoewel detectie van het mecA-gen door PCR de gouden standaard is, is aangetoond dat de PBP2a-test met latexagglutinatie een eenvoudige en snelle test is, met goede prestatiekenmerken voor het detecteren van methicillineresistentie in zowel S. aureus als coagulase-negatieve stafylokokken, ondanks de noodzaak van voorafgaande inductie in sommige gevallen (1, 21). De PBP2a-test maakt gebruik van latexdeeltjes die gesensibiliseerd zijn met monoklonale antilichamen tegen PBP2a (11). De specificiteit van deze test benadert naar verluidt 100% (18, 19). Hoewel er geen rapporten zijn betreffende de prestaties van PBP2a latex agglutinatietests voor S. intermedius isolaten, zijn vals-positieve PBP2a resultaten waargenomen met twee S. warneri isolaten, een bij 1 min en de andere bij 6 min, die beide mecA PCR-negatief waren met een oxacilline MIC van ≤ 0,5 μg/ml (21). Volgens de bijsluiter van de fabrikant zijn vals-positieve reacties over het algemeen zwakke agglutinaties die vaak negatief zijn bij herhalingstests met een verse kweek. Wij vonden echter dat onze twee isolaten herhaaldelijk positief waren na meerdere subculturen, waarbij één sterk positief was. De S. intermedius ATCC 29663 stam was in feite negatief door PBP2a test, maar was ook fenotypisch verschillend van de twee klinische stammen met betrekking tot positieve mannitolfermentatie, β-lactamase negativiteit, en penicilline gevoeligheid (resultaten niet getoond).

Coagulasepositiviteit wordt gewoonlijk gebruikt om klinische betekenis en pathogeniteit toe te schrijven aan isolaten van Staphylococcus spp. Hoewel S. aureus de meest voorkomende coagulase-positieve stafylokok is die in het klinisch laboratorium wordt geïsoleerd, zijn S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae, en sommige stammen van S. hyicus ook coagulasepositief (1). Laboratoria gebruiken vaak een combinatie van tests om vrije coagulase of klonterfactor met en zonder proteïne A aan te tonen om coagulase-positieve stafylokokken te identificeren. S. intermedius-isolaten zijn positief voor vrije coagulase maar negatief voor proteïne A, en 14% van de isolaten heeft een klonterfactor, wat de positieve glijcoagulase en de zwak positieve BACTi Staph latex voor isolaat 1 zou verklaren (6). Zoals eerder beschreven, vonden wij pyrrolidonyl arylamidase positiviteit een snelle manier om vast te stellen dat een coagulase-positieve stafylokok geen S. aureus is (10). Wij denken dat onze gevallen suggereren dat de werkelijke incidentie van S. intermedius in menselijke wondinfecties waarschijnlijk wordt onderschat, omdat alle coagulase-positieve stafylokokken vaak over één kam worden geschoren met S. aureus (17). Bij gebrek aan definitieve identificatie van S. intermedius door fenotypische of biochemische methoden, is sequencing van het 16S rRNA-gen nuttig gebleken voor taxonomische classificatie van Staphylococcus- en Macrococcus-soorten (8).

