Beim Menschen strömen im Ruhezustand etwa 5 bis 8 Liter Luft pro Minute in die Lunge hinein und aus ihr heraus. Die Luft kann unterschiedliche Sauerstoff- und CO2-Konzentrationen aufweisen, Allergene enthalten und die Atemwege und Gasaustauschflächen unterschiedlich stark mechanisch dehnen. Diese Signale werden wahrgenommen, weitergeleitet und zu physiologischen Ergebnissen verarbeitet, z. B. zur Steuerung des pulmonalen Blutdrucks, der Immunreaktionen und des Atemrhythmus, aber der Mechanismus ist unklar. Neuroendokrine Zellen der Lunge (PNECs) kommen in einer Vielzahl von Organismen vor, von Fischen bis zu Säugetieren (1). In der Lunge von Säugetieren sind PNEC die einzigen innervierten Epithelzellen der Atemwege und machen weniger als 1 % der gesamten Lungenepithelzellpopulation aus (2). Obwohl in vitro nachgewiesen wurde, dass PNECs an der Sauerstoffsensierung, am Tonus der glatten Bronchial- und Gefäßmuskulatur und an Immunreaktionen beteiligt sind (1, 3), wurden diese Funktionen in vivo nicht nachgewiesen. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass die genetische Ablation von PNECs bei Erwachsenen die Homöostase oder die Reparatur der Atemwege nicht beeinträchtigt, was die Bedeutung dieser Zellen in vivo in Frage stellt (4). PNEC-Pathologien, insbesondere ein Anstieg der PNEC-Anzahl, wurden bei einer Vielzahl von Lungenerkrankungen dokumentiert, darunter Asthma, bronchopulmonale Dysplasie, zystische Fibrose, chronisch obstruktive Lungenerkrankung, kongenitale Zwerchfellhernie, neuroendokrine Hyperplasie im Säuglingsalter, plötzlicher Kindstod und pulmonale Hypertonie (5-8). In jedem Fall bleibt unklar, ob die Zunahme der PNEC eine Ursache oder eine Folge der Symptome ist.

In der Mauslunge befinden sich die meisten PNEC in Clustern von ~3 bis 20 Zellen, die als neuroepitheliale Körper (NEBs) bezeichnet werden (3, 9). Sowohl die solitären als auch die angehäuften PNECs enthalten dichte Kernvesikel, die mit bioaktiven Neuropeptiden wie Calcitonin Gene-Related Peptide (CGRP) oder Aminen wie Serotonin gefüllt sind (1). Diese werden als Reaktion auf Reize, wie z. B. Veränderungen des Sauerstoffgehalts, freigesetzt. Neuropeptide und Amine sind an einigen der gleichen Prozesse beteiligt wie PNECs (10-12), was die Möglichkeit aufwirft, dass sie die Funktion von PNECs vermitteln können. Ein kausaler Zusammenhang wurde jedoch in vivo nicht nachgewiesen.

Wir haben die aktuelle Studie initiiert, um die Mechanismen aufzudecken, die der kongenitalen Zwerchfellhernie (CDH) zugrunde liegen, einem Geburtsfehler, der mit erheblichen Lungenfunktionsstörungen, einschließlich einer verstärkten Immunreaktion und pulmonaler Hypertonie, einhergeht (13). In einem genetischen Mausmodell für CDH entdeckten wir einen Defekt der fehlgeschlagenen PNEC-Gruppierung. Darauf folgt eine Abfolge von Ereignissen: ein Anstieg der PNEC-Neuropeptide, eine Zunahme der Immuninfiltrate und eine Umgestaltung der Lungenstruktur. Diese Ergebnisse bieten eine in vivo-Demonstration der PNEC-Funktion. Da Veränderungen der PNEC-Anzahl und der zugehörigen Neuropeptide bei vielen Lungenerkrankungen dokumentiert wurden, haben unsere Ergebnisse weitreichende Auswirkungen über CDH hinaus.

