Ergebnisse und Diskussion

Die Strukturen und Energien verschiedener mutierter Modellsysteme von KSI wurden entlang dreier Reaktionsschritte untersucht: Erstens, Abstraktion des C4-β-Protons (ES → TS1 → EI1); zweitens, leichte Rotation des protonierten Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2); und drittens, Protonenspende an die C6-β-Position durch Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), wie in Abb. gezeigt. 1. Das vorhergesagte Energieprofil von WT (Abb. 2A) ähnelt dem entsprechenden experimentellen Profil von Pollack und Mitarbeitern (25). Es ist anzumerken, dass das Substrat bei TS2 teilweise neutralisiert ist, da sich die H-Atome der katalytischen Reste dem Oxyanion (O3) im Substrat annähern und das überschüssige Elektron über die H-Bindungswege vom Substrat auf die benachbarten katalytischen Reste übertragen wird. Somit teilen sich das Substrat, Tyr-16/57 und Asp-103 eine negative Ladungseinheit, und ihre Ladungsverteilung hängt von den Protonenaffinitäten und Elektronenaffinitäten der katalytischen Reste der Mutanten ab. Dieser TS2-Zustand mit katalytischen Resten steht im Gegensatz zu dem Zustand ohne katalytische Reste, bei dem das Substrat um fast eine Einheit negativ geladen ist.

Unsere berechneten dreidimensionalen Strukturen von EIs (komplexiert mit Equilenin anstelle von Steroid) stimmen fast genau mit den Röntgenstrukturen von PI(g′) und TI(g′) überein. In der vorhergesagten Struktur des Tyr-16/57 + Asp-103 + Equilenin-Komplexes stimmen die beiden Abstände der d(O3-Or)-Werte für Tyr-16 und Asp-103 (2,54 bzw. 2,55 Å) gut mit den Röntgendaten überein (2,6 ± 0,1 Å für beide im Fall von PI und 2,58 ± 0,08 Å bzw. 2,62 ± 0,07 Å im Fall von TI) (32, 33, 36). Da die berechneten Strukturen ohne Einschränkungen optimiert wurden, deutet die Übereinstimmung der experimentellen und theoretischen Geometrien darauf hin, dass die Schlüsselreste im Enzym fast maximale Wechselwirkungen mit dem Substrat ohne Belastung haben.

Es wurde vermutet, dass das aktive Zentrum von TI in Lösung die dyadische Struktur (Asp-99… Tyr-14… Equilenin) (29) haben könnte, die sich von den Röntgenstrukturen von TI und PI unterscheidet (32, 33). Ein kürzlich durchgeführtes NMR-Experiment für PI/Equilenin hat jedoch gezeigt, dass in PI(D40N)/Equilenin eine charakteristische starke Down-Field-Resonanz bei 16,8 ppm und eine schwache Resonanz bei 13,1 ppm auftritt (36), ähnlich wie in TI/Equilenin durch die Gruppen von Mildvan (29) und Pollack (25). Dieses Ergebnis wird auch durch unsere ab initio-Berechnungen des Tyr-16/57 + Asp-103 + Equilenin-Komplexes bestätigt, bei denen die starke Abwärtsfeldresonanz bei 16,5 ppm dem Tyr-16 zugeordnet wird. Das Experiment zeigt auch, dass in der Mutante D103L + D40N eine starke Abwärtsfeldresonanz (Tyr-16 zugeordnet) auftritt, während in der Mutante Y16F + D40N die starke Resonanz verschwindet. Somit schließt dieses Experiment eindeutig die dyadische Struktur aus, bei der die starke Abwärtsfeldresonanz Asp-103 zugeordnet wurde, das an Tyr-16 H-gebunden ist (36).

