Bruikbaarheid van organisch zuur geproduceerd door Exiguobacterium sp. 12/1 bij de neutralisatie van alkalisch afvalwater
Abstract
Het doel van deze studie was de rol te onderzoeken van organische zuren geproduceerd door Exiguobacterium sp. stam 12/1 (DSM 21148) bij de neutralisatie van alkalisch afvalwater afkomstig van de drankenindustrie. Van deze bacterie is bekend dat hij kan groeien in een medium met een pH-waarde tot 12,0 en dat hij alkalisch industrieel afvalwater van pH 12,0 tot pH 7,5 kan neutraliseren. Het eerste onderzoek naar het type functionele groepen dat in het medium aanwezig is, uitgevoerd met FT-IR spectroscopie, bracht de aanwezigheid aan het licht van pieken die overeenkomen met de carbonylgroep en de hydroxylgroep, wat wijst op het vrijkomen van carboxylzuur of verwante metabolische produkten. De identificatie van de specifieke carboxylgroep, uitgevoerd met RP-HPLC, toonde de aanwezigheid van één enkele piek in het kweeksupernatant met een retentietijd die het meest overeenkomt met die van mierenzuur. De concentratie van zuur geproduceerd op verschillende koolstofbronnen werd bestudeerd als functie van de tijd. Hoewel het zuur in dezelfde eindconcentratie aanwezig was, was de zuurproduktiesnelheid het hoogst in het geval van een medium aangevuld met sacharose, gevolgd door fructose en glucose. De kennis van de metabolische producten van de bacterie kan beschouwd worden als een eerste stap naar de realisatie van zijn potentieel voor bioremediëring op grote schaal van alkalisch afvalwater van de drankenindustrie.
1. Inleiding
Alkalifielen-micro-organismen die pH-optima hebben voor groei bij of boven pH 9- hebben een grote impact gemaakt in industriële toepassingen. Biologische detergentia bevatten enzymen, zoals alkalische cellulasen en/of alkalische proteasen, die zijn geproduceerd uit alkalifielen. Alkalifielen zijn ook gebruikt voor de industriële productie van enzymen die van specifiek nut kunnen zijn, bijvoorbeeld cyclodextrine door alkalische cyclomaltodextrine-glucanotransferase en alkalisch actieve maltohexaose-vormende α-amylase die toepassing vinden in de voedingsmiddelen-, chemische en farmaceutische industrie. Er is gerapporteerd dat alkali-behandelde houtpulp biologisch kan worden gebleekt door xylanasen die worden geproduceerd door alkalifielen. Fujiwara en medewerkers hebben melding gemaakt van het gebruik van een alkalische protease om de gelatineachtige coating van röntgenfilms af te breken, waaruit zilver werd teruggewonnen. Alkalifielen hebben ook hun potentieel bewezen bij de biologische afbraak van een verscheidenheid van organische verbindingen .
Zo hebben alkalifiele bacteriën veel belangstelling getrokken vanwege hun extracellulaire enzymen en biochemische eigenschappen zoals alkalifilie en alkalistabiliteit. Hun bio-energetica is ook in enig detail onderzocht, maar er is weinig bekend over hun fysiologie, bijvoorbeeld over hun intracellulaire enzymen en metabolieten. Eigenschappen van het intermediaire metabolische proces zijn belangrijk omdat zij helpen bij de karakterisering van de bacterie, de samenstelling van de enzymen, het metabolische stadium van de cellen en de mogelijkheden voor metabolic engineering. Het vermogen van alkalifielen om de pH van een koolhydraathoudend medium sterk te fluctueren werd in eerdere werkzaamheden benut voor het neutraliseren van sterk alkalisch afvalwater afkomstig van de drankenindustrie, waarbij gebruik werd gemaakt van Exiguobacterium sp. stam 12/1 . Het genus Exiguobacterium behoort tot de orde Bacillales waartoe ook leden van het genus Bacillus behoren. Exiguobacterium sp. 12/1 is een facultatief alkalifiel dat optimaal groeit bij pH 10 en in staat is alkalisch afvalwater te neutraliseren om het terug te brengen van pH 12,0 naar pH 7,5. Aangenomen wordt dat de bacterie een zuur stofwisselingsproduct of zure stofwisselingsproducten vrijmaakt om het sterk alkalische externe medium te neutraliseren. Het is echter belangrijk om het type metabolieten te karakteriseren dat vrijkomt in het extracellulaire medium. Hier bestuderen we de productie van organische zuren als een mogelijk mechanisme voor alkali-neutralisatie. Dergelijke studies zullen nodig zijn voordat de grootschalige toepassingen van de bacterie voor neutralisatie van alkalisch afvalwater van de drankenindustrie kunnen worden ontwikkeld.
