Abstract

Er zijn weinig studies verricht naar de medische flora van het Mexicaanse schiereiland Yucatan, op zoek naar nieuwe therapeutische middelen, in het bijzonder tegen kanker. In dit artikel evalueerden we het cytotoxisch potentieel van het extract van Bonellia albiflora, een plant die in de traditionele Maya geneeskunde wordt gebruikt voor de behandeling van chronische verwondingen van de mond. Wij hebben de methanolische extracten van verschillende delen van de plant uitgevoerd door middel van extractie met de Soxhlet-apparatuur. We voerden vloeistof-vloeistoffracties uit op elk extract met oplosmiddelen van toenemende polariteit. Alle extracten en fracties werden geëvalueerd op cytotoxische activiteit tegen vier menselijke kanker cellijnen en een normale cellijn door middel van een tetrazolium kleurstof reductie (MTT) assay in 96-well celkweekplaten. Het methanolische wortelschorsextract bezat een veel grotere cytotoxische activiteit in de menselijke orofaryngeale kankercellijn (KB); de hexanische fractie concentreerde de actieve metabolieten en induceerde apoptose met de activering van caspasen 3 en 8. De resultaten tonen het cytotoxische potentieel van de hexanische fractie van B. albiflora aan en onderstrepen het belang van de studie van de traditionele medicinale planten van de Maya’s.

1. Inleiding

Traditionele geneeskunde is een praktijk die vanaf de oudheid tot in onze tijd wordt beoefend door de bewoners van de inheemse pueblo’s van Mexico, waaronder de Maya-bevolking van het schiereiland Yucatan in Mexico valt. In de traditionele geneeskunde van de Maya’s zijn planten van groot belang, hetgeen kan worden beschouwd als bewijs van hun doeltreffendheid bij de bestrijding van vele soorten ziekten. Evenzo vormen zij een van de belangrijkste alternatieven voor de gezondheidszorg, vooral in gemeenschappen waar de eerstelijnsgezondheidszorg niet toegankelijk is. Bovendien kunnen zij op grote schaal worden benut als een natuurlijke hernieuwbare hulpbron. Samen met wat eerder werd beschreven, werd de traditionele geneeskunde van de inheemse pueblo’s erkend door de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO), wat een krachtige impuls gaf aan het onderzoek naar medicinale planten.

De etnobotanische literatuur van de Maya’s bestaat voor het grootste deel uit historische of beschrijvende studies, waarvan de inhoud overheerst door een compendium van ziekten en behandelingen die de Maya-genezers uit verschillende tijdperken kenden. De Maya’s kenden en behandelden verschillende ziekten, waaronder infectieziekten (darminfecties, infectieuze dermatitis en infecties van de luchtwegen), chronische ziekten (astma, vermoeidheid, nefritis en hypertensie) en psychologische ziekten (slapeloosheid, nervositeit en hysterie). Bovendien genazen zij andere ziekten zoals: abcessen; eelt; likdoorns, harde uitsteeksels; poliepen; tumoren; en wratten of zweren, meestal voelbaar of zichtbaar op de huid.

In de traditionele Maya-geneeskunde van het Yucatan-schiereiland wordt “kanker” aangeduid als een ziekte of een reeks ziekten die zich kunnen manifesteren als een aantasting van de huid of de onderliggende spiermassa, of een aantasting in de vorm van pijn in een of ander inwendig orgaan. De term verwijst naar een moeilijk te genezen ziekte of een ziekte met een onaangenaam aspect (als het de huid betreft); als het een inwendige kanker is, verraadt de verschijningsvorm van de patiënt de ziekte. De oude bewoners gaven in de taal van de Maya’s namen aan deze symptomen; in de taal van de Maya’s wordt “kanker” “tsunuz” of “tsunuztacan” genoemd, en harde uitsteeksels of tumoren staan bekend als “chu’uchum”.

