Splicing, capping, en polyadenylation zijn drie belangrijke stappen in de verwerking van pre-messenger RNA (pre-mRNA) tot mRNA . Polyadenylatie (poly(A)) omvat endonucleolytische splitsing van pre-mRNA en toevoeging van de poly(A) staart aan de splitsingsplaats . Individueel pre-mRNA bevat gewoonlijk een paar splitsings-/polyadenyleringsplaatsen (C/P) (polyA-plaatsen of pA) . Alternatieve polyadenylatie (APA) kan uiteindelijk verschillende mRNA polyadenylatie isovormen produceren.

Volgens de huidige inzichten is APA een veelomvattend proces dat tot stand komt via coördinerende acties van verschillende kleine moleculen. De 3′-verwerkingsfactoren zijn de belangrijkste doelwitten van de APA-regulering. Typische APA verwerking omvat de volgende stappen: (1) CFIm (splijtingsfactor I) bindt aan het UGUA-veld van het pre-mRNA stroomopwaarts van de pA-locatie en trekt CPSF (splijtings- en polyadenyleringsspecificiteitsfactor) en CSTF (splijtingsstimulatiefactor) aan om zich aan het einde van RNA-polymerase II te verzamelen; (2) naarmate RNA-polymerase II voortschrijdt, bindt CPSF zich aan de pA-signaalsequentie (bv. AAUAAA) en wordt CSTF overgebracht naar de nieuwe mRNA-precursor, waarbij het zich bindt aan de GU- of U-rijke sequentie; (3) CPSF en CSTF initiëren de splitsing van ~ 35 nucleosiden na de pA-signaalsequentie, en polyadenylatiebindend eiwit (PABPN1) in de kern bindt zich aan de polyadenylatiestaartsequentie om het PAP-proces te beginnen; (4) terwijl de PAP-gemedieerde polyadenylering voortgaat, worden adenosinestaarten van~ 50-250 nucleotiden (nt) gemaakt (afhankelijk van de soort organisme) en CPSF maakt zich los van zijn bindingssequentie; (5) PABPN1 werkt als een moleculaire heerser tijdens deze APA-progressie, die bepaalt wanneer het polyadenyleringsproces moet stoppen; (6) PAP begint zich los te maken, hoewel PABPN1 zijn bindingsstatus blijft behouden. De combinatie van bovenstaande 6 stappen in combinatie met het 5′-klap proces bevordert mRNA-rijping en uiteindelijke export van kern naar cytoplasma.

Approximately 50 ~ 80% van zoogdieren pre-mRNA transcripten hebben meer dan een pA sites . De 3′-UTR van mRNA herbergt belangrijke RNA-regulerende elementen die bepalen wanneer, waar, en hoeveel mRNA transcript zal worden vertaald . APA is een cruciaal 3′-UTR post-transcriptioneel regulatiemechanisme. De 3′-UTR APA isovormen spelen verschillende rollen in het bepalen van de mRNA stabiliteit, lokalisatie, halfwaardetijd, en functies. Bovendien hebben eerdere studies aangetoond dat APA betrokken is bij ziekteprogressie en gevoeligheid voor geneesmiddelen, vooral voor geneesmiddelen die gericht zijn op chromatine modifiers. Hoewel APA-onderzoek zich nog in een vroeg stadium bevindt, maakt zijn unieke post-transcriptionele regulerende werking het potentieel tot zowel een biomarker voor kankerprognose en -diagnose, als een doelwit voor de ontwikkeling van nieuwe doeltherapieën.

Hoe APA pre-mRNA moduleert

Gebaseerd op de locaties van pA’s, kan APA worden ingedeeld in twee hoofdcategorieën: UTR-APA (fig. 1a) en coderende regio-APA (CR-APA) (fig. 1b-d). Voor CR-APA bevinden alternatieve pAs zich in exonen of intronen. Daarom beïnvloedt CR-APA coderende regio’s via alternatieve splicing (AS), wat leidt tot het ontstaan van eiwit-isovormen met verschillende C-termini. Voor UTR-APA worden alternatieve pAs gelokaliseerd in het 3′-UTR, wat leidt tot transcriptieproducten met hetzelfde coderingsframe maar variabele 3′-UTRs. Eerdere studies suggereerden dat globale UTR-APA-gebeurtenissen weefselspecifiek zijn, waarbij3′-UTR verkorting positief correleert met celproliferatie en negatief met celdifferentiatie .