De belangrijkste koolstofbron in afvalwater van de frisdrankindustrie is sucrose (disacharide die glucose en fructose bevat), die ook de belangrijkste bijdrage levert aan het biochemisch zuurstofverbruik (BZV). Het gemiddelde BZV van afvalwater van de frisdrankindustrie varieert van 600 tot 4500 mg/L, wat overeenkomt met 673-5052 ppm sucrose. Een literatuuronderzoek naar de stofwisselingsproducten van een groot aantal bacteriën die op eenvoudige suikers groeien, suggereert dat de bacteriën deze eenvoudige suikers zouden kunnen gebruiken om organische zuren te genereren. Dit wordt verder bevestigd door de analyse van de extracellulaire stofwisselingsproducten van andere alkalifiele Bacillus-soorten. Het belangrijkste organische zuur geproduceerd op sucrose koolstofbron bleek in deze studies azijnzuur te zijn. Mierenzuur is een veel voorkomende metaboliet van neutrofiele bacteriën in anaërobe omstandigheden, terwijl B. circulans var. alkalophilus er tot 2 g/L van produceert, zelfs in aërobe culturen. Andere vluchtige zuren zoals propionzuur, boterzuur, isoboterzuur en isovalerzuur zijn typisch voor de stammen Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus, en Bacillus sp. 17-1. Isoboterzuur en isovaleriaanzuur zijn gemeld in de media van verschillende neutrofiele bacillen. Maar deze zuren, evenals propionzuur en boterzuur, worden geacht afkomstig te zijn van aminozuren, gebaseerd op studies op Clostridium sp. Melkzuur en pyrodruivenzuur worden vrij algemeen geproduceerd door neutrofiele bacillen, maar de productie van barnsteenzuur door Bacillus is zeldzaam. Ethanol is niet gedetecteerd in alkalifiele bacillen, hoewel het een typisch product is van glucoseculturen van veel neutrofiele bacillen. Alkalische groeiomstandigheden kunnen dus van invloed zijn op de productie van de neutrale metabolieten. In deze studie hebben we omgekeerde fase high-performance vloeistofchromatografie gebruikt om het type en de concentratie van zuren geproduceerd door Exiguobacterium sp. stam 12/1 tijdens neutralisatie van medium van hoge pH met verschillende soorten koolstofbronnen te bestuderen.
2. Materialen en methoden
2.1. Stam en kweekomstandigheden
De Exiguobacterium sp. 12/1 kweek werd verkregen van DSMZ (DSM 21148) en werd bewaard als glycerolvoorraad. Alkalisch basismedium (ABM) met (alle concentraties in g/L): pepton, 1; gistextract, 0,5; glucose, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (de laatste drie componenten toegevoegd aan het geautoclaveerde medium uit afzonderlijk gesteriliseerde oplossingen) werd gebruikt voor routinematige kweek van stam 12/1 bij 37°C. Voor IR- en RP-HPLC-analyse werd de bacterie gekweekt bij 37°C, 200 rpm in minimaal zout medium (MSM) met (alle concentraties in mM): K2HPO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA dinatriumzout, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 en 1% (w/v) van een van de volgende koolhydraten: glucose, fructose of sacharose (alle componenten toegevoegd uit de afzonderlijk gesteriliseerde geconcentreerde stamoplossingen). De uiteindelijke pH van het medium werd op 10,5 gebracht met 1 N NaOH.