Eerdere studies hebben aangetoond dat de extracten van planten die in de traditionele geneeskunde van de Maya’s worden gebruikt voor de behandeling van tekenen en symptomen die op kanker wijzen, cytotoxische activiteit bezitten. Evenzo hebben twee studies, uitgevoerd op twee soorten van het geslacht Bonellia (Bonellia macrocarpa en Bonellia flammea) van het schiereiland Yucatan, de aanwezigheid aangetoond van nieuwe verbindingen, zoals actieve stoffen met anticarcinogene activiteit . In dit verband kent het schiereiland Yucatan vijf soorten van het geslacht Bonellia, waarvan de soorten B. macrocarpa, B. flammea en B. albiflora in de traditionele Maya-geneeskunde worden gebruikt voor de behandeling van dermatologische aandoeningen. Van deze drie soorten is alleen B. albiflora nog niet het onderwerp geweest van fytochemisch onderzoek of onderzoek naar biologische activiteit. B. albiflora wordt in de traditionele Maya-geneeskunde “Si’ik” genoemd en wordt gebruikt als antitussivum voor de behandeling van huid- en mondwonden en ter verlichting van de pijn bij kiespijn. In dit werk stelden we een evaluatie voor van het cytotoxisch potentieel van de organische extracten van B. albiflora.

2. Materialen en Methoden

2.1. Plantaardig materiaal

Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl en Källersjö werd verzameld op verschillende plaatsen in de staat Yucatan, Mexico, tijdens de zomer van 2010. Het plantmateriaal werd geïdentificeerd en geauthenticeerd door taxonomen van het Departement Natuurlijke Rijkdommen van het Wetenschappelijk Onderzoekscentrum van Yucatan (CICY).

2.2. Chemische stoffen

Dulbecco’s gemodificeerd Eagle’s medium (DMEM), warmte-geïnactiveerd foetaal runderserum (FBS), en penicilline en streptomycine (PS) werden gekocht bij Gibco, Carlsbad, CA, USA. 3-(4-5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromide (MTT), dimethylsulfoxide (DMSO), en etoposide werden aangekocht bij Sigma, St. Louis, MO, USA. Caspase assay kits en apoptotisch DNA laddering kit werden gekocht bij BioVision Research Products, Palo Alto, CA, USA.

2.3. Extractie en fractionering

Elk plantaardig deel werd gescheiden, gedroogd en verpulverd. Gedroogd poeder van het afgescheiden plantaardige materiaal (100 g) werd met een Soxhlet-apparaat bij 60°C uitputtend geëxtraheerd met methanol (500 mL). Het supernatants werd gefiltreerd en verdampt onder vacuüm door middel van een rotaevaporator om een gedroogd extract te verkrijgen. Het methanolextract van elk plantaardig materiaal (10 mg) werd gesuspendeerd in 20 mL methanol : water (1 : 3) en achtereenvolgens geëxtraheerd met 50 mL oplosmiddelen van toenemende polariteit: hexaan, dichloormethaan en ethylacetaat, zodat het uiteindelijke residu-extract een waterige fractie was. De vingerafdruk van het actieve hexaanextract (5 mg) werd verkregen voor gaschromatografie-massaspectrometrie (GC-MS).

2.4. Cellijnen en kweek

Cellijnen van het orofarynxcarcinoom (KB ATCC-CCL-17), larynxcarcinoom (Hep-2), cervixadenocarcinoom (HeLa ATCC-CCL-2), en cervix squameus carcinoom (SiHa ATCC-CCL-35), alsmede één normale cellijn, canine cell kidney (MDCK ATCC-CCL-34), van de American Type Culture Collection (ATCC) werden vriendelijk ter beschikking gesteld door Veronica Vallejo-Ruíz van het East Biomedical Research Center-IMSS. De cellen werden gekweekt in DMEM-medium, dat 10% SFB bevatte, aangevuld met 100 eenheden/ml penicilline G en 100 μg/ml streptomycine in 5% CO2-95% bevochtigde lucht bij 37°C.