Het 3′-processing complex van het pre-mRNA wordt gevormd door verschillende elementen, waaronder de canonieke poly(A)-signaalsequentie AAUAAA of nauwe varianten daarvan (bv.b.v. AAAUAA, AUAAAA, AUUAAA, AUAAAU, AUAAAG, CAAUAA, UAAUAA, AUAAAC, AAAAUA, AAAAAA, AAAAAG), die met variërende frequenties in het genoom worden gebruikt, gewoonlijk binnen 15-50 nts van de pA site . UGUA-elementen bevinden zich vaak stroomopwaarts van de pA-site, U-rijke elementen bevinden zich dicht bij de pA-site, en U/GU-rijke elementen bevinden zich ~ 100 nts stroomafwaarts van de pA-site. Echter, ~ 20% van de menselijke poly(A) signalen zijn niet omgeven door U-/GU-rijke regio’s.

Van de 80 kernfactoren in zoogdiercellen zijn er ongeveer 20 betrokken bij de C/P-machinerie. In het algemeen kunnen deze kernfactoren als volgt in vier elementen worden onderverdeeld (fig. 2):

CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) bestaat uit CPSF1-CPSF4 (ook bekend als CPSF160, CPSF100, CPSF73 en CPSF30), WDR33 en FIP1L1 (ook bekend als Fip1) . Volgens de huidige inzichten is er een directe interactie tussen WDR33 en CPSF4 en pAs, en voert CPSF3 de endonucleolytische splitsing uit. Werkend als een complex herkent CPSF de polyadenyleringssignaalsequentie AAUAAA en klieft het pre-mRNA. Dit zorgt voor sequentiespecificiteit die een belangrijke rol kan spelen bij de regulering van de pA-locatieselectie, de genexpressie, de migratie van kankercellen, metastase en uiteindelijk de uitkomst van de ziekte. Als onderdeel van het CPSF complex is CPSF73 een endonuclease die het pre-mRNA op de pA plaats splitst. Echter, onder oxidatieve stress transloceert CPSF73 van de kern naar het cytosol en veroorzaakt een significante remming van de polyadenylatie activiteit in prostaatkankers. Verder is Fip1, een lid van het CPSF complex, mogelijk een regulator van cellulaire zelf-vernieuwing. Inderdaad, Fip1 depletie in muis embryonale stamcellen (ESCs) resulteert in verlies van cellulaire ongedifferentieerde staten en zelfvernieuwing mogelijkheden als gevolg van het gebruik van de voorkeur distale poly (A) site (dpA), uiteindelijk leidend tot 3′-UTR verlenging van geselecteerde genen die het lot van de cel bepalen .

CSTF (cleavage stimulation factor) is samengesteld uit CSTF1, CSTF2, en CSTF3 (50 kDa, 64 kDa, en 77 kDa, respectievelijk), en speelt een sleutelrol in de cleavage reactie . Het CSTF-complex kan zich binden aan het U- of GU-rijke veld stroomafwaarts van de splitsingsplaats om de splitsing te stimuleren. Bijvoorbeeld, CSTF2, ook bekend als CSTF64, heeft een directe interactie met het U/GU-rijke gebied om de 3′-terminale verwerkingsefficiëntie te moduleren. Sommige studies meldden dat CSTF niet alleen het gebruik van pA’s bevordert, maar ook de celproliferatie beïnvloedt en mogelijk als biomarker van kankerinvasie en -prognose fungeert. CSTF64 fungeert als een essentiële polyadenyleringsfactor en een meester-regulator van 3′-UTR verkorting in meerdere tumortypes. De expressie van CSTF64 bleek geassocieerd te zijn met een slechte prognose van longkanker en overexpressie van CSTF64 bevorderde de proliferatie en invasie van longkankercellen.