2.2. Analyse van groei en pH
1 mL log-fase cultuur op ABM werd gebruikt om preculturen (50 mL) te inoculeren (MSM met 1% suiker). De eigenlijke testcultuur (250 mL MSM in 500 mL Erlenmeyer) werd geënt met de volledige precultuur in middenlogfase (O.D. ~ 1.2). Elke kweekset bestond uit drie kolven. De extinctie van de monsters bij 650 nm werd gebruikt als maat voor de bacteriële groei. De pH werd bepaald in celvrije kweekmonsters bij kamertemperatuur na centrifugatie 4000 ×g gedurende 20 min.
2.3. FT-IR Analyse
De cultuur werd na 60 uur groei geoogst en gedurende 20 min. bij 4000 ×g gecentrifugeerd. Voor IR-analyse werd het supernatant van de cultuur gevriesdroogd en tot poeder vermalen. Het supernatans in poedervorm werd vervolgens gemengd met kaliumbromide, en het mengsel werd tot tabletten geperst. Tenslotte werd de tablet geanalyseerd met behulp van de FT/IR-4200 spectrometer (JASCO, Tokyo, Japan).
2.4. RP-HPLC Analysis
De cultuur werd op verschillende tijdstippen geoogst en gecentrifugeerd bij 4000 ×g gedurende 20 min. Voor HPLC-analyse werd het supernatant van de cultuur door een 0,22 μm filter gefiltreerd en werd 10 μl gefiltreerd monster in de HPLC-kolom geïnjecteerd.
Analytisch standaard mierenzuur, azijnzuur, barnsteenzuur, propionzuur, melkzuur en isoboterzuur werden verkregen van Sigma. Standaard stockoplossingen (100 mg/ml of 100 μL/ml) werden bereid en werden bij 4°C bewaard voor verder gebruik. Werkstandaardoplossingen (10 mg/ml of 10 μL/ml) werden dagelijks bereid. Milli-Q water (Millipore) werd gebruikt om buffer- en stockoplossingen van elke verbinding en monsters te bereiden. De stockoplossingen, monsters en buffer werden gefiltreerd door cellulosemembraanfilters Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). De oplosmiddelen werden vóór gebruik onder vacuüm ontgast.
De analyse van organische zuren werd uitgevoerd volgens de methode van Tormo en Izco . De analyse werd uitgevoerd op een Breeze System (Waters, Mildford, MA, USA) bestaande uit een 1525 binaire HPLC-pomp, een 717 plus autosampler, en een 2487 tweekanaals UV-detector ingesteld op 210 nm, bediend met een Breeze-software. De scheiding werd uitgevoerd op een Atlantis dC18-kolom (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. 20 mM NaH2PO4, met fosforzuur op pH 2,20 gebracht, werd dagelijks bereid en gefiltreerd over 0,2 μm hydrofiele membranen (Millipore). Het oplosmiddelprogramma maakte gebruik van twee reservoirs met 1% acetonitril in 20 mM fosfaatbuffer, op pH 2,20 gebracht met fosforzuur (oplosmiddel A) en acetonitril (oplosmiddel B); de stroomsnelheid werd ingesteld op 1,5 mL/min bij kamertemperatuur. Het gradiëntprogramma begon met 100% oplosmiddel A en na 7 min werd oplosmiddel B lineair verhoogd tot 7% in 5 min. Van 12 tot 19 min. werd de snelheid gehouden op 93% van oplosmiddel A en 7% van oplosmiddel B. Daarna werd de snelheid gewijzigd naar de startcondities om de kolom gedurende 15 min. te equilibreren alvorens opnieuw 10 μL van het volgende monster te injecteren.
3. Resultaten
3.1. Analyse van neutralisatie op gedefinieerd medium
Minimaal zout medium werd geselecteerd voor de analyse van organisch zuur geproduceerd door de bacterie vanwege het gedefinieerde karakter en de vergelijkbare koolstofbron als afvalwater van de drankenindustrie. De bacterie mocht groeien in een minimaal zout medium aangevuld met verschillende koolstofbronnen glucose, fructose en sucrose. Figuur 1 toont het groeiprofiel en de pH-kenmerken van het medium in de tijd. Fructose en sucrose gaven een veel snellere neutralisatie van het medium in vergelijking met glucose. De eind-pH verkregen met glucose was ook iets hoger dan die verkregen in het geval van met sucrose en fructose aangevuld medium. Dit komt ook tot uiting in het groeiprofiel van de bacterie die op de drie koolstofbronnen is gekweekt. De bacterie groeide sneller in sucrose, gevolgd door fructose en glucose.
