Gentherapie voor niet-geërfde aandoeningen

Er is veel vooruitgang geboekt bij de identificatie van de mechanismen die betrokken zijn bij chronische orgaanschade, wat mogelijkheden heeft geopend voor gentherapiestudies. Terwijl een overvloed aan preklinische en klinische studies in de afgelopen decennia zich heeft gericht op de ontwikkeling van gentherapie voor erfelijke aandoeningen, zijn er, ondanks verschillende preklinische studies in diermodellen, slechts enkele klinische studies ondernomen om de therapeutische werkzaamheid van gentherapie voor niet-geïnterfundeerde ziekten te onderzoeken. Een recente studie toont aan dat expressie van telomerase met behulp van AAV9-vectoren therapeutische effecten heeft in een muismodel van longfibrose. Deze therapie was gericht op idiopathische longfibrose. Het is bekend dat telomeren fungeren als beschermende structuren aan de uiteinden van chromosomen en er is aangetoond dat de aanwezigheid van korte telomeren een van de oorzaken is voor het ontstaan van ziekten. Bij deze aandoening worden de telomeren te kort, wat resulteert in de stopzetting van de celdeling, die op haar beurt leidt tot celapoptose. Telomerase is een enzym dat de lengte van de telomeren kan herstructureren, en Povedano en collega’s ontwikkelden een behandeling waarbij AAV serotype 9 wordt gebruikt om telomerase af te geven om de korte telomeren te corrigeren. Aangezien AAV9 zich bij voorkeur richt op regeneratieve alveolaire type II cellen (ATII), vertonen met AAV9-Tert behandelde muizen een verbeterde longfunctie met verminderde ontsteking en fibrose 1-3 weken na de vectorbehandeling. Het is van belang op te merken dat longfibrose verbeterde of verdween na 8 weken gentherapie. AAV9-Tert behandeling leidde tot langere telomeren en verhoogde proliferatie van ATII cellen, evenals lagere DNA schade, apoptose, en senescentie.

AAV vector-afgeleide cardiale gentherapie is in opkomst als een geheel nieuw platform om hartaandoeningen te behandelen. AAV-gentherapie voor hartfalen is gevalideerd in preklinische studies met diermodellen, en de overgrote meerderheid van deze benaderingen is ondernomen om de calciumverwerking door cardiomyocyten te verbeteren. Het therapeutische eiwit dat in de meeste van deze studies werd gebruikt was sarcoplasmatisch calcium ATPase (SERCA2a). Op basis van de positieve preklinische bevindingen werd de eerste klinische studie (CUPID trial: calcium upregulation by percutaneous administration of gene vector in cardiac disease, NCT02346422) uitgevoerd om SERCA2a toe te dienen met gebruikmaking van AAV serotype 1 vector voor de behandeling van patiënten met hartfalen in een gevorderd stadium. Het resultaat van deze fase 1-studie was succesvol zonder bijwerkingen en werd doorgezet naar fase 2a-studie, met veelbelovende resultaten en een aanzienlijk laag percentage bijwerkingen. De resultaten van de klinische studie van fase 2b (CUPID2b-studie, NCT01643330), waarbij gebruik werd gemaakt van dezelfde vector, waren echter teleurstellend: er was geen significante verandering tussen de behandelingsgroep en de placebogroep. Dit heeft geleid tot het stopzetten van de recrutering van patiënten voor twee bijkomende proeven waarbij AAV1.SERCA2a wordt gebruikt. Interessant is dat er twee nieuwe proeven op komst zijn die gericht zijn op de toediening van S100A1 met een AAV9-vector en een constitutief actieve vorm van de proteïnefosfatase-1-remmers, I1c, met een chimere capsid met AAV2- en AAV8-serotypes. Bovendien zijn AAV1, AAV6 en AAV9 naar voren gekomen als de meest veelbelovende AAV-serotypen voor cardiale genoverdracht, wat hoop biedt voor succesvolle gentherapiebenaderingen voor de behandeling van hartfalen in de toekomst.