2.5. Cytotoxicity Assay

De cytotoxiciteit werd bepaald door de MTT-assay volgens de methode beschreven door Denizot en Lang met enkele wijzigingen. In het kort werden levensvatbare cellen van elke cellijn uitgezaaid in een 96-wells plaat en geïncubeerd gedurende 24-48 h. Wanneer de cellen >70% confluentie bereikten, werd het medium vervangen en werden de cellen behandeld met het extract opgelost in DMSO (maximale concentratie van 0,05%) aan 2,34 tot 300 g/mL. Na 48 uur incubatie werd 10 μl MTT (5 mg/ml) toegevoegd aan elk putje en geïncubeerd bij 37°C gedurende 4 uur. Het medium werd verwijderd en het formazanneerslag werd opgelost in 100 μl aangezuurde isopropanol (0,4 N HCl). De optische dichtheid werd bepaald met een spectrofotometer bij 540 nm. Cellen behandeld met 0,05% DMSO en docetaxel werden gebruikt als negatieve en positieve controles, respectievelijk. De concentratie van het extract dat 50% van de cellen doodde (CC50) werd berekend met GraphPad Prism 4.00 software. Alle bepalingen werden in drievoud uitgevoerd. De MDCK-cellijn werd gebruikt om de selectieve index (SI) van de extracten te evalueren. SI wordt gedefinieerd als de verhouding tussen de cytotoxische activiteit van normale cellijnen en die van kankercellijnen.

2,6. GC-MS-analyse

De chromatografische scheiding werd uitgevoerd door GC-MS-analyse op een Agilent gaschromatograaf, model 6890N, gekoppeld aan een massaselectieve detector, model 5975B. De verbindingen werden gescheiden op een DB-5 ms capillaire kolom (30 m × 0,32 mm i.d., 0,25 μm filmdikte) (J&W Scientific, Folsom, CA, USA). Eén microliter van het monster werd in GC-MS geïnjecteerd met gebruikmaking van de splitmodus (50 : 1). De injectortemperatuur bedroeg 250 °C. De kolomtemperatuur werd als volgt geprogrammeerd: begintemperatuur bij 160 °C gedurende 3 min, 10 °C/min tot 240 °C, 240 °C gedurende 2 min, 5 °C/min tot 250 °C, 250 °C gedurende 10 min, 5 °C/min tot 300 °C en 300 °C gedurende 10 min. De voorwaarden voor de massadetector waren als volgt: elektronische impact (EI) modus bij 70 eV; brontemperatuur: 230°C; scansnelheid: 1 scan/s; massa-acquisitiebereik: 20-600 amu; oplosmiddelvertraging, 4 min. Als draaggas werd helium gebruikt met een snelheid van 1 ml/min. De vluchtige componenten werden voorlopig geïdentificeerd door hun massaspectra te vergelijken met behulp van de NIST Standard Reference Database versie NIST 05 voor Windows. Een authentieke standaard van bonediolverbinding werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Dr. Peraza-Sánchez van CICY.

2.7. Analyse van DNA-fragmentatie

DNA-fragmentatie werd bepaald volgens de methode beschreven door Tong et al. Kort gezegd werden de cellen behandeld met het extract in 10 en 50 μg/mL en geïncubeerd gedurende 6, 12 en 24 uur. Na de incubatie werden de cellen geoogst door centrifugatie en tweemaal gewassen in ijskoud PBS. Een apoptotisch DNA laddering kit (BioVision apoptotisch DNA ladder extractie kit) werd gebruikt om DNA te isoleren volgens het protocol van de fabrikant; het DNA in de monsters werd gescheiden op 1,5% agarose gel met 1 ug / ml van ethidium bromide. De DNA-banden werden gevisualiseerd onder ultraviolet licht en gefotografeerd.

2.8. Assays of Caspases Activities

Caspases 3, 8, en 9 activiteiten werden uitgevoerd met behulp van FLICE/Caspase Colorimetric assay kit, volgens de protocollen van de fabrikant. Kort samengevat werden de cellen die gedurende 6, 12 of 24 uur met 10 of 50 μg/ml extract werden behandeld, geoogst, met PBS gewassen en bij 800 ×g gedurende 10 min bij 4 °C gecentrifugeerd. De celpellets werden geresuspendeerd in 50 pi lysisbuffer en geïncubeerd op ijs gedurende 10 min alvorens te worden gecentrifugeerd bij 10.000 ×g gedurende 1 min. Het supernatant werd verzameld in een 1,5 mL buis en bewaard op ijs. Na het meten van de eiwitconcentratie, werd 200 ug eiwit opgelost in 50 pi cel lysis buffer. De reactiebuffer met 10 mM DDT werd aan elk monster toegevoegd. Tenslotte werd een specifiek substraat voor elke caspase (DEVD-ρNA, IETD-ρNA, en LEHD-ρNA) aan de monsters toegevoegd, gedurende 1 uur bij 37°C geïncubeerd en bij 405 nm afgelezen. De enzymactiviteit werd uitgedrukt in een veelvoud ten opzichte van het controlemonster.