CFI en CFII (splitsingsfactoren I en II) bestaan uit CFIm25 (ook bekend als NUDT21/nudix hydrolase 21/CPSF5), CFIm59 en CFIm68, die zich alle upstream van het geconserveerde UGUA motief binden om de splitsingsreactie te mediëren. Binding van CFIm kan fungeren als een primaire determinant van pA-locaties door een hele pA-regio in een lus te leggen en zo de selectie van een APA-locatie te induceren. Andere eiwitten, waaronder symplekin, poly(A)-polymerase (PAP) en poly(A)-bindend eiwit (PAB), kunnen ook de selectie van APA-locaties reguleren. PAB’s (PABII, RBBP6, PABPN1) binden zich aan de groeiende poly(A)-staart en verhinderen de interactie tussen CPSF en het poly(A)-polymeerase. Deze activiteiten treden vooral op wanneer de staart ~ 250 nts is en het doel daarvan is de lengte van de poly(A)-staart te controleren terwijl APA in progressie is.

De factoren die betrokken zijn bij de C/P-machinerie nemen gewoonlijk deel aan de regulering van APA. Onder hen is CFIm25 geïdentificeerd als de belangrijkste mondiale regulator van APA, waarvan knockdown niet alleen een mondiale schakelaar induceert voor het gebruik van proximale poly(A) signalen, maar ook de doelgenstabiliteit en expressie verbetert. Huang et al. rapporteerden dat CFIm25 depletie de transcriptie niveaus van CCND1 en GSK3β significant verhoogt, en bovendien het gebruik van dPAS door verschillende oncogenen (IGF1R, CCND1, en GSK3β) vermindert. Bovendien toonden gen ontologie analyses (GO) aan dat CFIm25 niet alleen APA moduleert via MAPK signaalwegen, maar ook verbonden is met kanker-geassocieerde signaalwegen en eiwit ubiquitinatie signaalwegen. Bovendien leidt depletie van CFIm25 en CFIm68, maar niet CFIm59, tot proximale polyadenyleringsplaats selectie in HEK293 cellen. Xia et al. meldden echter dat er geen verschillen in expressie van CFIm25 zijn tussen tumorweefsel en gezond weefsel. Kubo et al. meldden ook dat CFIm mogelijk geen rol speelt bij poly(A) site selectie . Bovendien toonden Takagaki et al. aan dat CSTF64 de eerste factor is in APA 3′-end verwerking en dat IgM gebruik kan maken van APA om B-cellen in muizen te activeren. Hoewel blijkt dat CFIm een sleutelrol speelt in de regulering van APA, blijft de precieze rol ervan nog onduidelijk.

RNA-bindende eiwitten (RBP’s) kunnen ook van invloed zijn op het vermogen van APA om mRNA’s te targetten door te concurreren met of de binding te versterken van polyadenylatiemachineproteïnen aan hun doelplaatsen . Xiang et al. analyseerden de globale APA-profielen uit een grote database over verschillende kankertypes en suggereerden dat PABPN1 de hoofdregulator is van APA-profilering over verschillende kankertypes. Een CTRP dataset toonde aan dat PABPN1 expressie statistisch gecorreleerd is met de gevoeligheid voor 31 geneesmiddelen. RBPs kunnen alleen werken om de binding van andere APA-factoren aan de proximale poly(A)-sites te verhinderen of de APA-selectie beïnvloeden door hun rol in het behoud van de RNA-stabiliteit. Bovendien kunnen RBPs het dynamische APA-profiel reguleren en de overgang van mitose naar meiose bevorderen.

Hoe APA wordt gereguleerd

APA is een zeer uitgebreid moleculair biologisch proces, waarbij talrijke cellulaire elementen betrokken zijn. Momenteel weten we nog steeds niet veel over dit unieke biologische proces. De situatie is echter snel verbeterd in een zeer korte periode nadat de wetenschappelijke gemeenschap het belang van APA in de celbiologie en zijn potentiële rol als nieuw kankertherapeutisch doelwit ontdekte. APA is een dynamisch en spatiotemporeel gecoördineerd proces van talrijke kernfactoren. CFIm bijvoorbeeld kan zich binden aan de specifieke RNA-sequentie in een pre-mRNA en rekruteert vervolgens de kernfactor CPSF door zijn interactie met een CPSF-subeenheid, hFip15 . CSTF-64 kan interageren met CPSF73, maar niet met CFIm25. Er werd geconstateerd dat zowel CSTF64- als CPSF73-niveaus verhoogd zijn in de cellen die naar het gezonde weefsel migreren, maar niet voor het CFIm25-niveau. CFIm is betrokken bij de eerste stap van pre-mRNA 3′-processing complexe assemblage door afwisselend stimuleren of onderdrukken splitsing en poly (A) toevoeging, afhankelijk van de niveaus van zijn eigen of andere kernfactoren, en de RNA-sequentie rond de potentiële splitsingsplaatsen.

