Aminoglycosiden: Perspectives on Mechanisms of Action and Resistance and Strategies to Counter Resistance
STRUCTURAL BASES FOR MECHANISM OF ACTION
Het 16S rRNA van Escherichia coli is een van de rRNA-subeenheden die goed bestudeerd is, en in het bijzonder zijn de interacties van verschillende aminoglycoside-antibiotica met het 16S rRNA en hun effecten op het proces van vertaling van mRNA in polypeptide nauwkeurig onderzocht (35). Gelijkaardige rRNA structuren bestaan in andere organismen, zoals gist en Tetrahymena (33). Behandeling van rRNA met een aminoglycoside beschermt verscheidene nucleïnebasen in rRNA tegen chemische modificatie, wat impliceert dat deze moleculen hoge affiniteiten bezitten voor bepaalde plaatsen in rRNA. Deze wijze van binding werd door Noller (35) vergeleken met die van enzymremmers, die zich gewoonlijk binden aan de actieve plaatsen van enzymen en hun activiteiten verstoren. Verschillende klassen aminoglycoside-antibiotica binden zich aan verschillende plaatsen op het rRNA, afhankelijk van de structurele complementariteit tussen de twee. Van neomycine, paromomycine (Fig. 1), gentamicine en kanamycine wordt bijvoorbeeld aangenomen dat zij zich op een vergelijkbare manier aan de A-locatie op het 16S rRNA in E. coli binden en waarvan is aangetoond dat zij de basen A1408 en G1494 beschermen in chemische voetafdruk-experimenten (Fig. 2) (33). Vier basen, A1408, A1492, A1493, en G1494, in de rRNA A-site interageren met tRNA, hoewel met verschillende affiniteiten. De binding van de bovengenoemde aminoglycosiden aan de A-site in de decodeerregio (d.w.z. de plaats van codon- en anticodonherkenning) interfereert met de nauwkeurige herkenning van het cognate tRNA door het rRNA tijdens de translatie (35). Men denkt dat deze interacties ook de translocatie van tRNA van de A-site naar de peptidyl-tRNA-site (P-site) verstoren.
(A) Stereo-aanzicht van de partiële structuur van het 70S rRNA gecomplexeerd met drie tRNA-moleculen (Protein Databank code, 486D). De A-site regio op het 16S rRNA is in wit weergegeven, waar aminoacyl tRNA ‘A’ (in geel) nabij de A-site van het rRNA is gebonden. Twee andere tRNA’s, peptidyl en exit, respectievelijk “P” (in rood) en “E” (in groen), zijn ook afgebeeld. De ruggengraat van de voorlaatste stam van het 16S rRNA-molecuul en de 900-lus zijn in violet weergegeven. De bindingsplaats van paromomycine op de A-locatie is aangegeven met de witte pijl. (B) Stereo-aanzicht van de oplossing structuur van RNA A-site sjabloon gebonden door paromomycine, die ongeveer overeenkomt met de A-site regio op de 16S rRNA in het wit in paneel A. De Connolly oppervlak van de A-site RNA wordt weergegeven volgens de elektrostatische potentiaal met behulp van het MOLCAD programma (Tripos, Inc, St. Louis, Mo.), en de aminoglycoside wordt weergegeven in een bal-en-stok voorstelling. Het meest elektronegatieve potentiaal wordt weergegeven in blauw, en het meest elektropositieve potentiaal wordt weergegeven in rood op het oppervlak; alle andere kleuren tonen de potentiëlen tussen blauw en rood. De pijl in het wit toont de knik gegenereerd door A1492, die geen basis-paar partner heeft. De pijl in geel toont de zak die wordt gegenereerd door het A1408 – A1493 basenpaar en A1492. De pijl in rood toont de plaats van de 3-amine op ring II, de plaats voor acetylering door AAC(3).
