Eiwitten moeten interacteren met andere eiwitten om functionele complexen te vormen. In veel gevallen kan de functie van eiwitten in cellen niet begrepen worden zonder informatie over de eiwitstructuur en kennis over in welk complex het eiwit zich bevindt.1, 2 Dit is bijvoorbeeld van het grootste belang voor eiwitten die epigenetische informatie op DNA moduleren. Bijna al deze chromatine modificerende eiwitten vereisen intensieve interactie met metabole enzymen, die de cofactoren leveren die nodig zijn voor histon acetylering, deacetylering of methylering en demethylering.3-5 Hieruit blijkt de noodzaak om de complexe omgeving van een bepaald eiwit te bestuderen om zijn functie en activiteitstoestand te analyseren. Eiwit crosslinking, in combinatie met analyse met behulp van massaspectrometrie (XL-MS), is bij uitstek geschikt als methode om informatie te verkrijgen over de eiwitstructuur en de samenstelling van eiwitcomplexen.6-9 Voor XL-MS zijn gespecialiseerde chemische reagentia, crosslinkers, nodig die in staat zijn eiwitresiduen die zich dicht bij elkaar bevinden covalent met elkaar te verbinden, bijvoorbeeld door interactie in een complex.10, 11 Karakterisering van de crosslinked peptiden met behulp van massaspectrometrie vormt echter om twee redenen een formidabele uitdaging. Ten eerste, crosslink identificatie moet worden bereikt door analyse van fragment ionen van niet slechts één, maar twee, verbonden peptiden, waardoor MS2 spectra enorm gecompliceerd worden. Ten tweede hebben de gecrosslinkte peptidesoorten slechts een zeer lage abundantie en maken zij deel uit van een peptidemengsel dat overwegend wordt gedomineerd door niet-gecrosslinkte peptiden. In veel gevallen leidt dit tot dramatische informatieverlies dat een nauwkeurige crosslink identificatie, en dus, interactome analyse belemmert. Een paar crosslinking reagentia werden ontwikkeld, die MS-cleavable groepen, en de mogelijkheid voor XL verrijking geïntroduceerd om deze problemen aan te pakken.12-18

Hierin, rapporteren wij de ontwikkeling van een nieuwe crosslinking reagens dat is verrijkbaar en heeft splitsing eigenschappen die nauwkeurige crosslink identificatie mogelijk te maken. De ontworpen cliXlink (1) is afgebeeld in figuur 1. Het cel-permeabele reagens (figuur 1 A en figuur S1 in de ondersteunende informatie) is voorzien van twee succinimidyl ester eenheden die kunnen reageren met nucleofielen in eiwitten en zijn ruwweg 9 Å uit elkaar geplaatst, waardoor de fixatie van korte afstanden om structurele informatie over eiwitten te verkrijgen en om eiwitten vast te leggen in de nabijheid van elkaar. Efficiënte MS-splitsing wordt gewaarborgd door de beproefde sulfoxidegroep, die kan worden gesplitst onder laagenergetische door botsing geïnduceerde dissociatie (CID) omstandigheden voorafgaand aan peptidefragmentatie. Bovendien maakt een alkyne-eenheid het mogelijk een verrijkingsgedeelte, bijvoorbeeld biotine, aan de verknoopte plaatsen te hechten met behulp van CuAAC-reactie.19

Toepassing van de crosslinker kan volgen de workflow afgebeeld in figuur 1 B. Het gaat om de toevoeging van reagens 1 tot een complexe proteoom, de vaststelling van de natieve toestand afstand informatie van peptiden in de nabijheid en het behoud van hen gedurende de verdere workflow voor MS-analyse. Bevestiging van de affiniteit groep voor verrijking wordt uitgevoerd na verknoping om interferentie van volumineuze verrijking groepen te voorkomen. Door modificatie van de verknoopte peptiden op eiwitniveau kunnen overtollige kleine-molecule-reagentia gemakkelijk worden verwijderd door aceton-precipitatie. Dit wordt gevolgd door enzymatische digestie van de eiwitten. De gecrosslinkte peptiden worden op deze wijze gelabeld, bijvoorbeeld met biotine, waardoor zij kunnen worden verrijkt. Daarna worden zij geanalyseerd met behulp van massaspectrometrie. Omdat de individuele peptidemassa’s in een crosslink niet onmiddellijk toegankelijk zijn, is crosslink-toekenning moeilijk, vooral in complexe monsters. Dit vereist het gebruik van MS-cleavable reagentia, die MS2-identificatie vergemakkelijken door de vorming van specifieke fragmentionen.20, 21 In het beste geval moet het reagens ook MS3-experimenten mogelijk maken, waarvoor vereist is dat de crosslinker vóór de peptiden wordt gesplitst. Hierdoor kunnen peptiden worden gescheiden voor individuele MS3-gebaseerde identificatie. Ons reagens 1 bevat β-waterstofatomen aan beide kanten van het sulfoxide, zodat fragmentatie in twee richtingen optreedt, zoals afgebeeld in figuur 1 C. Dit leidt tot een zuivere scheiding van de peptiden (α, β) en genereert twee fragmenten voor elk peptide: een alkeen- en een sulfeenzuurfragment; het laatste vormt een thial bij waterverlies. Dit levert twee massaparen op met een karakteristieke Δm/z≈32. Belangrijk is dat we hebben waargenomen dat fragmentatietraject a (figuur 1 C) overheerste. Daarom zijn voor het α-peptide het alkeenfragment en voor het β-peptide het thiaalfragment de belangrijkste splitsingsproducten. Als gevolg van de asymmetrische splitsingseigenschappen blijft het grootste deel van de signaalintensiteit behouden op één fragment per peptide, hetgeen een uitstekende gevoeligheid zou moeten opleveren bij MS3-experimenten.