Naast de kernfactoren, een verscheidenheid van fysiologische omstandigheden ook deelnemen aan APA regeling, zoals de lokale chromatine structuur, nucleosoom positionering, DNA-methylering, en histon-modificaties. Interessant is dat sommige factoren die deelnemen aan de 5′-terminale aftopping ook de efficiëntie van zowel splitsing als polyadenylering kunnen beïnvloeden.

Overigens kan APA op transcriptieniveau worden gereguleerd. De transcriptie machinerie, zoals transcriptie initiatie, progressie, en splicing, is waarschijnlijk van invloed op de efficiëntie en specificiteit van polyadenylering . Daarom zal het onderzoeken van het verband tussen de specifieke sequentie-elementen in het promotorgebied en de poly(A) site selectie ons enorm helpen bij het blootleggen van het mechanisme achter dit interessante fenomeen, dat mogelijk kan helpen bij het ontwikkelen van een nieuwe kankertherapie strategie .

Hoe APA methodologisch wordt geanalyseerd

Sinds de effecten van pA’s in IgM en dihydrofolaat reductase (DHFR) gencodering werden waargenomen in 1980, zijn een reeks strikte onderzoeksmethoden en strategieën ontwikkeld om APA te identificeren en te bestuderen, zoals de Poly(A)-ClickSeq next-generation sequencing (NGS) technologie . Met de steun van deze nieuwe methodologieën, vooral met de vooruitgang van NGS-technologie en de snelle accumulatie van sequencing-gegevens van die genexpressievarianten, breiden de experimenteel bepaalde genetische pA-databases zich voortdurend uit.

Gebaseerd op 3′-verrijkte RNA-seq protocollen, kunnen APA-analysemethoden voornamelijk worden ingedeeld in twee categorieën: oligo (dT) priming-gebaseerde methoden en RNA manipulatie-gebaseerde methoden. Omdat de enige leest in kaart gebracht om de 3 ‘-termini van het mRNA zijn nuttig voor APA ontdekking, het aantal gelezen beperkt deze methoden. Als de gelezen dekking van de 5′- en 3′-termini zijn laag, zal RNA-seq niet geschikt voor het identificeren van pA’s precies en uitgebreid. Bovendien is een andere uitdaging is het oplossen van de gelezen mapping ambiguïteit als gevolg van isovorm transcripten overlap. Hoewel het lezen lengte beperking, zijn een reeks van RNA-seq algoritmen ontwikkeld om relatieve veranderingen in 3 ‘-UTR lengte kwantificeren, dus om APA gebeurtenissen te voorspellen. Verschillende pA detectie en APA analytische methoden en algoritmen ook zijn ontwikkeld in de afgelopen jaren, zoals Dynamische Analyses van Alternatieve PolyA Adenylatie (DaPars), 3USS, MISO, Roar, QAPA, en Change Points . Een 2019 review door Gruber en Zavolaneloquently vergeleek deze methoden .