(a)
(b)
(a)
(b)
Variatie in pH (a) en O.D. (b) met de tijd op MSM. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde van drie herhaalde metingen, en de foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking.
3.2. Identification of Functional Group Present in the Culture Supernatant
Om de functionele brede groep te identificeren van de metaboliet die door de bacterie wordt geproduceerd om alkalisch afvalwater te neutraliseren, werd het gevriesdroogde kweeksupernatant onderworpen aan FT-IR-spectroscopie. Twee pieken die corresponderen met de carbonylgroep (bij 1644,98 cm-1) en de hydroxylgroep (bij 3436,74 cm-1) waren in het spectrum aanwezig (Tabel 1). Volgens het literatuuronderzoek produceert de bacterie hoogstwaarschijnlijk organische zuren als metabolisch product dat het alkalische afvalwater neutraliseert.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Identificatie van het specifieke stofwisselingsproduct van de bacterie
Om het door de bacterie geproduceerde organische zuur te identificeren, werd HPLC met omgekeerde fase uitgevoerd met behulp van bekende organische zuurstandaarden die na literatuuronderzoek waren geselecteerd. De standaards werden zowel afzonderlijk (figuur 2(a)) als in een mengsel (figuur 2(b)) uitgevoerd om eventuele verschillen in retentietijd ten gevolge van interferentie door andere organische zuren in het medium vast te stellen. De RT van de gestandaardiseerde organische zuren bleek in beide gevallen gelijk te zijn, waarbij het verschil in retentietijd niet meer dan 0,09 eenheden bedroeg, behalve voor propionzuur (tabel 2). Het supernatant van de kweek werd volgens dezelfde methode geanalyseerd en bleek een enkele piek te bevatten met een soortgelijke retentietijd als mierenzuur. Dit werd verder bevestigd door het supernatans te begieten met standaard mierenzuur waarvan de piek superieur was aan die van het product in het supernatans (figuur 2(d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-HPLC-chromatogrammen van afzonderlijke gestandaardiseerde organische zuren (a), standaard organische zuren in mengsel (b), supernatant van de kweek (c), en supernatant van de kweek waaraan mierenzuur is toegevoegd.
3.4. Kwantitatieve analyse van het stofwisselingsproduct van de bacterie
Voor de kwantitatieve analyse van kweeksupernatant werden verschillende standaardconcentraties mierenzuur gebruikt, en werd het piekgebied dat met elke concentratie overeenkomt, berekend. De piekoppervlakte werd uitgezet tegen de concentratie om een standaardkromme te verkrijgen (figuur 3). Deze standaardcurve werd gebruikt om de hoeveelheid zuur te berekenen die met de tijd werd geproduceerd op een minimaal zout medium aangevuld met verschillende koolstofbronnen. Het kweeksupernatant van de bacterie werd tijdsafhankelijk geanalyseerd en opnieuw onderworpen aan HPLC-analyse met omgekeerde fase. Er werd vastgesteld dat de piek van het hoofdproduct in het bacteriële kweeksupernatant toeneemt met de tijd. De retentietijd van het zuur is vergelijkbaar met die van mierenzuur. De studie van mierenzuur geproduceerd met verschillende koolstofbronnen als functie van de tijd is weergegeven in figuur 4. De grootste hoeveelheid zuur werd geproduceerd in het geval van MSM aangevuld met sacharose, gevolgd door fructose en glucose.
Standaardcurve voor de bepaling van de concentratie van mierenzuur in het kweeksupernatans.
Variatie in hoeveelheid organisch zuur geproduceerd met de tijd op MSM aangevuld met verschillende koolstofbronnen. De waarden vertegenwoordigen het gemiddelde van drie herhaalde metingen, en de foutbalkjes vertegenwoordigen de standaardafwijking.