Die absoluten Geschwindigkeitskonstanten können anhand der berechneten Aktivierungsbarrieren untersucht werden. Auf den Ebenen B3LYP/6-31+G* und MP2/6-31+G* ist die Aktivierungsbarriere des WT von KSI etwas unterschätzt, verglichen mit der experimentellen Barriere (10 bis ≈11 kcal/mol), die von Pollack und Mitarbeitern (46) berichtet wurde. Berücksichtigt man jedoch den Effekt des dielektrischen Mediums von KSI (31), so beträgt die Aktivierungsbarriere des WT 8,2 kcal/mol und stimmt damit gut mit dem experimentellen Wert überein. Eine leichte Unterschätzung um 2-3 kcal/mol könnte durch eine genauere Berechnung und ein vollständigeres Modellsystem mit apolaren Resten um das aktive Zentrum erklärt werden. Im Gegensatz zur absoluten Aktivierungsbarriere sind die relativen Aktivierungsbarrieren zwischen verschiedenen Mutanten und damit der Reaktionsmechanismus unabhängig von der Berechnungsebene aufgrund des Aufhebungseffekts zwischen verschiedenen Modellsystemen mit ähnlichen Umgebungen recht konsistent. Durch die Verwendung relativer Aktivierungsbarrieren zwischen verschiedenen Mutanten erhielten wir die relative Reaktivität (das Verhältnis der kinetischen Geschwindigkeitskonstante einer Mutante zu der des WT) oder log(kcat/kcat(WT)) unter der Annahme, dass der Transfer von ES zu TS1 der geschwindigkeitsbestimmende Schritt entlang der Reaktionswege ist (siehe Fußnote in Tabelle 1). MP2-Berechnungen untermauern die auf dem B3LYP-Niveau erhaltenen Ergebnisse. Die vorhergesagten Werte von log(kcat/kcat(WT)) stehen in guter Übereinstimmung mit den für PI (32-35) und TI (25-28, 31) gemessenen Werten (Tabelle 1). In Anbetracht der Tatsache, dass die hochgradig homologe dreidimensionale (tertiäre und quaternäre) Struktur und die Active-Site-Umgebung von TI denen von PI ähneln, wird erwartet, dass die katalytischen Reaktionen in den beiden KSIs auf die gleiche Weise ablaufen.

Abb. 2 zeigt die Profile der Energien und H-Bindungsabstände für verschiedene Mutanten entlang des Reaktionsweges. Die Gesamtenergieprofile (ΔE) (Abb. 2A) sind nahezu symmetrisch in Bezug auf TS2. Die Barrieren des ersten und dritten Schritts sind ähnlich. Der zweite Schritt, der eine kleine Barriere (≈1 kcal/mol) aufweist, kann nicht geschwindigkeitsbestimmend sein, da er nur eine geringfügige Verschiebung des H-Atoms durch eine minimale Drehung (um nur einige Grad, da Asp-40 stark gegen die Substratebene geneigt ist) um eine C-C-Bindung (oder C-H-Bindung in Abb. 1 und 3) beinhaltet. Somit kann die Reaktion praktisch als zweistufiger Mechanismus betrachtet werden. Die Reste katalysieren den ersten Schritt, indem sie (teilweise) ein Proton an das Substrat (als Säure) abgeben, während der dritte Schritt durch die (teilweise) Annahme eines Protons vom Substrat (als Base) katalysiert wird. Beziehen Sie sich auf die Inter-Sauerstoffabstände der H-Bindungen und den außermittigen Abstand eines gemeinsamen Protons vom Mittelpunkt von O3 und Or, wobei der positive/negative Wert anzeigt, dass sich das Proton in der Nähe von Resten/Substrat befindet.

Für saure Reste mit geringerer Protonenaffinität (pA in der Gasphase oder pKa im dielektrischen Medium) wäre die Aktivierungsbarriere für den ersten Schritt niedriger und für den dritten Schritt höher, während basische Reste mit höherem pA oder pKa einen gegenteiligen Effekt hervorrufen würden. Folglich wird im zweistufigen Enzymmechanismus die optimale katalytische Leistung erreicht, wenn die Reste des Enzyms eine Doppelrolle als sehr starker Protonendonator/-akzeptor zum/vom Substrat abwechselnd spielen (zu nennen als Amphibien-Säure/Base-Katalysator oder Protonen/Elektronen-Puffer) für die Gesamtreaktion. Im dielektrischen Medium von Enzymen wird die maximale katalytische Wirkung erzielt, wenn die pKas von Resten und Substrat gleich sind. Diese Situation steht im Gegensatz zu einstufigen Reaktionen, bei denen ein großer pKa-Unterschied die Reaktivität erhöht (47, 48). Die Bedingung gleicher pKas zwischen den Resten und dem Substrat für die maximale katalytische Wirkung entspricht der Anforderung, dass die Reste im Enzym äquivalente pKas mit dem Substrat haben müssen, um die maximalen SSHBs zu bilden (4-7, 15, 23, 24). In dem zweistufigen Reaktionsmechanismus der KSI spielen also die SSHBs als Amphibien-Säure/Base-Katalysatoren zusammen mit partiellen Protonen-Shuttles und Ladungsumverteilungen eine entscheidende Rolle bei der starken Stabilisierung von EI durch ≈15 kcal/mol an rückstandsbedingter Stabilisierungsenergie und an reaktionspfadabhängiger Inter-Sauerstoff-Abstandsverkürzung relativ zum ES-Zustand.