Een eerste studie in 1989 toonde aan dat 72% van de S. intermedius-isolaten van canine gingiva en canine-inflicted wondinfecties gevoelig waren voor penicilline, en geen enkele was resistent tegen oxacilline (16). Een recentere studie toonde aan dat oxacillineresistentie een toenemend probleem is bij S. intermedius-isolaten, met 60 tot 85% hogere oxacillineresistentiecijfers voor isolaten uit neus, ogen en abcessen van honden in vergelijking met die van de andere plaatsen (7). In de eerste menselijke infectie als gevolg van meticillineresistente S. intermedius, waar het de veroorzaker van longontsteking was, was de oxacilline MIC 32 μg/ml (3). Onze beide isolaten waren resistent tegen penicilline en waren β-lactamase-positief; de oxacilline-MIC voor deze isolaten was 0,125 μg/ml. De penicillineresistentie in deze isolaten, in afwezigheid van oxacillineresistentie met een negatieve mecA PCR en gevoeligheid voor β-lactam/β-lactamase inhibitor combinaties, kan verklaard worden door de positieve bevinding van de β-lactamase assay. Met behulp van een primerset gericht op een fragment van 533 bp van het mecA-gen hebben Gortel et al. bevestigd dat het mecA-gen methicillineresistentie veroorzaakt bij stafylokokken die bij honden zijn geïsoleerd (4). Deze onderzoekers ontdekten dat van de 10 coagulase-positieve stafylokokkenstammen die mecA droegen, 9 S. aureus waren en 1 S. intermedius. Zij veronderstelden dat het verschil in prevalentie van methicillineresistentie bij S. intermedius in vergelijking met die van S. aureus te wijten was aan een verschil in mecA-regulatie tussen de soorten of het gebrek aan intense antibiotische selectiedruk op S. intermedius (4). Hoewel er geen specifieke NCCLS-interpretatiecriteria bestaan voor andere coagulase-positieve stafylokokken dan S. aureus, zijn de resultaten van oxacillinegevoeligheidstests met fenotypische en genotypische methoden (mecA-gen PCR met twee primersets gericht op fragmenten van 188 en 533 bp), gecombineerd met lage oxacilline MIC’s vergeleken met die welke eerder zijn gemeld voor oxacilline-resistente S. intermedius isolaten (MIC > 4 μg/ml), stelt vast dat isolaten 1 en 2 in deze studie oxacillinegevoelig zijn (3, 4).

Het is algemeen aanvaard dat methicillineresistentie in S. aureus voornamelijk te wijten is aan de verwerving van een bijkomend penicillinebindend eiwit, PBP2a, gecodeerd door het mecA-gen. Een zoektocht naar de oorsprong van het mecA-gen leidde tot de identificatie van een mogelijke evolutionaire voorloper in S. sciuri, een commensaal van dieren. De mecA homoloog in S. sciuri vertoonde 79.5% DNA-sequentie gelijkenis met het mecA gen van S. aureus en 88% aminozuuridentiteit met PBP2a. Het mecA-homoloog van S. sciuri verleent in de natuur geen resistentie tegen methicilline. Couto et. al. identificeerden echter methicilline-resistente S. sciuri isolaten van mensen, waar overexpressie van de mecA homoloog als gevolg van insertie van een IS256 element stroomopwaarts van het structurele gen of single-nucleotide wijzigingen in de promotor regio resulteerde in de productie van een eiwit dat functioneel lijkt op PBP2a (2). Net als de S. sciuri isolaten kunnen de hier beschreven S. intermedius isolaten een mecA homoloog bevatten dat codeert voor een PBP2a gelijkend eiwit, dat kruisreageert met de PBP2a latex agglutinatietest maar geen methicillineresistentie verleent. Antigene mimicry met een volledig niet-verwant eiwit is ook mogelijk. In beide gevallen hopen we de microbiologische gemeenschap ervan bewust te maken dat er klinische isolaten bestaan die de specificiteit van de PBP2a latex agglutinatietest kunnen betwisten.

Concluderend geven we de eerste melding van vals-positieve PBP2a resultaten voor twee stammen van S. intermedius die, gecombineerd met een aanvankelijke fout in de interpretatie van fenotypische tests, leidden tot een verkeerde identificatie als MRSA. Fout-positieve PBP2a resultaten kunnen leiden tot verkeerd gerichte infectiecontrolepogingen, onnodig gebruik van antibiotica zoals vancomycine, en een algemene stijging van de ziekenhuiskosten (20). Deze gevallen onderstrepen het belang van actief onderzoek naar afwijkende laboratoriumtestresultaten om rapportagefouten te voorkomen. Nauwkeurige soortidentificatie van de coagulase-positieve stafylokokken is essentieel om de pathogeniciteit, klinische betekenis, gevoeligheidspatronen en epidemiologie van de klinische isolaten te bepalen.