Gentherapiebenaderingen met behulp van AAV voor de behandeling van neuropathische pijn bij knaagdieren zijn ook gerapporteerd. Fischer en collega’s hebben aangetoond dat toediening van rAAV die Ca2+ kanaal-bindend domein 3 (CBD3) gen uitdrukken, pijngedrag zoals hyperalgesie na aanraking met een speld of gevoeligheid voor acetonstimulatie in diermodellen van ontstekingspijn en neuropathische pijn aanzienlijk verminderde. Een andere studie waarbij gebruik werd gemaakt van AAV9-vectoren die codeerden voor short hairpin RNA (shRNA) tegen vanilloïde receptor 1 (TRPV1), een belangrijk doelgen voor acute pijn, toonde aan dat de therapie de door zenuwbeschadiging veroorzaakte thermische allodynie (verhoogde respons van neuronen) verminderde 10-28 dagen na behandeling in een muismodel van gespaard zenuwletsel (SNI). Deze resultaten leveren positief bewijs om gentherapie-onderzoekers aan te moedigen op AAV vectoren gebaseerde behandelingen te ontwikkelen voor patiënten met chronische/diabetische neuropathische pijn.

Er is aanzienlijke vooruitgang geboekt in de gentherapie-benadering voor de behandeling van chronische leverfibrose. Hoewel angiotensine-converterend enzym (ACE)-remmers of angiotensine-receptorblokkers (ARB’s) op grote schaal worden gebruikt als behandeling voor patiënten met hypertensie, zijn ze ook uitgeprobeerd bij patiënten met chronische leverziekte; de resultaten waren echter niet overtuigend, vooral omdat ze nadelige systemische bijwerkingen hebben. Door het gebrek aan medische behandelingen is levertransplantatie onvermijdelijk de enige optie geworden voor patiënten met leverziekten in het eindstadium, die het gevolg zijn van chronische leverfibrose en/of levercirrose. Bovendien betekenen de toenemende incidentie van chronische leverziekte, het gebrek aan donororganen, post-transplantatie complicaties, en de hoge kosten van levertransplantatie dat er een grote behoefte is aan het ontdekken en formuleren van specifieke, effectieve, veilige en goedkope nieuwe therapieën voor leverfibrose/cirrose.

Een mogelijke aanpak om dit te omzeilen is het ontwikkelen van orgaan-gerichte antifibrotische strategieën. Studies van ons laboratorium suggereerden dat een mogelijk doelwit de “alternatieve as” van het renine-angiotensine systeem (RAS) is, bestaande uit zijn sleutelenzym angiotensine-converterend enzym 2 (ACE2), dat het krachtige profibrotische octapeptide, angiotensine II (Ang II) afbreekt tot een antifibrotisch heptapeptide, angiotensine-(1-7) (Ang-(1-7)) . Uit experimentele dierstudies is gebleken dat recombinant humaan ACE2 (rhACE2) gunstig is voor de preventie van hypertensie bij hart- en vaatziekten en voor de verbetering van de nierfunctie bij diabetische nefropathie. Interessant is dat rhACE2 goed werd verdragen door een groep gezonde menselijke vrijwilligers in een fase 1 klinische studie, zonder ongewenste cardiovasculaire bijwerkingen. Er is één studie die therapeutische effecten van recombinant ACE2 rapporteerde bij experimentele leverfibrose, waarbij leverschade chirurgisch werd geïnduceerd door cholestase of door hepatotoxische injectie met tetrachloorkoolstof. Zij toonden aan dat recombinant ACE2 de leverfibrose significant verminderde in beide diermodellen van leverziekte. Een belangrijk nadeel van deze systemische aanpak is echter dat de behandeling onvermijdelijk off-target effecten heeft, die in veel gevallen ongewenst zijn. Zo zijn er verschillende nadelen verbonden aan systemische toediening van recombinant ACE2. Dit omvat dagelijkse injecties van ACE2, een procedure die invasief is in een klinische setting en een dure aanpak met ongewenst effect op de bloeddrukregulatie . Om dit probleem te omzeilen, zou een ideale aanpak zijn om de weefselspecifieke ACE2 niveaus in het doelorgaan te verhogen. Dus, orgaan-specifieke verhoogde ACE2 activiteit met behulp van een lever-specifieke recombinant AAV-vector wordt verwacht therapeutische effecten te produceren die beperkt blijven tot het doelorgaan, terwijl ongewenste off-target effecten worden geminimaliseerd.