De synthese van reagens 1 is ongecompliceerd (Schema 1). Het uitgangspunt is de geoxideerde disulfide dimeer van homocystein 2, die wordt behandeld met 4-pentynoic zuur te disulfide 3 te geven. Reductieve splitsing van het disulfide en alkylering van de ontstane thiolen met methyl-3-broompropionaat levert de sulfideverbinding 4 op. Verzeping van beide methylesters tot 5 en omzetting van 5 in geactiveerd bissuccinimidylester 6, gevolgd door oxidatie van de thioether tot het sulfoxide, levert reagens 1 op met een totaalrendement van 16 %. Van bijzonder belang is dat het reagens zeer zuiver is en dat de reactieve ester-eenheden aan beide zijden op hun plaats zitten. Gedeeltelijke hydrolyse moet worden vermeden. Hiervoor werd gezorgd door een laatste precipitatiezuivering. Reagens 1 werd opgelost in een mengsel van ethylacetaat en dichloormethaan en geprecipiteerd na toevoeging van hexaan.

Wij onderzochten vervolgens de MS-eigenschappen van 1. Daartoe voegden wij 1 toe aan het algemeen gebruikte modeleiwit, boviene serumalbumine (BSA). We volgden de workflow afgebeeld in figuur 1 B zonder het uitvoeren van de verrijking stap. Kortom, na de toevoeging van 1 aan de eiwitoplossing en reactie gedurende 1 uur bij kamertemperatuur en fysiologische pH, we geprecipiteerd het eiwit met aceton, geresuspendeerd in buffer (zie de ondersteunende informatie) en vervolgens verteerd het eiwit met een mengsel van trypsine en Lys-C.

Het verkregen peptidemengsel werd ontzout met C18 Tip-kolommen en geanalyseerd met behulp van HPLC-MS2 (figuur 2). Figuur 2 A toont als voorbeeld twee verknoopte BSA-peptiden (α+β). Na het bepalen van de exacte massa van de intacte verknoping (m/z 677,1; Figuur 2 B), voerden we zowel CID en HCD fragmentatie op de precursor aan de fragmentatie-eigenschappen (figuur 2 C) te evalueren. De meer selectieve CID-fragmentatie (resonantie-excitatie van het crosslink-ion; figuur 2 C, bovenste spectrum) bij een lage genormaliseerde botsingsenergie van 25 % levert, zoals verwacht, slechts een kleine reeks intense signalen op. Twee prominente signaalparen, met Δm/z van 32 (Δmrep), worden verkregen als gevolg van fragmentatie van de crosslinker, die voor elk peptide een thial- (α-/β-thial) en alkeen- (α-/β-alkene) fragment oplevert. Zoals eerder vermeld, heeft fragmentatieweg a (figuur 1 C) de voorkeur, hetgeen leidt tot een asymmetrische intensiteitsverdeling. De dominante vorming van de verwachte intacte, gescheiden peptiden maakt het reagens bijgevolg geschikt voor meer geavanceerde MS3-experimenten.

Voor onze studie hebben we HCD-fragmentatie gebruikt. Deze methode biedt gelijktijdige crosslinker splitsing en vorming van de peptide fragmenten die nodig zijn voor identificatie (Figuur 2 C, onderste spectrum). Om te helpen met crosslink / peptide herkenning, is het belangrijk dat HCD fragmentatie nog steeds de alkeen en thial fragmenten biedt. De HCD gegevens, dus de identificatie van peptiden door MS2 mogelijk te maken.