3. Resultaten en Discussie

3.1. Cytotoxische activiteit van de methanolische extracten

De cytotoxiciteitsresultaten van de methanolische extracten van verschillende delen van B. albiflora zijn samengevat in tabel 1. Het methanol extract van de wortelschors vertoonde de meest interessante cytotoxische activiteit vergeleken met extracten van B. albiflora bladeren en stamschors, met een CC50 van 12-31 μg/mL op de vier menselijke kanker cellijnen. De KB-cellijn toonde een grotere gevoeligheid voor het extract met een CC50 van 12,64 μg/mL. De niet-tumor canine nier cellijn MDCK was minder gevoelig voor de effecten van het extract met een SI van >5 in de geëvalueerde cellijnen (tabel 1). Het US National Cancer Institute (NCI) heeft voorgesteld dat ruwe extracten met potentiële cytotoxische activiteit diegene zijn met een CC50 van ≤30 μg/mL; dit extract werd dus geïdentificeerd als belangrijk voor toekomstige studies. Deze gegevens zijn vergelijkbaar met die van actieve methanolextracten van B. macrocarpa-wortel op menselijke cellijnen: KB, prostaat adenocarcinoom (PC3), cervix squameus carcinoom (SiHa), borst adenocarcinoom (MCF-7), cervix adenocarcinoom (HeLa), en laryngeaal carcinoom (Hep-2) .

Het extract van de bladeren was het tweede in grootste activiteit, alleen op de KB cellijn met een CC50 van 23.85 μg/mL volgens de NCI-criteria, gevolgd door dat van het extract van de stamschors, dat minder cytotoxisch was voor KB- en Hep-2-cellijnen.

3.2. Cytotoxische activiteit van de fracties

De methanolische extracten van verschillende delen van de plant werden gefractioneerd met oplosmiddelen van toenemende polariteit voor latere cytotoxiciteitsstudies bij de cellijnen. De hexanische fractie verkregen uit de vloeistof-vloeistof partitionering van het methanol extract van de wortelschors (HFBa) vertoonde superieure cytotoxische effecten in vergelijking met het oorspronkelijke extract, met een CC50 tussen 2 en 27 μg/mL in de verschillende cellijnen (tabel 2). De SI van de hexanische fractie verbeterde ook in vergelijking met het originele extract in de beoordeelde cellijnen (SI = 5-54). De methanolische fracties van de schors- en bladextracten waren niet actief bij concentraties van >200 μg/mL (gegevens niet aangetoond).

Vroeger hebben we een biogeleide studie uitgevoerd om de antiproliferatieve activiteit van B. macrocarpa te evalueren, wat de isolatie van de verbinding bonediol opleverde, die een matige activiteit in kankercellijnen vertoonde. In de huidige studie werden echter geen cytotoxische effecten met HFBa aangetoond die vergelijkbaar waren met die van het oorspronkelijke methanol extract in de geëvalueerde cellijnen (tabel 2). Een verklaring voor deze resultaten kan zijn dat bonediol een bepaald punt van de celproliferatie remt (celcyclus of replicatie van DNA), terwijl de effecten die worden waargenomen in de cytotoxische test schade of algemene toxiciteit zijn (apoptose of necrose) .

HFBa vertoonde betere cytotoxische effecten in vergelijking met bonediol en was selectiever ten opzichte van de tumor dan ten opzichte van normale cellen; SI wordt beschouwd als een indicator van biologische activiteit en is niet gerelateerd aan cytotoxiciteit als de SI >10 is. In dit opzicht voldeed alleen HFBa aan deze criteria en was krachtiger in de KB-cellijn met een CC50 van 2,73 μg/mL; deze cellijn is gerelateerd aan mondkanker en komt overeen met het gebruik van de plant in de traditionele Maya-geneeskunde voor chronische orale laesies , een term die in verband zou kunnen worden gebracht met kanker.