Beim Menschen wurden Mutationen in Roundabout-Rezeptor-Genen (ROBO) mit CDH in Verbindung gebracht (13, 14). Um die mit CDH assoziierten Lungendefekte zu untersuchen, haben wir sowohl Robo1 als auch Robo2 im vom Endoderm abgeleiteten Epithel, einschließlich der Lunge, mithilfe von Shhcre (im Folgenden Shhcre;Robo-Mutante) in Mäusen inaktiviert (15, 16). Obwohl diese Mutanten überleben, weisen sie ab dem postnatalen Tag (P) 15 eine verringerte Gasaustauschfläche auf (Abb. 1, A und B, und Abb. S1). Wir führten ein Microarray gefolgt von einer quantitativen Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) bei P7 durch, also vor der Verringerung der Gasaustauschfläche. Fünfzehn der 20 am stärksten differenziell exprimierten Gene werden mit Immunreaktionen in Verbindung gebracht, und alle sind signifikant erhöht, einschließlich Ccl3, Cxcl2, Tnfa und Saa3 (Abb. 1C). In Übereinstimmung mit dieser Signatur beobachteten wir eine erhöhte Anzahl von Immunzellen, darunter Neutrophile, Eosinophile, Makrophagen und T-Zellen (Abb. 1, D und E, und Abb. S2). Außerdem steigt der Anteil der M2-Makrophagen und sinkt der Anteil der M1-Makrophagen (Abb. S3). Diese Befunde deuten darauf hin, dass Shhcre;Robo-Mutanten eine erhöhte Immunsensitivität aufweisen, die eine häufige CDH-Komorbidität nachahmt (13).

Obwohl Robo in der alveolären Region des Lungenmesenchyms exprimiert wird (Abb. S4), ist seine Expression im Epithel auf wenige Zellen entlang der Atemwege beschränkt (Abb. 1F). Das Colabeling mit CGRP-Antikörpern zeigte, dass es sich bei den Robo-exprimierenden Epithelzellen um PNECs handelt (Abb. 1G). Um zu bestätigen, dass Robo-Gene in PNECs für die Funktion erforderlich sind, inaktivierten wir Robo mit Ascl1creERT2 (17), einem Knock-in-Cre-Treiber, der PNEC-spezifische Aktivität im Lungenepithel verleiht (Abb. S5). Wir stellten fest, dass Ascl1creERT2;Robo-Mutanten sowohl eine alveoläre Vereinfachung als auch eine Vermehrung von Makrophagen aufwiesen und damit die Shhcre;Robo-Phänotypen rekapitulierten (Abb. S6). Diese Ergebnisse zeigen, dass Robo speziell in PNECs benötigt wird, um die Anzahl der Immunzellen zu begrenzen und die alveoläre Vereinfachung zu verhindern.

Am Embryonaltag (E) 13,5 waren neu spezifizierte PNECs sowohl in der Kontrolllunge als auch in der Lunge der Shhcre;Robo-Mutanten solitäre Zellen (Abb. 2, A und B). Bis E15,5 hatte sich die Mehrheit der PNECs in der Kontrolllunge zu NEBs zusammengeschlossen. In den Shhcre;Robo-Mutanten hingegen waren die PNECs nicht gebündelt (Abb. 2, C und D). Dieser hochgradig penetrante Phänotyp blieb in der postnatalen Lunge bestehen (Abb. 2, E und F, und Abb. S7). Die Gesamtzahl der PNEC-Zellen scheint nicht beeinträchtigt zu sein, was durch die normale Expression von Ascl1 und anderen PNEC-Markern bestätigt wird (Abb. S8). Die nicht angehäuften Zellen in der Mutante verlieren ihre Keilform und sind runder (Abb. S7 und S9). Im Gegensatz zu den Kontrollen, bei denen solitäre PNECs nicht innerviert werden (9), sind in der Mutante ~33,3 % (31 von 93 Zellen) der nicht geclusterten PNECs innerviert (Abb. 2F und Abb. S9), was darauf hindeutet, dass die PNEC-Innervation nicht von der Clusterbildung oder von der Robo-Funktion in PNECs abhängt.

Ascl1creERT2;Robo-Mutanten zeigen auch PNEC unclustering (Abb. S10). Dieser Phänotyp trat selbst dann auf, wenn die Robo-Inaktivierung postnatal, d. h. nach der NEB-Bildung, eingeleitet wurde. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Robo für die Bildung und Aufrechterhaltung von PNEC in NEBs erforderlich ist.