DaPars is de meest populaire data-analyse methode onder hen, hoewel QAPA is efficiënter en gevoeliger . DaPars identificeert distale pA’s op basis van RNA-seq gegevens, en gebruikt vervolgens een regressiemodel om de novo identificatie en kwantificering van dynamische APA-gebeurtenissen tussen twee condities uit te voeren, ongeacht een voorafgaande APA-annotatie. De waarschijnlijkheid van het opleveren van sequenced leest is verenigd onder de individuele isovormen. De pA’s aanwezig zijn op posities langs gen locaties die een duidelijke daling vertonen in RNA-seq gelezen dekking. Na correctie van de potentiële RNA-seq niet-uniformiteit bias langs het gen lichaam, kan de exacte locatie van proximale APA site worden geïdentificeerd, en de statistisch significante dynamische APA’s en hun activiteiten dan zullen worden gedetecteerd. De belangrijkste methodologische innovatie van DaPars is de directe gevolgtrekking van de novo APA-gebeurtenissen uit bestaande RNA-seq gegevens zonder afhankelijk te zijn van extra experimenten. Een ander voordeel van DaPars is dat het de overlapping van naburige genen kan oplossen die vals-positieve resultaten kan geven door de cutoffs te verhogen. Echter, als gevolg van niet-uniforme gelezen dekking langs loci, deze methode beperkt de nauwkeurigheid van de novo poly (A) site detectie door het verhogen van de vals-positief tarief.

QAPA kwantitatief afleidt APA van conventionele RNA-seq gegevens door directe schatting van de absolute alternatieve 3′-UTR isovorm expressie. Het berekent vervolgens de relatieve expressie van elke isovorm onder alle isovormen om APA te beoordelen. De beperking van QAPA is dat vooraf gedefinieerde pA’s nodig zijn. Dit probleem kan echter worden ondervangen door het genereren van een uitgebreide bron van geannoteerde pAs die gegevens van 3′-UTR RNA-seq en andere bronnen op te nemen. Door het lezen van de dekking biases op de 3′-terminus van transcripten, slechte opbrengsten van niet-getempleerde poly (A) staart-bevattende leest, en ambiguïteit van gelezen mapping in overlappende transcript isovormen, de methoden op basis van canonieke RNA-seq gegevens zijn beperkt, terwijl het proberen om precies in kaart brengen van de pAs. Met de vooruitgang van de moleculaire technologie zijn de methoden om APA te bestuderen echter voortdurend gegroeid. Wang et al. gebruikten CRISPR/Cas9-methodologie om de biologische functie van APA te bestuderen via het bewerken van het zwakke poly(A)-signaal tot een canoniek poly(A)-signaal en het richten van de signalen op specifieke poly(A)-sites .

Kortom, elk van de huidige beschikbare APA-analysemethoden heeft zijn voordelen en beperkingen. De analytische strategieën op basis van canonieke RNA-seq gegevens worden het meest gebruikt binnen de APA-onderzoeksgemeenschap.

Single-cel niveau studie Het voordeel van single-cel benadering is dat het de achtergrondruis van bulk cellen die een mengsel van RNA-materiaal afkomstig van cellen uit verschillende weefsels of differentiaties bevatten aanzienlijk kan verminderen.

Met de ontwikkeling van single-cel analyse technologie, APA variaties tussen de cellen is onlangs onderzocht. Hoewel single-cel APA-onderzoek zelden op grote schaal is uitgevoerd, werkt deze techniek op hoge diepte en full-length van single-cell RNA-seq (scRNA-seq), waardoor het een mogelijk instrument is om APA nauwkeurig te analyseren. Jingle Bells en scRNA-SeqDB (https://bioinfo.uth.edu/scrnaseqdb/) gebruik gemaakt van scRNA-seq datasets om een verscheidenheid van kankertypes te onderzoeken . Ye et al. meldden het gebruik van scRNA-seq gegevens om dynamische APA gebruiksvariaties te onderzoeken in verschillende beenmerg mononucleaire celtypen uit een grote monstercollectie die zowel gezonde controles als AML patiënten bevatte. Zij ontdekten dat, in vergelijking met gezonde personen, AML patiënten een lagere APA diversiteit blijken te hebben onder acht verschillende celtypes. Zij onthulden verder een uitgebreide betrokkenheid van APA-regulatie in erytropoëse tijdens leukemieprogressie op het niveau van één cel. Door 515 scRNA-seq datasets van 11 borstkankerpatiënten te analyseren, meldden Kim et al. dat celtype-specifiek APA op celniveau kan worden geïdentificeerd op basis van 3′-UTR lengtevariatie in combinatie met genexpressieniveau en APA-patronen. Bovendien toonden zij aan dat immuun-specifieke APA-handtekeningen in borstkanker mogelijk kunnen worden gebruikt als een prognostische marker voor borstkankers in een vroeg stadium.