Puglisi en medewerkers (12-14, 39) hebben onlangs structureel bewijs geleverd voor de wijze van interactie van paromomycine, een representatief aminoglycoside van de neomycine klasse, met een 27-nucleotide RNA sjabloon dat was ontworpen om de A-site regio van het 16S rRNA in E. coli na te bootsen (Fig.3A). Het ontwerp van het RNA-sjabloon was gebaseerd op eerdere kennis dat paromomycine interageert met het C1407 – G1494 basenpaar, A1408, A1493, en U1495 en dat deze basen absoluut noodzakelijk zijn voor binding met hoge affiniteit (39) (grijs weergegeven in Fig. 3A). Bijkomende structurele kenmerken, zoals de zak die ontstaat door de asymmetrie in de interne lusregio als gevolg van de aanwezigheid van A1492 en het basenpaar C1409 – G1491 in de onderste stengelregio, zijn ook belangrijk. Deze structurele kenmerken creëren tezamen een zak die optimaal is voor de binding van paromomycine (zie hieronder).
(A) Model van de A-site RNA template gebruikt om de interacties van paromomycine te bestuderen. Het vak vertegenwoordigt het gedeelte van het rRNA dat homoloog is aan de A-site. (B) RNA aptameer sjabloon gebruikt om de interacties van tobramycine te bestuderen.
In de natieve A-site RNA sjabloon, de stam heeft base-pairing interacties op U1406 – U1495 (niet-canonieke) en C1407 – G1494 (Fig 3A). Na binding van paromomycine wordt de afzonderlijke structuur die gevormd wordt door A1408, A1492 en A1493 gestabiliseerd (fig. 2B) en vormen de basen A1408 en A1493 een nietcanoniek basenpaar (12, 39). Nucleotide A1492, dat geen basenpaarinteracties heeft, creëert een knik in de RNA-structuur, en de gecombineerde effecten van A1492 en het basenpaar A1408 – A1493 creëren een uitstulping in de A-site waar paromomycine zich bindt en de hoek van de knik verder vergroot (Fig.2B). De functionele groepen op paromomycine, zoals de hydroxyl- en aminogroepen, nemen deel aan specifieke interacties met het RNA-molecuul (zie hieronder).
De door A1492 en het A1408 – A1493 basenpaar gecreëerde holte wordt bezet door ring II van paromomycine, en deze ring stapelt zich boven de basis G1491 (aangegeven door een gele pijl in Fig. 2B) (12). Ring I van paromomycine maakt specifieke contacten met de “universeel” geconserveerde basenparen U1406 – U1495 en C1407 – G1494 in het rRNA. Het is opmerkelijk dat ring I absoluut noodzakelijk is voor de specifieke binding van aminoglycoside-antibiotica aan het rRNA. De ringen III en IV van paromomycine breiden deze interacties verder uit tot in de hoofdgroef van het rRNA. De amino- en hydroxylgroepen dragen het meest bij tot de niet-specifieke interacties van paromomycine met rRNA; het zijn dus geen sequentie-afhankelijke interacties. Een ander belangrijk punt is dat het basenpaar C1409 – G1491 de zetel verschaft voor de binding van aminoglycoside in de pocket, en een mismatch basenpaar in deze positie resulteert in het verlies van binding (12). In het algemeen binden aminoglycosiden die structurele kenmerken delen met paromomycine zich op vergelijkbare wijze aan rRNA (13). Verschillende aminoglycoside-antibiotica blijken zich echter in meer dan één conformatie aan dezelfde bindingsplaats te binden (28). In wezen moet de conformatie van het aminoglycoside dat aan RNA bindt, voldoen aan de elektronische en sterische beperkingen van de bindingsplaats. In een andere studie naar het complex van gentamicine Cla en het A-site RNA-sjabloon, vertoonden de ringen I en II van gentamicine Cla (die vergelijkbaar zijn met die van paromomycine) bindingsinteracties die vergelijkbaar zijn met die in het complex van paromomycine en het A-site RNA-sjabloon (57). Echter, ring III in gentamicine Cla interageert met de basenparen U1406 – U1495 en G1405 – C1496 in de bovenste stengelregio (Fig. 3A). Op grond van deze waarnemingen stelden Puglisi en medewerkers (57) voor dat alle aminoglycosiden die zich richten op de A-site van het 16S rRNA zich op een gemeenschappelijke manier binden, vergelijkbaar met de ringen I en II in paromomycine en gentamicine.
