Generierung von Knockout-Mäusen

Zu den Technologien, die zur Erzeugung von Knockout-Mäusen eingesetzt werden, gehören die homologe Rekombination (oder Gen-Targeting) und das Gen-Trapping. Bei beiden Verfahren werden embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus verwendet, die etwa vier Tage nach der Befruchtung aus Mausembryonen isoliert werden. Beim ersten Ansatz, der homologen Rekombination, wird künstliche DNA mit flankierenden Sequenzen, die homolog (identisch) zu denen sind, die stromaufwärts und stromabwärts der Zielgen-DNA-Sequenz vorkommen, in den Zellkern einer ES-Zelle der Maus eingeführt. Die ES-Zelle erkennt die homologen flankierenden Sequenzen und tauscht die vorhandene Zielgen-DNA gegen Abschnitte der Fremd-DNA aus. Die Fremd-DNA ist jedoch inaktiv. Durch ihren Einbau in das Genom der ES-Zelle wird das Zielgen inaktiviert bzw. ausgeschaltet. Die Fremd-DNA wird in der Regel so konstruiert, dass sie ein Reportergen trägt, das den Ort des vorhandenen Gens markiert oder markiert, so dass die Forscher sein Vorhandensein im Genom der Mauszellen verfolgen können, während sich die Zellen replizieren. Die homologe Rekombination ist die Methode der Wahl, wenn ein bestimmtes Allel (Gen) durch eine manipulierte DNA-Sequenz ersetzt werden soll, ohne dass andere Gene im Genom beeinträchtigt werden.

Beim Gen-Trapping wird ebenfalls künstliche DNA verwendet, die ein Reportergen trägt. Allerdings wird die Fremd-DNA nicht auf ein bestimmtes Gen ausgerichtet, sondern nach dem Zufallsprinzip in ein beliebiges Gen im Genom der Maus-ES-Zellen eingebaut. Die Fremdsequenz hindert das gestörte Gen daran, seine Proteinprodukte zu kodieren, wodurch das Gen inaktiv wird. Die Aktivierung des Reportergens nach dem Einbau in das ES-Zellgenom ermöglicht es den Forschern, die Genaktivität zu verfolgen und die Funktion des gestörten Gens abzuleiten.

Künstliche DNA-Sequenzen werden in der Regel mit Hilfe eines Retrovirus oder eines anderen viralen Vektors in ES-Zellen der Maus eingebracht, und die veränderten ES-Zellen werden dann in Zellkulturen gezüchtet. Nach einigen Tagen werden die Zellen in frühe Mäuseembryonen injiziert, die dann in die Gebärmutter eines Leihmuttertieres eingepflanzt werden, wo sie sich schließlich entwickeln und bis zur Geburt getragen werden. Die auf diese Weise geborenen Mäusewelpen enthalten sowohl verändertes als auch nicht verändertes Gewebe und sind daher keine vollständigen Knockout-Mäuse. Um ein Paar echter Knockout-Mäuse (homologe Knockouts) zu erzeugen, müssen die Mäuse über mehrere Generationen gekreuzt werden. Zunächst werden die Tiere mit anderen Mäusen gekreuzt, um heterozygote Individuen zu erzeugen (Mäuse mit einer Kopie des Zielgens); heterozygote Tiere werden dann miteinander gekreuzt, um homozygote zu erzeugen.