3.3. GC-MS Analyse

Identificatie en chemische analyse van bioactieve hexaanfractie door GC-MS wordt weergegeven in tabel 3. Het chromatogram vertoonde in totaal acht pieken, waarvan er zes door de database werden geïdentificeerd: dodecaanzuur; tridecaanzuur; 2-nonyl-malonzuur, dimethylether; stigmasta-7,16-dien-3-ol; 9,19-cyclo-lanost-24-en-3-ol; en bonediol. Dit laatste werd geïdentificeerd aan de hand van de retentietijd en vergelijking van het massaspectrum van een authentieke standaard die eerder uit B. macrocarpa geïsoleerd was. De belangrijkste gevonden componenten waren de volgende: 2-nonyl-malonzuur, dimethyl ester (37,39%), gevolgd door stigmasta-7,16-dien-3-ol (13,63%), dodecaanzuur (13,22%), 9,19-Cyclo-lanost-24-en-3-ol (9,90%), en bonediol (8,98%). Niet-geïdentificeerde componenten met retentietijden van 8,092 (6,22%) en 14,207 (5,38%), alsmede n-tridecaanzuur (5,25%), waren minder belangrijke verbindingen in de HFBa (figuur 1).

Figuur 1

Gaschromatografie van HFBa.

Bonediol werd geïsoleerd uit het methanolische extract van B. macrocarpa wortels als een bioactief bestanddeel. In dit werk hebben we de aanwezigheid van deze verbinding in een lage concentratie vastgesteld; het zou dus een mogelijke chemotaxonomische marker kunnen zijn. In andere soorten, zoals B. pungens, is een triterpeen geïsoleerd, en uit B. ruscifolia zijn twee triterpenen geïsoleerd, zonder dat biologische activiteit werd gerapporteerd. In dit werk hebben wij alleen bewijs gevonden voor de aanwezigheid van een van lanosterol afgeleid triterpeen in de actieve hexanische fractie. Bovendien hebben wij een sterol gedetecteerd dat van ubiquitine is afgeleid, een derivaat van stigmasterol. Voor zover wij weten, is dit de eerste keer dat beide verbindingen in dit geslacht zijn gerapporteerd.

De laatste jaren is niet alleen de studie van medisch bio-actieve verbindingen uit planten frequenter geworden, maar ook die van de plantenextracten zelf of het mengsel van verbindingen die samen een betere biologische activiteit zouden kunnen opleveren dan die van een enkele verbinding. In dit werk worden de componenten beschreven als de fingerprinting van HFBa uitgevoerd door GC-MS voor toekomstige standaardisaties.

3.4. DNA Fragmentatie

We stelden vast dat het methanolextract van de wortels van B. albiflora een typische morfologie van apoptose vertoonde (gegevens niet weergegeven) op KB cellijnen. Evenzo werd aangetoond dat HFBa apoptotische morfologie op KB cellijnen induceert. Deze resultaten leidden ons ertoe te evalueren of de hexanische fractie die de grootste cytotoxiciteit en apoptosemorfologische kenmerken in de KB-cellijn vertoonde, dit proces kon induceren; daarom evalueerden wij de fragmentatie van DNA, typisch voor het proces van apoptose. De fragmentatie van het DNA werd geregistreerd van minder naar meer binnen een concentratiebereik van 10 of 50 μg/mL en een incubatietijd van 6-24 uur. Figuur 2 toont de typische fragmentatie van het DNA in KB-cellen na behandeling met 50 μg/mL HFBa en een incubatietijd van 18 uur. Verschillende studies hebben het apoptotische effect van bepaalde methanolische plantenextracten aangetoond. Er zijn echter maar weinig studies die de chemische kenmerken hebben onderzocht van de verbindingen die deze activiteit zouden kunnen bezitten. In die weinige studies werd over het algemeen vastgesteld dat de organische fracties met een lage polariteit verantwoordelijk zijn voor het apoptotische effect op de cellijnen, hetgeen overeenkomt met de in deze studie verkregen resultaten .