Robo kann entweder abhängig oder unabhängig von seinem Liganden Slit funktionieren (18). Die Analyse von Slit-Mutanten zeigt, dass die PNEC-Gruppierung bei keiner der einzelnen Mutanten beeinträchtigt ist, während sie bei Slit1;3-Mutanten reduziert ist (Abb. S11, A bis D). Dieses Ergebnis deutet darauf hin, dass die Robo-Funktion in diesem Prozess wahrscheinlich ligandenabhängig ist.

Slit und Robo vermitteln in erster Linie die zelluläre Abstoßung und selten die Anziehung (19). Um festzustellen, ob Slit als abstoßendes oder anziehendes Signal für Robo-exprimierende PNECs wirkt, haben wir zunächst bestimmt, wo Slit-Gene exprimiert werden. Der kombinierte Slit1;2-GFP (grün fluoreszierendes Protein)-Reporter zeigte eine Expression in nur etwa 1 bis 3 PNECs innerhalb großer NEBs, was die Möglichkeit aufkommen lässt, dass die Slit1/2-exprimierenden Zellen die kernbildenden Zellen des Clusters sein könnten (Abb. S11E). Dies deutet auch auf eine Subspezialisierung der PNECs innerhalb eines Clusters hin. Die Expression von Slit3 ist auf die vaskuläre Glattmuskelzellschicht beschränkt, die die Arterien umgibt und entlang der Hauptbronchien verläuft, wo die meisten NEBs zu finden sind (Abb. S11, F und G). Die unmittelbare Nähe von Slit-exprimierenden Zellen zu Robo-exprimierenden PNECs legt die Vermutung nahe, dass Slit-Liganden ein attraktiver Hinweis für PNECs sein könnten.

Um dies zu testen, wurden durchflusszytometrisch sortierte GAD1-GFP+ PNECs in die obere Kammer eines Boyden-Zellmigrationskultur-Einsatzes ausgesät. Wenn Slit-Protein mit den Zellen in der oberen Kammer zugegeben wurde, wanderten ~52 % weniger (P = 8,5 × 10-4) PNECs nach unten (Abb. S12, J bis I). Wurde dagegen Slit-Protein in die untere Kammer gegeben, wanderten 18 % mehr (P = 7,5 × 10-5) PNECs nach unten (Abb. S11, L bis N). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass Slit-Robo die Ansammlung von PNECs in NEBs vorantreibt, wahrscheinlich durch zelluläre Anziehung.

Um eine mögliche Verbindung zwischen PNECs und der Immunantwort zu testen, untersuchten wir die Expression von Neuropeptiden, die von PNECs produziert werden (1). Von den neun untersuchten Neuropeptidgenen waren fünf in Shhcre;Robo-Mutanten signifikant hochreguliert (Abb. 3A). Die Anfärbung mit Antikörpern gegen CGRP zeigte, dass die Expression von CGRP in den PNECs der Mutante zwar erhalten bleibt, aber die Intensität der Anfärbung erhöht ist und sich nicht mehr auf die basale Seite dieser Zellen beschränkt (Abb. S7 und S9). Wir stellen außerdem fest, dass die Neuropeptid-Hochregulierung erst nach der Geburt beobachtet wird, vermutlich bei der Exposition gegenüber Luft (Abb. S12), während die Clusterbildung bis E15,5 stattgefunden hat.

Um festzustellen, ob der Anstieg der Neuropeptide zur Immunantwort beiträgt, konzentrierten wir uns auf CGRP, da sein Transkript den größten Anstieg unter allen untersuchten aufweist (Abb. 3A). Wir begegneten diesem Anstieg, indem wir ein mutiertes Cgrp-Allel in den Shhcre;Robo-Hintergrund züchteten (20). In Robo-Kontrollen veränderte der Verlust von Cgrp die Anzahl der Makrophagen nicht (Abb. 3, B, D und F). Bei den Shhcre;Robo-Mutanten jedoch führte der Verlust von Cgrp zu einer signifikanten Verringerung der Makrophagenzahl in Abhängigkeit von der Dosis (Abb. 3, C, E und F). Wir fanden auch, dass der Verlust von Cgrp den Phänotyp der alveolären Vereinfachung teilweise umkehrte (Abb. S13). Wir stellen fest, dass weder die Makrophagenvermehrung noch die alveoläre Vereinfachung vollständig verhindert wurden, was darauf hindeutet, dass die Zunahme anderer Neuropeptide zu den nachgeschalteten Ergebnissen beitragen kann. Zusammengenommen liefern diese Ergebnisse den genetischen In-vivo-Nachweis, dass Neuropeptide die PNEC-Funktion vermitteln.