APA en alternatieve splicing: Hoewel er aanzienlijke verschillen zijn tussen APA en alternatieve splicing (AS), kunnen zowel APA als AS verschillende isovormen genereren, zelfs met elkaar interageren tijdens het pre-mRNA proces. Bovendien, terwijl APA vier typische isovormen heeft, heeft AS er zes (Fig. 2). Verscheidene diepgaande analyses van transcriptomische gegevens van diverse menselijke weefsels en cellijnen onthulden een sterke correlatie tussen APA en AS. Als de pA zich binnen het terminale exon bevindt, kan het APA zich gedragen als een speciaal type van AS, genaamd CR-APA, dat geen in-frame stopcodon of 3′-UTR kan bezitten en waarschijnlijk snel wordt afgebroken door het non-stop code gemedieerde mRNA verval proces (Fig. 1b) . Shen et al. meldden dat APA en de splicing factor SRSF3 samenwerkten om het cel-verouderingsproces te moduleren. Terwijl APA een rol kan spelen in sommige splicing factor-gemedieerde AS, kunnen splicing factoren ook samenwerken met APA elementen om te helpen bij dit proces. Bijvoorbeeld, U2AF2 en RBP’s zijn in staat tot interactie en het rekruteren van CFI om 3′-terminusvorming in de buurt van de polypyrimidine tracten te vergemakkelijken. Verder kan CPSF complex interageren met splicing factor TFIID (transcriptiefactor II D) in het reguleren van RNA polymerase II . Er is ook waargenomen dat U1 snRNP (small nuclear ribonucleoprotein) kan werken binnen introns door voortijdige splitsing en polyadenylering te onderdrukken. U1 depletie leidt ook tot de activering van intron poly(A) signalen en veroorzaakt genoom-breed APA.

AS en APA concurreren ook met elkaar terwijl in CR-APA. Bijvoorbeeld, de ablatie van de splicing factor 3B subunit1 (een component van U2 snRNP, ook wel SF3b1 genoemd) kan het intron PAS activeren. U1 snRNP kan ook onafhankelijk APA splicing activiteiten beïnvloeden. Aangezien U1 snRNP zich kan binden aan het 5′-terminale gebied van het transcript en potentiële herkenning door splitsingsfactoren kan blokkeren, verhoogt U1 snRNP knockdown het gebruik van de pA sites binnen introns dicht bij dat transcriptgebied . Movassat et al. toonden echter aan dat de associatie tussen APA en AS beperkt is tot terminale introns. Zij toonden ook aan dat CstF64 knockdown indirect de AS van hnRNP A2/B1 kan beïnvloeden, maar niet APA, in HeLa-cellen.

Hoe APA de celcyclus reguleert

Er zijn veel genen, waaronder TP53, CDC6 (celdelingscyclus 6), CyclinD1 (CCND1), en CDK (cycline-afhankelijk kinase), zijn geassocieerd met celcyclus-checkpoints en reguleren de voortgang van de celcyclus. Aangezien pre-mRNA gewoonlijk meer dan één pA-plaats heeft, worden de voor de celcyclus relevante genproducten gemoduleerd door het APA-mechanisme en ontstaan er verschillende isomeren. 3′-UTR verkorting van CDC6, een belangrijke regulator van DNA replicatie, is gekoppeld aan hogere CDC6 eiwitniveaus en verhoogde S-fase entry in borstkankercellen. Cyclin D1, dat een cruciale rol speelt in het bevorderen van de G1-S fase overgang in vele celtypes, is onderhevig aan APA regulatie via zowel UTR-APA als CR-APA mechanismen. Bovendien onderzochten Xiang et al. de top 10% van alle 20.532 genen die geassocieerd zijn met APA-gebeurtenissen en stelden vast dat de meeste van deze genen deelnemen aan chromatinestructuur-gerelateerde activiteiten, wat een relatie suggereert tussen APA-verwerking en chromatinestructuurmodificatie . Mitra et al. vonden dat APA fungeert als een schakel tussen celcyclus en weefselmigratie door analyse van muizen huid excisie wonden . Zij toonden aan dat prolifererende cellen grenzend aan wonden hogere niveaus van APA factoren tot expressie brengen dan rustende fibroblasten in ongewonden huid. PIGN, dat de celcyclus regelt door interactie met de spindel assemblage checkpoint eiwitten, bleek 6 pA sites te bevatten in zijn 3′-UTR (Fig. 3) .