Het is niet bekend of de verbindingen in HFBa verantwoordelijk zijn voor de inductie van apoptose, maar het kan niet worden toegeschreven aan één verbinding zoals bonediol, dat weliswaar in het extract aanwezig is, maar hoge concentraties nodig heeft om apoptose te induceren (gegevens niet aangetoond), in tegenstelling tot HFBa, dat DNA-fragmentatie induceert bij 10 μg/mL. In verband met het bovenstaande melden wij, naast bonediol, de aanwezigheid van dodecaanzuur en een stigmasterolderivaat als bestanddelen van HFBa. Deze verbindingen zijn in verband gebracht met de cytotoxische activiteit die is waargenomen bij de hexaanfractie van Crocus sativus. Voorts hebben sommige auteurs aangetoond dat derivaten van stigmasterol significante cytotoxische activiteit vertoonden in kankercellijnen die afhankelijk waren van apoptose . Met name spinasterol (stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol) heeft een verminderde incidentie van huidtumoren in vivo aangetoond. In feite verschillen spinasterol en het in deze studie gerapporteerde derivaat in dubbele enlace op positie 22 in spinasterol en positie 16 voor het stigmasterol-derivaat. Misschien kan stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol bijdragen aan de cytotoxische activiteit die in deze studie is waargenomen. Bovendien is bekend dat lanostanen een groep van tetracyclische triterpenoïden zijn, afgeleid van lanosterol, die meerdere activiteiten hebben tegen kankercellen, waaronder de inductie van apoptose. Mogelijk hebben de verbindingen van het lanostaan- en stigmasterol-type waarvan melding wordt gemaakt in de actieve hexaanfractie een zekere mate van cytotoxische activiteit en een effect van het induceren van apoptose. Het is waarschijnlijk dat verschillende verbindingen aanwezig in de hexaanfractie synergetisch werken om cytotoxiciteit en apoptose te induceren.

3.5. Analyse van de activiteit van Caspases

Om te weten of het mechanisme van de activering van DNA-fragmentatie werd geïnduceerd door de activering van apoptose via de intrinsieke of extrinsieke route, evalueerden we de activiteit van caspases die kenmerkend is voor elk van beide. De incubatieperioden waren 2, 4, 6 en 12 uur om een activeringsprofiel te verkrijgen. Caspase 8 werd geactiveerd na 6 uur behandeling met 50 μg/mL HFBa; de toename was driemaal zo groot als bij controlecellen zonder behandeling (negatieve controle) (figuur 3). Er werd geen toename waargenomen in de activering van caspase 8 in de 2, 4, en 12 uur incubatieperiodes. Caspase 9 werd niet geactiveerd in KB-cellen na behandeling met 50 μg/mL HFBa gedurende 2-12 uur, wat wijst op een gebrek aan activering van apoptose door de intrinsieke route (figuur 4). Caspase 3 activiteit verviervoudigde in vergelijking met die van de controle in HFBa-behandelde cellen, wat in overeenstemming is met caspase 8 activering (figuur 5). De toename van de activiteit van caspase 8 is typerend voor de activering van apoptose door de extrinsieke route, die op zijn beurt andere procaspasen activeert, waaronder caspase 3, dat op zijn beurt leidt tot de afbraak van nucleaire eiwitten zoals laminine A, fodrine, actine en gelsolin. Het leidt ook tot het vrijkomen van de caspase-geactiveerde DNase-eiwitinhibitor (ICAD), waardoor deze wordt omgezet in het enzym caspase-geactiveerd DNase (CAD), dat DNA-afbraak tot doel heeft, zoals afgebeeld in figuur 2. Aangezien caspase 9 niet geactiveerd werd, concluderen wij dat B. albiflora apoptose induceert via de extrinsieke weg. Dit bewijst het grote potentieel dat deze fractie bezit als alternatieve of aanvullende therapie bij de behandeling van kanker. In de literatuur zijn verschillende studies te vinden over plantenextracten en hun effecten op de inductie van de intrinsieke apoptoseweg. Weinig studies hebben echter de activering van de extrinsieke apoptoseweg door plantenextracten aangetoond; zo induceert het methanol-extract van Paeonia suffruticosa apoptose in de menselijke maagkankercellijn (AG3) , en extract van de paardenbloemwortel kan apoptose induceren in de chronische myelomonocytische leukemie-cellijn (CMML) en in geneesmiddelresistente melanoomcellen . Het is niet bekend welke van de verbindingen die aanwezig zijn in de actieve fractie van B. albiflora de activering van de extrinsieke weg van apoptose kunnen veroorzaken. Hoe dan ook, er zijn meldingen van de inductie van apoptose door activering van extrinsieke signalering, gemedieerd door natuurlijke en synthetische triterpenoïden. Bovendien induceert de lanostaan-type triterpenoïde, polyporenic zuur C geïsoleerd uit Poriacocos, caspase-8-gemedieerde apoptose in menselijke longkanker . Met name van β-sitosterol (structurele isomeer van stigmasterol) is aangetoond dat het apoptose induceert door activering van de extrinsieke route, waarbij het Fas-signaal in menselijke borstkankercellen wordt geactiveerd. Dit zou kunnen suggereren dat zowel de triterpeen- als de sterolcomponenten van het in deze studie gebruikte extract een belangrijke rol zouden spelen bij de inductie van apoptose, gemedieerd door de activering van de extrinsieke route.