Naast het gebruik van lever-specifieke capsid serotype, kan de specificiteit verder worden verbeterd door engineering van de vector met ACE2-gen onder de transcriptionele controle van een sterke lever-specifieke promotor, apolipoproteïne E / humaan α1-antitrypsine. Studies gepubliceerd door ons laboratorium gebruikten een pseudotype lever-specifieke AAV vector (rAAV2/8) voor preklinische evaluatie en ontdekten dat hepatische overexpressie van murine ACE2 gen toegediend aan de muizen duurde tot 6 maanden na een enkele intraperitoneale injectie . Vervolgens behandelden we muizen met een reeks leverziekte-modellen, waaronder biliaire fibrose veroorzaakt door galweg ligatie (BDL), toxische schade veroorzaakt door tetrachloorkoolstof (CCl4) injecties, en vette lever-geassocieerde leverfibrose veroorzaakt door het voeren van methionine- en choline-deficiënt (MCD) dieet met behulp van een enkele intraperitoneale injectie van rAAV2/8-ACE2 . De behandeling veroorzaakte een belangrijke toename in ACE2 expressie en eiwit activiteit, die beperkt bleef tot de lever zonder invloed op andere belangrijke organen. In tegenstelling tot erfelijke aandoeningen, bijvoorbeeld hemofilie B, waarbij een relatief laag niveau van transgene expressie in de lever voldoende kan zijn voor daaropvolgende kleine verhogingen van de FIX-niveaus in het bloed, kan de omvang van de expressie van transgenen die nodig is voor therapeutische interventie bij niet-erfelijke aandoeningen aanzienlijk hoger zijn. Dit kan op zijn beurt een uitdaging vormen voor gentherapie-onderzoekers. Interessant is echter dat we in onze lever-gerichte therapeutische benadering met rAAV2/8-ACE2 ontdekten dat verhoogde hepatische ACE2 expressie het hepatische niveau van profibrotisch Ang II met meer dan 50% verminderde in vergelijking met die behandeld met een controle vector die humaan serumalbumine droeg (rAAV2/8-HSA) . Een vermindering van Ang II, die gepaard ging met een verhoging van de leverspiegels van het antifibrotische Ang-(1-7)-peptide, resulteerde in een duidelijke vermindering van de ontstekingsbevorderende cytokine-expressie, wat leidde tot een sterke vermindering van leverfibrose in alle drie de modellen (figuur 2) . Deze studies met korte-termijn diermodellen zijn verder gevalideerd om aan te tonen dat in lange-termijn diermodellen van biliaire fibrose en vette leverziekte, die leverlaesies produceren die meer vergelijkbaar zijn met die welke worden gezien bij patiënten met dergelijke ziekten, een enkele intraperitoneale injectie van rAAV2/8-ACE2 veroorzaakte een aanzienlijke vermindering van leverfibrose (figuur 3). In duidelijke tegenstelling tot andere studies met behulp van AAV vectoren , vonden we dat rAAV2/8-ACE2 serum alanine transaminase (ALT) niveaus in zieke dieren verminderd in vergelijking met die welke de controle vector (rAAV2/8-HSA) ontvangen, wat suggereert dat de vector zelf veilig is in de lever. Bovendien veroorzaakten rAAV2/8-HSA (tot 10 dagen) of rAAV2/8-ACE2 (tot 24 weken) vectoren die in gezonde muizen werden geïnjecteerd geen verandering in het plasma ALT-niveau, wat bevestigt dat het onwaarschijnlijk is dat de vector zelf leverschade veroorzaakt. De schematische voorstelling van het moleculaire mechanisme geassocieerd met ACE2-gentherapie met behulp van rAAV2/8-vector in leverfibrose wordt getoond in figuur 4.