Hoewel de algemene structuur van het rRNA onder alle soorten in evolutionaire zin geconserveerd is, zijn er verschillen die de binding van aminoglycosiden aan het rRNA van prokaryoten specifieker maken – met ten minste een 10-voudig hogere affiniteit – dan aan dat van eukaryoten (19, 35, 38). Dit is geen groot verschil in bindingsaffiniteit en kan ten dele de toxische effecten van deze antibiotica in zoogdiersystemen verklaren. Eukaryotisch rRNA bevat een guanine op de plaats van A1408, wat resulteert in een G1408 – A1493 basenpaar. Bovendien bestaat het overeenkomstige basenpaar C1409 – G1491 niet bij eukaryoten. Deze verschillen resulteren gezamenlijk in een lagere affiniteit van aminoglycosiden voor het eukaryote rRNA (12, 19, 35, 38). Na deze verschillen te hebben geschetst, verandert de binding van aminoglycosiden aan de A-site van rRNA in prokaryoten de conformatie van de A-site en beïnvloedt de specifieke interacties van mRNA en tRNA op deze plaats, wat resulteert in onregelmatige codon-anticodon interacties. Er is een gebrek aan structurele informatie over de specifieke kenmerken van deze interacties op ribosomaal niveau (zie hieronder), maar de duidelijke en uiteindelijke consequentie is verstoring van het translatieproces.
Een andere structurele studie werd uitgevoerd naar de binding van tobramycine (Fig.1) aan een RNA-apptameer (23). De RNA aptameer die in deze studie werd gebruikt was een 26-nucleotide stam-lus RNA (Fig. 3B). Er zijn vier mismatch paren, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18, en U11 – U16, in dit RNA-apptamer die deel uitmaken van de geritste haarspeld lus. Tobramycine bindt in deze groef die gedeeltelijk wordt ingekapseld door het oppervlak van de diepe groef en de guanine basis van het residu G15 (Fig. 4). In dit complex zit ring I van tobramycine op de bodem van de diepe groef. Eén van de aminogroepen op ring II van tobramycine interageert met de fosfaatruggengraat in de diepe groef, en de andere aminogroep is blootgesteld aan het oplosmiddel. Ring III is gepositioneerd in het midden van de diepe groef, met hydroxylgroepen gericht naar de bodem van de groef. De conformatie van het hierboven beschreven RNA-aptacteerder zou vergelijkbaar zijn met die van de haarspeldlussen in tRNA en rRNA (23).
Stereo-aanzicht van het complex van tobramycine gebonden aan het RNA-aptacteerder. Het groene Connolly-oppervlak vertegenwoordigt een deel van de aminoglycoside-bindingsplaats.
