mecA-Gen PCR

Ein 188-bp-Fragment innerhalb des mecA-Gens und ein 178-bp-Fragment innerhalb des S. aureus-spezifischen Sa442-Gens wurden für die Isolate 1 und 2 in separaten Reaktionen auf einem LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Deutschland) unter Verwendung von SYBR-grün mit den Primern Mec-S und Mec-A bzw. Sa442-F und Sa442-RS amplifiziert, wie zuvor beschrieben (5). mecA-positive Isolate erzeugen SYBR-grün-Schmelztemperaturen von 79°C. Sa442-positive Isolate erzeugen ebenfalls eine SYBR-grün-Schmelztemperatur von 79°C. S. aureus ATCC 29213 (oxacillinempfindlich) und S. aureus ATCC 43300 (oxacillinresistent) wurden als Kontrollen für das Sa442-Gen und als Negativ- bzw. Positivkontrollen für das mecA-Gen verwendet. Im Gegensatz zu den Kontrollen wurde bei den Isolaten 1 und 2 kein mecA- oder Sa442-Produkt erzeugt. Eine zusätzliche PCR wurde durchgeführt, um ein größeres 533-bp-Fragment des mecA-Gens nachzuweisen (4). Bei den Isolaten 1 und 2 sowie bei S. aureus ATCC 29213 wurde kein Produkt erzeugt, aber bei S. aureus ATCC 43300 wurde ein Produkt der erwarteten Größe erzeugt. Das 16S rRNA-Gen, das als Positivkontrolle verwendet wurde, wurde von allen Stämmen amplifiziert (Daten nicht gezeigt).

Der genaue und rechtzeitige Nachweis von Methicillin-Resistenz bei S. aureus ist eine wichtige Aufgabe des klinischen Mikrobiologielabors (20). Während der Nachweis des mecA-Gens mittels PCR der Goldstandard ist, hat sich der PBP2a-Latexagglutinationstest als einfacher und schneller Test mit guten Leistungsmerkmalen zum Nachweis der Methicillin-Resistenz sowohl bei S. aureus als auch bei koagulase-negativen Staphylokokken-Spezies erwiesen, auch wenn in einigen Fällen eine vorherige Induktion erforderlich ist (1, 21). Für den PBP2a-Test werden Latexpartikel verwendet, die mit monoklonalen Antikörpern gegen PBP2a sensibilisiert sind (11). Die Spezifität dieses Tests liegt Berichten zufolge bei nahezu 100 % (18, 19). Obwohl es keine Berichte über die Leistung von PBP2a-Latex-Agglutinationstests für S. intermedius-Isolate gibt, wurden falsch-positive PBP2a-Ergebnisse bei zwei S. warneri-Isolaten festgestellt, eines bei 1 Minute und das andere bei 6 Minuten, die beide mecA-PCR-negativ waren und eine Oxacillin-MHK von ≤0,5 μg/ml aufwiesen (21). Laut der Packungsbeilage des Herstellers handelt es sich bei falsch-positiven Reaktionen im Allgemeinen um schwache Agglutinationen, die bei einer Wiederholung des Tests mit einer frischen Kultur oft negativ sind. Wir stellten jedoch fest, dass unsere beiden Isolate nach mehreren Subkulturen wiederholt positiv waren, wobei eines stark positiv war. Der S. intermedius ATCC 29663-Stamm war zwar im PBP2a-Test negativ, unterschied sich aber auch phänotypisch von den beiden klinischen Stämmen hinsichtlich positiver Mannitolfermentation, β-Lactamase-Negativität und Penicillinempfindlichkeit (Ergebnisse nicht gezeigt).

Koagulase-Positivität wird üblicherweise verwendet, um Isolaten von Staphylococcus spp. klinische Bedeutung und Pathogenität zuzuschreiben. Während S. aureus der häufigste im klinischen Labor isolierte koagulase-positive Staphylococcus ist, sind S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae und einige Stämme von S. hyicus ebenfalls koagulase-positiv (1). Zur Identifizierung koagulasepositiver Staphylokokken verwenden Labors häufig eine Kombination von Tests zum Nachweis von freier Koagulase oder von Verklumpungsfaktoren mit und ohne Protein A. S. intermedius-Isolate sind positiv für freie Koagulase, aber negativ für Protein A, und 14 % der Isolate haben einen Verklumpungsfaktor, was die positive Dia-Koagulase und den schwach positiven BACTi-Staphylokokken-Latex für Isolat 1 erklären würde (6). Wie bereits beschrieben, haben wir festgestellt, dass die Pyrrolidonyl-Arylamidase-Positivität ein schnelles Mittel ist, um festzustellen, dass es sich bei einem koagulase-positiven Staphylokokkus nicht um S. aureus handelt (10). Wir glauben, dass unsere Fälle darauf hindeuten, dass die tatsächliche Inzidenz von S. intermedius bei menschlichen Wundinfektionen wahrscheinlich unterschätzt wird, da alle koagulase-positiven Staphylokokken oft als S. aureus zusammengefasst werden (17). In Ermangelung einer definitiven Identifizierung von S. intermedius durch phänotypische oder biochemische Methoden hat sich die Sequenzierung des 16S rRNA-Gens als nützlich für die taxonomische Klassifizierung von Staphylococcus- und Macrococcus-Spezies erwiesen (8).