Met behulp van deze methode hebben we de gegevens geanalyseerd met de vrij beschikbare MeroX software, strikt filteren alle crosslink identificaties (score >50, false discovery rate (FDR) 1%) en de aanwezigheid van ten minste drie van de vier ionen van de twee karakteristieke massaparen vereisen.23, 24 Zonder gebruik te maken van de mogelijkheid voor CuAAC-gebaseerde verrijking, waren we in staat om 61 unieke BSA crosslinks te identificeren in een enkele meting (figuur 2 D).25 Dit resultaat is representatief voor metingen uitgevoerd met gezuiverd BSA in ons laboratorium. Bovendien hebben we afgebeeld de crosslinks gevonden in de BSA kristalstructuur en merkte op dat de meerderheid van de gemeten afstanden redelijk waren. Belangrijk is dat de crosslinks tonen een gemiddelde Cα-Cα afstand tussen de verknoopt aminozuren van 22,1 Å en een afstand distributie die in perfecte overeenstemming van wat wordt verwacht voor verknoping met een reagens dat de actieve esters ruimtes door ongeveer 9 Å (figuren 2 E en S2) 26 en rekening houdend met side-chain lengtes en eiwit moleculaire dynamiek.27 De verknoping vond meestal plaats tussen twee Lys residuen (49 %), maar we ontdekten ook Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) en Lys-Tyr (8 %) verbindingen, in overeenstemming met de reactiviteit van de succinimidyl esters (figuur 2 F).28

Dit succes stelde ons in staat om de nieuwe crosslinker te valideren in een complexere omgeving. We wilden vooral om de extra waarde van de CuAAC-gebaseerde verrijkingsmogelijkheid te tonen. Voor dit experiment hebben we opnieuw verknoopt het BSA eiwit (10 ug), neergeslagen met aceton, opgelost de verknoopt eiwit en vervolgens uitgevoerd de klikreactie (figuur S3 A) door toevoeging van 7 (figuur 3 A) en CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) gevolgd door reductie van CuII tot CuI bij toevoeging van natriumascorbaat. Na 1 uur bij kamertemperatuur, voerden we nog een aceton neerslag aan overtollige biotine azide te verwijderen. Vervolgens voegden we trypsine en Lys-C toe voor de ontsluiting.

Deze peptiden hebben we vervolgens gecombineerd met een eiwit digest verkregen uit een HEK-cel extract (435 ug eiwit; Figuur 3 B). Dit creëert een enorme achtergrond van niet-gekruiste peptiden. Als we nu de crosslinks binnen deze grote achtergrond analyseerden (figuur 3 C), identificeerden we slechts een zeer klein aantal crosslink spectrale overeenkomsten (gemiddelde CSMs=5.0), unieke crosslinked sites (gemiddelde unieke XLs=3.7) alsmede monolinks (gemiddelde=5.3), waarbij één succinimidyl ester hydrolyseerde alvorens met het eiwit te reageren. Als we de aanrijking echter met streptavidine-gecoate magnetische korrels uitvoerden, verbeterde het aantal crosslink-identificaties dramatisch. Na incubatie van het peptidemengsel met de magnetische deeltjes; uitgebreid wassen (6×) van de korrels met buffer (zie de ondersteunende informatie) en milde, reductieve splitsing van de disulfide om de “gevangen” crosslinks te bevrijden en daardoor de biotine-groep te verwijderen (figuur S3 B), detecteerden we nu gemiddeld 95,0 CSM’s en 37,0 unieke XL’s samen met 184,3 monolinks. Het aantal geïdentificeerde unieke XLs was lager dan die voor de gezuiverde BSA (figuur 2 D), die kan worden verklaard door inefficiënties in de CuAAC reactie of interferentie van de niet-crosslinked complex achtergrond. Echter, dit resultaat toont aan dat onze nieuwe crosslinker, 1, is in staat om crosslinked peptiden te verrijken in een grote overmaat van niet-gemodificeerde peptiden, waardoor de analyse van complexe monsters met een lage overvloed aan crosslinks. Aanvankelijk waren wij sceptisch over de asymmetrische structuur van 1. De gegevens tonen echter aan dat desondanks een groot aantal crosslinks wordt geïdentificeerd.

Samenvattend combineert onze nieuwe crosslinker 1 de volgende voordelen: ten eerste is de grootte van het reagens bij uitstek geschikt om waardevolle afstandsinformatie te verkrijgen voor structurele proteomics. Bovendien is de molecule celdoorlatend en veroorzaakt de alkyne-eenheid geen grote interferentie met de crosslinking-reactie. Bovendien vereenvoudigt de robuuste, efficiënte sulfoxidefragmentatie de crosslinkidentificatie. De mogelijkheid om peptiden die met 1 verknoopt zijn door middel van klikchemie te functionaliseren maakt het mogelijk diverse modificaties en verrijkingsstrategieën toe te passen die de analyse van weinig voorkomende verknopingen mogelijk maken. Concluderend, ons reagens 1 nu de weg vrij voor complexe interactome analyse met behulp van MS2 en MS3 experimenten.

Belangenconflict

De auteurs verklaren geen belangenconflict.