De 7,5-Å-resolutie röntgenstructuur van het functionele complex vanT. thermophilus 70S rRNA dat tRNA en mRNA bevat, is nuttig om de bovenstaande discussie in perspectief te plaatsen (5). Aan de hand van deze structuur kan men zich voorstellen hoe goed de modelstudies met kleinere RNA-sjablonen, zoals de tobramycine-RNA-apptameer en het A-site-RNA met paromomycine (zie hierboven), in de volledige structuur van het rRNA zouden passen. De A-site in de 16S rRNA subeenheid van het 70S rRNA wordt gezien in de buurt van de interface van tRNA en de 50S rRNA subeenheid, in de nabijheid van het codon-anticodon paar (Fig. 2A). Bij vergelijking van de oplossing structuur van de A-site RNA sjabloon om de A-site in de X-ray structuur van 70S rRNA, de X-ray structuur bleek nauw verwant te zijn aan de paromomycine-gebonden RNA sjabloon, maar niet aan de natieve oplossing structuur van de A-site RNA sjabloon (5). Dit is intrigerend en suggereert dat misschien in de functionele vorm de uitstulping of knik nabij de basen A1492 en A1493 altijd in het 70S rRNA aanwezig is. Als dit waar is, betekent dit dat de bindingszak voor paromomycine al bestaat wanneer het 70S rRNA functioneel wordt; vandaar dat het voorbestemd is voor inhibitie door paromomycine. Dit is in tegenspraak met de bewering dat binding van paromomycine de knikhoek op de bindingsplaats vergroot. Bewijs ter ondersteuning van dit idee komt van een recente studie die suggereerde dat de affiniteiten van verschillende aminoglycosiden voor de A-site RNA template verschillend zijn, en dat het vermogen van deze antibiotica om de eiwitsynthese in vitro te remmen ook varieert (15). Gentamicine en verschillende andere verwante antibiotica hebben een wisselwerking met het A-site RNA met dissociatieconstanten (Kd) in het micromolaire bereik, maar zij remden een in vitro translatieproces, met 50% remmende concentraties in het nanomolaire bereik (15). Deze laatste bevinding werd afgeleid als het resultaat van binding van aminoglycosiden aan het intacte rRNA in het decoderingsgebied (A-site), en het verschil in binding aan intact rRNA versus die aan het A-site template RNA kan te wijten zijn aan de verschillen in conformatie van deze twee RNA’s, zoals hierboven besproken.
De A-site maakt zwakke contacten met het mRNA en tRNA, wat impliceert dat dit gebied een rol speelt bij de herkenning van het juiste tRNA via subtiele veranderingen in de vrije energie (5). De binding van aminoglycoside in de buurt van deze plaats kan het delicate proces van interacties tussen codon en anticodon beïnvloeden. Er werd ook voorgesteld dat de aanwezigheid van een aminoglycoside het complex van mRNA en tRNA op de A-site stabiliseert, wat op zijn beurt het proces van translatie beïnvloedt (5). Het is moeilijk om alle effecten van aminoglycosiden op de rRNA-structuur te vermoeden, en verdere structurele studies met de aminoglycosiden gebonden aan de complexen, zoals het 70S rRNA, zullen nuttig zijn bij het ophelderen en begrijpen van de subtiele veranderingen die leiden tot de antibiotische werking van aminoglycosiden.
Een aantal onderzoeken hebben synthetische sondes gebruikt om de interacties tussen RNA-sjablonen en aminoglycosiden te begrijpen. Er is gesuggereerd dat aminoglycosiden zich binden aan meer dan één doelplaats in het ribozyme (6, 30). Onlangs werden verschillende aminoglycoside antibiotica zoals neomycine B, tobramycine, en kanamycine A symmetrisch of asymmetrisch gedimeriseerd door een “tether” te gebruiken, en hun bindingsaffiniteiten werden vergeleken met die van de monomere aminoglycosiden (30). Er werd gesuggereerd dat als er meerdere bindingsplaatsen op het RNA waren, de gedimeriseerde aminoglycosiden met een hogere affiniteit zouden moeten binden dan het oorspronkelijke antibioticum, op voorwaarde dat er meerdere bindingsplaatsen toegankelijk zijn. Er werd inderdaad vastgesteld dat de gedimeriseerde aminoglycosiden 20- tot 1.200-maal beter binden aan het Tetrahymena-ribozym dan de oorspronkelijke aminoglycosiden. Eén verklaring voor de hogere bindingsaffiniteit zou het verhoogde aantal positief geladen aminogroepen op het gedimeriseerde aminoglycoside kunnen zijn, maar dit effect schijnt synergistisch te zijn met het entropische voordeel dat door de dimerisatie wordt verkregen (30). Het wees ook op de aanwezigheid van meerdere bindingsplaatsen met hoge affiniteit voor aminoglycoside-antibiotica in een RNA-molecule. In een andere studie werd getracht de RNA-bindende eigenschappen van paromomycine en de intercalerende gedragingen van bepaalde verbindingen zoals pyreen en thiazool oranje (48) te exploiteren. Deze strategie voorzag aminoglycosiden als een middel voor de levering van intercalerende agentia aan het RNA. Het conjugaat van paromomycine met thiazool oranje of pyreen toonde betere bindingseigenschappen aan het 27-nucleotide A-site RNA sjabloon. In feite werd de dissociatieconstante voor het paromomycine-thiazool oranje conjugaat gemeten op 46 nM, hetgeen werd gerapporteerd als de hoogste affiniteit die de rRNA A-site voor enig ligand heeft vertoond.