Da die normale Alveologenbildung bei P4 beginnt (21), deutet das späte Auftreten der alveolären Vereinfachung bei P15 darauf hin, dass die Störung der Alveologenbildung möglicherweise nicht die Hauptursache ist. Obwohl bis P10 keine Veränderung des Zelltods beobachtet wurde, kam es zu einer deutlichen Verringerung des Elastins (Abb. S14), das ein möglicher Auslöser für die Vereinfachung ist (22). Immunzellen wie Makrophagen exprimieren Matrixmetalloproteinasen, die Elastin abbauen (23). Außerdem wird die Zunahme der Makrophagen vor der Vereinfachung beobachtet (Abb. S1 und S2), was die Möglichkeit eines kausalen Zusammenhangs nahelegt. Um dies zu testen, behandelten wir Shhcre;Robo und Kontrolllungen mit Clodronat, einem hydrophilen Medikament, das Makrophagen abbaut (24). Die Behandlung ab P5, also vor dem Anstieg der Immunzellen, reduzierte die Anzahl der alveolären Makrophagen in den Shhcre;Robo-Mutanten effektiv auf das Ausgangsniveau (Abb. 4, A bis E). Dadurch wurde die Abnahme des Elastins abgeschwächt und die Vereinfachung vollständig verhindert (Abb. 4, F bis J, und Abb. S15). Zusammengenommen zeigen diese Daten in vivo, dass erhöhte Immuninfiltrate für die alveoläre Vereinfachung verantwortlich sind und dass beides nachgelagerte Folgen der PNEC-Dysfunktion sind.

In dieser Studie präsentieren wir in vivo genetische Beweise, die zeigen, dass PNECs, trotz ihrer Seltenheit, tiefgreifende Auswirkungen auf die postnatale Lungenfunktion haben. Obwohl der PNEC-Defekt bereits bei E15,5 in der Shhcre;Robo-Mutante offensichtlich ist, setzen die physiologischen Folgen, beginnend mit der Hochregulierung von Neuropeptiden, erst nach der Geburt ein. Dies deutet darauf hin, dass die Wirkung von PNEC von der Exposition der Lunge gegenüber Luft abhängig ist. Somit beschreiben unsere Ergebnisse eine Art der Signaltransduktion, bei der PNECs empfindliche Rheostaten an der Atemwegswand sind, die Umweltreize nicht-zellautonom in Immunreaktionen umsetzen.

Unsere Ergebnisse etablieren Robo1,2 als eine Gruppe von Genen, die die Gruppierung von PNECs in NEBs kontrollieren. Außerdem werden Slit und Robo als Akteure bei der selektiven Zellsortierung im Epithel eines Säugetierorgans vorgestellt. Die Inaktivierung von Robo nach der Bildung von NEBs führte ebenfalls zur Entclusterung, was darauf hindeutet, dass die Cluster aktiv aufrechterhalten werden. Obwohl Slit-Robo weitgehend dafür bekannt ist, zelluläre Abstoßung zu vermitteln, deuten unsere Daten darauf hin, dass sie die Bildung von PNEC-Clustern durch zelluläre Anziehung steuern. Die Inaktivierung von Robo führte zu einer veränderten Innervation und einem Verlust der basal ausgerichteten Lokalisierung von Neuropeptiden. Diese Veränderungen könnten die Ursache für die veränderten Auswirkungen der PNECs sein.

Eine Zunahme der Anzahl der PNECs wurde bei einer Vielzahl von lungenassoziierten Erkrankungen dokumentiert, die von seltenen Störungen wie CDH bis zu häufigen Erkrankungen wie Asthma reichen (5-8). Wir stellen fest, dass sich der Phänotyp der Robo-Mutanten-PNEC von einer erhöhten PNEC-Anzahl unterscheidet. Beide sind jedoch mit erhöhten Neuropeptiden assoziiert, die, wie wir zeigen, starke Effektoren der PNEC-Funktion sind. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass die dokumentierten PNEC-Pathologien und Neuropeptid-Anstiege nicht nur eine passive Anzeige der Krankheit sind, sondern auch aktiv zu den Symptomen bei einer Vielzahl von Atemwegserkrankungen beitragen können.