Hoe APA interageert met miRNA in post-transcriptionele modulatie

Meer dan 50% van geconserveerde microRNA’s (miRNA’s) richten zich op plaatsen die zich stroomafwaarts van proximale pA’s in zoogdiergenen bevinden. Als gevolg hiervan speelt de UTR-APA een sleutelrol in het reguleren van de interactie tussen transcripten en miRNAs. APA is recent geïdentificeerd als een wijdverspreid mechanisme dat genstabiliteit en expressie controleert. De miRNA targeting sites bevinden zich meestal in het 3′-UTR. De transcripten met kortere 3′-UTR lengtes zijn meestal stabieler door het verlies van targeting sites voor miRNAs. Eerder werd aangetoond dat APA een cruciaal reguleringsmechanisme is in verschillende kankertypes, zoals glioblastoma tumor, hepatocellulair carcinoom, prostaatkanker, en borstkanker. Gruber et al. rapporteerden echter dat 3′-UTR verkorting slechts een beperkte invloed heeft op de proliferatie van murine en humane T-lymfocyten. Zij toonden ook aan dat niet elke APA gebeurtenis verband houdt met hogere eiwitniveaus . Verschillende studies hebben gerapporteerd dat de effecten van APA op de mRNA-stabiliteit en de ribosoombelasting marginaal zijn, afhankelijk van de celtype-specifieke miRNA-expressie en de beschikbaarheid van RNA-bindende eiwitten. Een typisch voorbeeld is de regulering van PAX3-genexpressie. PAX3 is een belangrijke regulator van myogene differentiatie, waarvan het transcript een miR-206 doelplaats heeft in de 3′-UTR. De PAX3-isovormen vertonen echter verschillende differentiatiepatronen in verschillende spiertypes.

APA kan ook miRNA-doelen moduleren die zich in introns bevinden. Het ZFR-gen is het doelwit van zijn intronic miRNA (miR-579) in de U87-cellijn. Hinske et al. meldden ook dat het APA-signaal een rol speelt bij het leveren van miRNA negatieve feedback aan het ZFP-gen.

APA beïnvloedt de genexpressie niet alleen door het 3′-UTR in te korten om de miRNA-doelsites te verwijderen, maar ook via andere moleculaire mechanismen. Masamha et al. rapporteerden dat CFIm25 en miR-23 onafhankelijk waren in het onderdrukken van de expressie van een van de 3′-UTRs van de glutaminase isovormen. Daarom, hoewel mRNA ontsnapt aan miRNA onderdrukking via verkorting van 3′-UTR om miRNA doelsite te verwijderen (een canoniek APA mechanisme), bestaan er ook andere APA en miRNA interactie mechanismen naast elkaar.

Prospects

APA is relatief een nieuw biomedisch onderzoeksgebied. Hoewel we de laatste jaren een aantal mijlpalen in het APA-onderzoek hebben bereikt, moet er nog veel worden opgehelderd (Fig. 4). Het APA-onderzoek heeft zich de laatste jaren geconcentreerd op de directe werking van verschillende trans-acterende factoren. Toekomstige onderzoeken zullen zich hopelijk concentreren op de signaalregulatie van deze trans-acterende factoren op moleculair en cellulair niveau. Het is bekend dat APA een cruciale rol speelt bij de bewerking van pre-mRNA’s en het bepalen van de specificiteit en stabiliteit van de daaropvolgende mRNA-isovormen. APA neemt deel aan de modulatie van de aangeboren antivirale immuunrespons, de regulering van het ontstaan en de prognose van kanker, en de ontwikkeling van resistentie tegen geneesmiddelen. Ondertussen gedraagt APA zich verschillend per individueel gen, celtype, weefseltype, en zelfs ziekte. Inzicht in APA en zijn uitgebreide reguleringsmechanismen bij ziekten van de mens zal een nieuw terrein openen voor het nastreven van precisiegeneeskunde en gepersonaliseerde geneeskunde.