Eine erste Studie aus dem Jahr 1989 zeigte, dass 72 % der S. intermedius-Isolate aus Zahnfleischentzündungen bei Hunden und Wundinfektionen bei Hunden empfindlich auf Penicillin reagierten und keines davon resistent gegen Oxacillin war (16). Eine neuere Studie ergab, dass die Oxacillin-Resistenz bei S. intermedius-Isolaten ein zunehmendes Problem darstellt, wobei bei Isolaten aus Nase, Augen und Abszessen von Hunden 60 bis 85 % höhere Oxacillin-Resistenzraten festgestellt wurden als bei Isolaten aus den anderen Bereichen (7). Bei der ersten Infektion eines Menschen mit Methicillin-resistentem S. intermedius, der eine Lungenentzündung verursachte, lag die Oxacillin-MHK bei 32 μg/ml (3). Unsere beiden Isolate waren resistent gegen Penicillin und β-Lactamase-positiv; die Oxacillin-MHK für diese Isolate betrug 0,125 μg/ml. Die Penicillin-Resistenz dieser Isolate bei fehlender Oxacillin-Resistenz mit negativer mecA-PCR und Empfindlichkeit gegenüber β-Lactam/β-Lactamase-Hemmer-Kombinationen lässt sich durch den positiven Befund des β-Lactamase-Assays erklären. Unter Verwendung eines Primer-Sets, das auf ein 533-bp-Fragment des mecA-Gens abzielt, bestätigten Gortel et al., dass das mecA-Gen Methicillin-Resistenz bei von Hunden isolierten Staphylokokken verleiht (4). Diese Forscher fanden heraus, dass von 10 koagulase-positiven Staphylokokkenstämmen, die mecA tragen, 9 S. aureus und 1 S. intermedius waren. Sie stellten die Hypothese auf, dass der Unterschied in der Prävalenz der Methicillin-Resistenz bei S. intermedius im Vergleich zu S. aureus auf eine unterschiedliche mecA-Regulierung zwischen den Spezies oder auf das Fehlen eines starken antibiotischen Selektionsdrucks auf S. intermedius zurückzuführen ist (4). Zwar gibt es keine spezifischen Auslegungskriterien des NCCLS für andere koagulase-positive Staphylokokken als S. aureus, doch die Ergebnisse der Oxacillin-Empfindlichkeitsprüfung durch phänotypische und genotypische Methoden (mecA-Gen-PCR unter Verwendung von zwei Primer-Sets, die auf 188- und 533-bp-Fragmente abzielen) in Verbindung mit niedrigen Oxacillin-MHKs im Vergleich zu den zuvor für oxacillinresistente S. intermedius-Isolate (MHK > 4 μg/ml) werden die Isolate 1 und 2 in dieser Studie als oxacillinempfindlich eingestuft (3, 4).

Es ist allgemein anerkannt, dass die Methicillin-Resistenz bei S. aureus hauptsächlich auf den Erwerb eines zusätzlichen Penicillin-bindenden Proteins, PBP2a, zurückzuführen ist, das durch das mecA-Gen kodiert wird. Eine Suche nach dem Ursprung des mecA-Gens führte zur Identifizierung eines möglichen evolutionären Vorläufers in S. sciuri, einem Kommensalen von Tieren. Das mecA-Homolog in S. sciuri wies eine DNA-Sequenzähnlichkeit von 79,5 % mit dem mecA-Gen von S. aureus und eine Aminosäureidentität von 88 % mit PBP2a auf. Das mecA-Homolog von S. sciuri verleiht in der Natur keine Resistenz gegen Methicillin. Couto et al. identifizierten jedoch methicillinresistente S. sciuri-Isolate vom Menschen, bei denen eine Überexpression des mecA-Homologs durch Einfügung eines IS256-Elements stromaufwärts des Strukturgens oder durch Ein-Nukleotid-Veränderungen in der Promotorregion zur Produktion eines Proteins führte, das funktionell PBP2a ähnelt (2). Ähnlich wie die S. sciuri-Isolate enthalten die hier beschriebenen S. intermedius-Isolate möglicherweise ein mecA-Homolog, das für ein PBP2a-ähnliches Protein kodiert, das mit dem PBP2a-Latex-Agglutinationstest kreuzreagiert, aber keine Methicillinresistenz verleiht. Eine antigene Mimikry mit einem völlig unverwandten Protein ist ebenfalls möglich. In jedem Fall hoffen wir, die mikrobiologische Gemeinschaft dafür zu sensibilisieren, dass es klinische Isolate gibt, die die Spezifität des PBP2a-Latexagglutinationstests in Frage stellen können.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass wir den ersten Bericht über falsch-positive PBP2a-Ergebnisse für zwei Stämme von S. intermedius vorlegen, die in Verbindung mit einem anfänglichen Fehler bei der Interpretation der phänotypischen Tests zu einer falschen Identifizierung als MRSA führten. Falsch-positive PBP2a-Ergebnisse könnten zu fehlgeleiteten Versuchen der Infektionskontrolle, zum unnötigen Einsatz von Antibiotika wie Vancomycin und zu einem allgemeinen Anstieg der Krankenhauskosten führen (20). Diese Fälle unterstreichen, wie wichtig es ist, diskrepanten Labortestergebnissen aktiv nachzugehen, um Meldefehler zu vermeiden. Eine genaue Speziesidentifizierung der koagulasepositiven Staphylokokken ist für die Bestimmung der Pathogenität, der klinischen Bedeutung, der Empfindlichkeitsmuster und der Epidemiologie der klinischen Isolate unerlässlich.