4. Discussie
De belangrijkste koolstofbron in het effluent van de drankenindustrie afvalwater is sacharose . Daarom werd voor de analyse van het metabolisch product dat tijdens de neutralisatie wordt geproduceerd, een goed gedefinieerd minimaal zout medium geselecteerd dat sacharose en de twee samenstellende monosacharide suikers – glucose en fructose – bevat. De groeikarakteristieken van stam 12/1 op een minimaal zout medium aangevuld met de drie koolstofbronnen laten een efficiënte neutralisatie zien die gepaard gaat met de groei (Figuren 1(a) en 1(b)). De daling van de pH van het groeimedium is noodzakelijkerwijs toe te schrijven hetzij aan de vorming van zuren, hetzij aan de verwijdering van basen.
De productie van zuren is goed gedocumenteerd in het geval van bacteriën gekweekt op enkelvoudige suikers. De stofwisselingsproducten van sommige alkalifiele leden van het geslacht Bacillus zijn bestudeerd. Het belangrijkste organische zuur geproduceerd op sucrose koolstofbron bleek in deze studies azijnzuur te zijn. De genoomsequenties van alkalifiele bacillus-soorten – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans en Bacillus clausi – ondersteunen deze waarneming eveneens, aangezien al deze soorten een functionele pyruvaat-acetaatomzettingsroute hebben. Mierenzuur is een veel voorkomende metaboliet van neutrofiele bacteriën in anaërobe omstandigheden, terwijl B. circulans var. alkalophilus er tot 2 g/L van produceert, zelfs in aërobe culturen. Andere vluchtige zuren zoals propionzuur, boterzuur, isoboterzuur en isovalerzuur zijn kenmerkend voor de stammen Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus en Bacillus sp. 17-1. Isoboterzuur en isovaleriaanzuur zijn gemeld in de media van verschillende neutrofiele bacillen. Maar deze zuren, evenals propionzuur en boterzuur, worden geacht afkomstig te zijn van aminozuren, gebaseerd op studies op Clostridium sp. Melkzuur en pyrodruivenzuur worden vrij algemeen geproduceerd door neutrofiele bacillen, maar de productie van barnsteenzuur door Bacillus is zeldzaam. Ethanol is niet gedetecteerd in alkalifiele bacillen, hoewel het een typisch product is van glucoseculturen van veel neutrofiele bacillen. Aldus kunnen de alkalische groeiomstandigheden de productie van de neutrale metabolieten beïnvloeden.
De eerste studies over de metabolische producten in het geval van Bacillus sp. werden uitgevoerd met behulp van titrimetrische procedure. De verhoogde buffercapaciteit van het bacteriële kweeksupernatant rond pH 5, het typische protonatiebereik van carbonzuren, werd gebruikt om te veronderstellen dat het medium carbonzuren bevat. In deze studie hebben wij FT-IR spectroscopie gebruikt om de functionele groep van de in het kweeksupernatant aanwezige verbinding(en) vast te stellen. De FT-IR spectrograaf toonde de karakteristieke pieken van de carbonylgroep (bij 1644,98 nm) en de hydroxylgroep (bij 3436,74 nm) (Tabel 1), wat wijst op de aanwezigheid van een chemische stof bestaande uit hydroxyl- en carbonylgroep en die hoogstwaarschijnlijk carboxylzuur is.
De omgekeerde fase HPLC-methode werd gebruikt om de organische zuren aanwezig in de kweeksupernatant te analyseren. De HPLC-omstandigheden werden gekozen voor de best gerapporteerde resolutie, d.w.z. pH 2,2 en 1% acetonitril. De omgekeerde-fase-HPLC-methode is voordelig omdat goedkopere kolommen kunnen worden gebruikt, de analyseparameters gemakkelijker kunnen worden gemanipuleerd om de scheiding te optimaliseren, en de analyses bij kamertemperatuur kunnen worden uitgevoerd. De methode werd eerst gebruikt om de retentietijd te berekenen van zuurstandaarden die volgens het literatuuronderzoek waren gekozen. De volgorde van elutie van zuren onder deze omstandigheden was dezelfde als die gerapporteerd in Tormo en Izco , maar er was variatie in de retentietijden waargenomen in deze studie en die gerapporteerd in Tormo en Izco . Deze variatie kan worden toegeschreven aan verschil in HPLC-condities, zoals temperatuur 25-30 ° C in deze studie versus 24 ° C ± 1 ° C gerapporteerd in Tormo en Iczo .