Figuur 3

Behandeling gedurende zes uur met Bonellia macrocarpa hexaanfractie induceerde caspase 8 activering. De behandelingen waren de volgende: DMSO (0,05%), controle (geen behandeling), etoposide (50 μg/mL), en HFBa (50 μg/mL). Elk symbool is het gemiddelde ± SD relatieve caspase activering van drie assays, genormaliseerd met de controlegroep. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: versus DMSO en controlegroep; versus DMSO en controlegroep; versus HFBa.

Figuur 4

Behandeling gedurende 12 uur met Bonellia macrocarpa hexaanfractie induceerde geen caspase 9-activering. De behandelingen waren de volgende: DMSO (0,05%), controle (geen behandeling), etoposide (50 μg/mL), en HFBa (50 μg/mL). Elk symbool is het gemiddelde ± SD relatieve caspase activering van drie assays, genormaliseerd met de controlegroep. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: versus alle groepen.

Figuur 5

Behandeling gedurende 12 uur met Bonellia macrocarpa hexaanfractie induceerde caspase 3 activering. De behandelingen waren de volgende: DMSO (0,05%), controle (geen behandeling), etoposide (50 μg/mL), en HFBa (50 μg/mL). Elk symbool is het gemiddelde ± SD relatieve caspase activering van drie assays, genormaliseerd met de controlegroep. One-way ANOVA: , ; Tukey’s post-hoc test: versus DMSO en controlegroep; versus DMSO en controlegroep.

Voor zover wij weten, is dit de eerste keer dat is aangetoond dat het extract van een plant die in de traditionele Maya-geneeskunde wordt gebruikt, een effect heeft op apoptose. Toekomstige studies zullen gericht zijn op het standaardiseren van het extract en het evalueren daarvan met in vivo modellen. Bijkomende studies zijn nodig om de verbindingen die verantwoordelijk zijn voor de waargenomen cytotoxische activiteit en hun exacte apoptosemechanisme op te helderen.

4. Conclusies

De hexanische fractie van B. albiflora wortels oefent cytotoxische effecten uit en induceert apoptose via de extrinsieke route, wat wijst op zijn potentieel voor de behandeling van kanker. Wij stellen de volledige isolatie voor van de bestanddelen die aanwezig zijn in de hexaanfractie van B. albiflora voor evaluatie in de cytotoxische test en de inductie van apoptose, om op te helderen welke de actieve bestanddelen zijn en om het werkingsmechanisme te begrijpen.

Conflict of Interests

De auteurs verklaren dat zij geen belangenconflict hebben en geen financiële connectie met enige commerciële entiteit die in de paper wordt genoemd.

Acknowledgments

Deze paper werd ondersteund door SEP-CONACYTCB-2010-156755. De auteurs willen graag L. Torres-Tapia van de afdeling Biotechnologie van het Wetenschappelijk Onderzoekscentrum van Yucatan (CICY) bedanken voor de technische assistentie tijdens de GC-MS analyse. De auteurs zijn bovendien Dr. Glenn Jackson dankbaar voor de Engelstalige review van het paper.