De structurele vereisten voor RNA binding door aminoglycosiden gaven aan dat een uitstulping in de RNA sequentie noodzakelijk is om binding van aminoglycosiden mogelijk te maken (7). Door gebruik te maken van een specifieke stam-lus afgeleide van de RNA aptameer, werd een reeks van chemische interferentie, chemische modificatie, en mutatie studies uitgevoerd om de structurele vereisten voor binding van tobramycine aan de RNA aptameer te begrijpen. Dit aminoglycoside bleek voornamelijk te interageren met de nucleïne basen in het RNA-apptameer, maar niet met de fosfaatruggengraat. De aanwezigheid van een uitstulping werd echter belangrijk geacht voor de hoge affiniteit van tobramycine in een stoichiometrische verhouding, en er werd geconcludeerd dat een uitstulping een holte creëert voor interacties tussen het aminoglycoside en de nucleïne base (7). Deze analogie kan worden toegepast op andere RNA-locaties zoals de hamerkopregio en de A-locatie, waar een holte aanwezig is als gevolg van de niet-canonieke baseparing of lussen of uitstulpingen die een geschikte plaats creëren voor de aminoglycosiden om te interageren met de anionische fosfaatgroepen en de nucleïnebasen. In deze lijn stelden Westhoff en collega’s (49) voor dat de interactie van aminoglycosiden met RNA waarschijnlijk vorm- en niet sequentiespecifiek is.
In overeenstemming met dit concept werden de elektrostatische velden in de RNA plooien beschouwd als de leidende kracht voor binding (zie hieronder). Hermann en Westhoff (20) konden de docking-bevestigingen van verschillende aminoglycoside-antibiotica in verschillende RNA-templates, zoals tobramycine-RNA-apptameren en de A-site-regio in het 16S RNA, waarvoor structurele informatie beschikbaar was, vaststellen. Op basis van deze waarnemingen werd de bindingswijze van aminoglycosiden aan de transactiverende respons-elementregio in HIV voorspeld (20). In een andere studie over RRE in HIV, de bindingsregio voor het Rev eiwit, onderzochten Cho en Rando (8) de rol van een enkele basenuitstulping en een holte voor de binding van aminoglycosiden. In overeenstemming met eerdere hypothesen werd afgeleid dat groeven in de niet-duplex regio’s van RNA belangrijk zijn voor de hoge affiniteit binding van aminoglycosiden aan RNA. In dit geval had de uitpuiling met één enkele base geen invloed op de binding, maar de holte, een G-rijke regio bestaande uit twee niet-canonieke basenparen en één enkele uitpuilende U, heeft een hoge affiniteit voor aminoglycosiden. Knoeien met de holte verminderde de affiniteit van het RRE RNA voor aminoglycosiden, wat erop wijst dat de nietcanonieke basenpaar-bevattende uitstulpingen de primaire aminoglycoside-bindende plaatsen in dit RNA-sjabloon zijn (8).