Liver-targeted gene delivery met behulp van rAAV2/8 vector heeft aangetoond therapeutisch veelbelovend te zijn in de volwassen lever, maar de effecten zijn niet uitgebreid onderzocht in de onvolwassen lever. Hoewel rAAV2/8 transduceert neonatale muizen lever met een hoge efficiëntie, de vector is niet persistent in de lever en daalt snel met de lever groei . Daarom kan het succesvol gebruik van rAAV2/8-gemedieerde therapie voor de behandeling van leveraandoeningen in de vroege kinderjaren heropname vereisen. In lijn hiermee toonde een andere studie aan dat de behandeling van ornithine transcarbamylase (OTC)-deficiënte neonatale muizen met AAV2/8-OTC therapie de muizen niet beschermde tegen hyperammonemie op volwassen leeftijd. Dus, het produceren van stabiele transductie in de zich ontwikkelende lever blijft een van de grootste uitdagingen voor lever-specifieke rAAV2/8 gentherapie, en readministration van vectoren kan nodig zijn om de therapeutische werkzaamheid op volwassen leeftijd te behouden na een vroege neonatale behandeling.

Hoewel de AAV-vectoren gebruikt voor preklinische studies effectief kunnen zijn in de menselijke lever, is het belangrijk om een AAV-vector specifiek voor menselijke hepatocyten met een verbeterde transductie-efficiëntie te selecteren. Onlangs hebben twee groepen voorgesteld om gehumaniseerde muizen te gebruiken zoals het immuunonderdrukte FRG (Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-) muismodel om het beste rAAV serotype voor lever-gerichte gentherapie te identificeren. De studies in een gehumaniseerd muismodel, herbevolkt met meer dan 25% menselijke hepatocyten, stelden de onderzoekers in staat om menselijke lever-specifieke AAV-vectoren te identificeren, zoals LK-03 afgeleid van de capsid DNA-shuffled AAV-bibliotheek. Deze bibliotheek werd gegenereerd met behulp van 10 AAV-capsidegenen. LK-03, die is samengesteld uit vijf verschillende ouderlijke AAV-capsiden, was in staat om menselijke primaire hepatocyten te transduceren met een hogere efficiëntie in vitro en in een hepatocellulair carcinoom xenograft model in vivo, vergeleken met AAV serotype 8 . Wang en collega’s meldden ook een hoger levertransductieniveau in FRG-muizen met gebruikmaking van capsiden van AAVrh10, een clade E AAV afgeleid van resusmakaken, en AAV3B, en hebben aangetoond dat AAV-LK-03-vectoren mogelijk superieur zijn aan AAV3B of AAV8 . Verwacht wordt dat onderzoekers in toenemende mate gebruik zullen maken van gehumaniseerde diermodellen voor andere ziekten dan leveraandoeningen, waardoor zij nieuwe varianten van gemanipuleerde AAV-vectoren, transductie-efficiëntie en immuunreacties die specifiek zijn voor het onderzochte menselijke weefsel, zullen kunnen identificeren. Bovendien is gemeld dat AAV3B-eGFP-vector, die in staat was leverspecifieke robuuste GFP-expressie te veroorzaken in de levers van niet-menselijke primaten, aanzienlijk beter is dan AAV8 zonder duidelijke hepatotoxiciteit .