De RP-HPLC van kweeksupernatant vertoont de aanwezigheid van een enkele piek met absorptie bij 211 nm, wat de karakteristieke absorptiegolflengte is van organische zuren. Het supernatant bevat dus één enkele chemische stof, hoogstwaarschijnlijk een organisch zuur. Uit de vergelijking van de retentietijd van deze piek met de retentietijd van standaard organische zuren blijkt dat de retentietijd het meest overeenkomt met mierenzuur. Deze waarneming werd verder bevestigd door de toevoeging van mierenzuur aan het supernatant van de kweek, waardoor de piekoppervlakte van het product toeneemt (figuren 2(c) en 2(d)). De aanwezigheid van mierenzuur in het supernatant van de kweek komt overeen met de stofwisselingsproducten van sommige alkalifiele leden van het geslacht Bacillus, alsmede van sommige anaërobe, saccharolytische alkalifiele bacteriën zoals Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum en Amphibacillus tropicus.
De maximale daling in pH-eenheden die per tijdseenheid optreedt die tot dusver is gerapporteerd bij alkalifiele bacteriën is 0,13 eenheden per uur in het geval van Bacillus circulans var. alkalophilus, wat vrij laag is in vergelijking met de daling van meer dan twee eenheden tijdens de eerste 1 uur van inoculatie die in deze studie is gerapporteerd. De grote daling van de pH wijst op de vorming van zure kataboliseringsproducten. De snelheid van de daling van de pH alleen wijst echter niet op een toename van de concentratie van zuren. Daarom werd een kwantitatieve analyse van het stofwisselingsproduct van de bacterie uitgevoerd met behulp van RP-HPLC. HPLC kreeg de voorkeur boven GC, aangezien uit een vergelijking van GC- en HPLC-methoden voor de bepaling van organische zuren in kweeksupernatanten van alkalofiele bacteriën blijkt dat de resolutie van zuren met GLC uitstekend was, maar dat de kwantitatieve reproduceerbaarheid met HPLC beter was dan met GLC . Zoals verwacht bleek de concentratie van geproduceerd zuur toe te nemen met de toename van de incubatietijd (figuur 4). In feite bleef de hoeveelheid zuur toenemen lang nadat de minimale pH was bereikt. Dit is in overeenstemming met eerdere studies van zuurproductie bij facultatief en obligaat alkalifiele Bacillus sp. waar de zuurproductie zelfs bleef toenemen 30 h nadat de minimum pH was bereikt. Uit de vergelijkende analyse van het metabolisch product dat werd geproduceerd in media waaraan verschillende koolstofbronnen waren toegevoegd, blijkt dat, hoewel het zuur in dezelfde eindconcentratie aanwezig was, de zuurproductie het hoogst was in het geval van een medium waaraan sucrose was toegevoegd, gevolgd door fructose en glucose (figuur 4). Dit is in overeenstemming met de groeikarakteristieken van het organisme in de media die met deze suikers zijn aangevuld.
5. Conclusie
Exiguobacterium sp. stam 12/1 neutraliseert de pH van het externe medium door de productie van organisch zuur met korte keten – mierenzuur. Met het oog op de potentiële toepassing van grootschalige bioremediëring van alkalisch afvalwater, kan deze alkali-neutralisatiecapaciteit van de bacterie voor afvalwater van de drankenindustrie worden beschouwd als een eerste stap in de richting van de exploitatie van zijn commercialiseringspotentieel.
Acknowledgments
N. M. Kulshreshtha erkent University Grants Commission voor onderzoeksbeurs. De auteurs zijn de Council of Scientific and Industrial Research, India, zeer erkentelijk voor het ter beschikking stellen van een R&D platform en faciliteiten voor dit onderzoek.