Die rückstandsbedingte Stabilisierungsenergie ΔΔEa ist bis zu einem gewissen Grad mit der ΔdES korreliert, es sei denn, der Protonentransfer erfolgt vom Rückstand zum Substrat (d.h., es sei denn, das ΔrH befindet sich in einem negativen Bereich (Abb. 2C). Daher kann die Stabilisierung an EIs und TSs mit der Verkürzung des H-Bindungsabstands und damit der H-Bindungsstärke im Vergleich zum ES-Zustand korreliert werden. Das heißt, dass die normalen (oder gewöhnlichen) H-Bindungen (zwischen neutralen Partnern) bei ES dazu neigen, bei EIs und TS2 zu SSHBs (mit ionischen Spezies) zu werden. Daher sollten diese kurzen Bindungen für einen Teil der durch Rückstände verursachten Energieabsenkung verantwortlich sein. Wie beim Protonentransfer ist das Potenzial an ES für alle Mutanten ein Single-Well, während die Potenzialform (in der Nähe von EIs oder TSs) in dem Bereich, in dem ΔrH nahe Null ist (d. h. um TS1/EI1 für c und EI1/TS2 für e und f in Abb. 2C), einige Merkmale eines Double-Well aufweist. Für einen kleinen absoluten Wert von ΔrH (<≈0,5 Å) (Abb. 2C) ist die Barriere für den Protonentransfer in unseren Berechnungen sehr klein, so dass die Protonentransfers im Doppelwellentyp-Potenzial allein die drastische Senkung der Aktivierungsbarriere nicht erklären können. Tatsächlich zeigt der Fall g, bei dem die doppelwelligen Eigenschaften des Potenzials bei geringem Protonentransfer fast verschwinden, eine stärkere Energieabsenkung als der Fall f, bei dem Protonentransfer in einem doppelwelligen Potenzial stattfindet. Andererseits ist in Abb. 2 D und E festzustellen, dass nach dem Protonentransfer das ΔdES nicht mehr verkürzt, sondern leicht verlängert wird, während das ΔΔEa weiter abgesenkt wird. Die Verkürzung der H-Bindungslänge allein (d.h. ΔdES) kann also nicht die drastische Senkung der Barriere an TS und EI (d.h. ΔΔEa) erklären. Daher muss die Barrierensenkung an TSs und EIs durch zusätzliche Wechselwirkungskräfte erklärt werden, die in Form von Molekülorbital-Wechselwirkungen (MO) zwischen Substraten und Rückständen (mit Ladungstransfer-induzierten elektronischen Umordnungen oder Ladungsumverteilungen) diskutiert werden.

Im Falle von zwei konkurrierenden Rückständen wie in f und g führt die kumulative Stabilisierung von EIs/TSs zu einer höheren kcat. Dieser Effekt ist jedoch subadditiv (d. h. kleiner als die Summe der Stabilisierungsenergien der einzelnen Reste), da die Protonenanziehungskraft des Oxyanions für jeden Rest aufgrund der Anwesenheit des anderen Restes reduziert ist. Diese Subadditivität deutet darauf hin, dass die SSHBs Ladungstransfers und Polarisierung (d. h. induzierte elektrostatische Wechselwirkungen) und möglicherweise partielle kovalente Bindungen beinhalten würden. Die Stabilisierung von EI und TS in Anwesenheit von katalytischen Rückständen beruht hauptsächlich auf der Delokalisierung des überschüssigen Elektrons im aktiven Zentrum durch Ladungstransfer und Polarisierung, wie weiter unten gezeigt wird. Die effektiven natürlichen Bindungsorbital-Populationsladungen (49) des Substrats in den Fällen a, c-e und f an TS1 betragen -0,57, ≈-0,43 bzw. -0,37. Die negative Ladung des Substrats wird also in Gegenwart von zwei katalytischen Resten stärker reduziert. Diese Verringerung ergibt sich aus der Übertragung des überschüssigen Elektrons vom Substrat auf die katalytischen Reste mit großer Elektronenaffinität, die die Pufferrolle für das überschüssige Elektron spielen. Obwohl Asp ein stärkeres Elektronenanziehungsvermögen hat als Tyr, hat Tyr eine geringere Elektronenaffinität als Asp. Daher ist Tyr bei der Senkung der Aktivierungsbarriere genauso wirksam wie Asp oder sogar etwas wirksamer als dieser. Die Stabilisierung der TS und EI in Anwesenheit von katalytischen Rückständen ist eng mit der Energieverringerung des Überschusselektronenzustands verbunden, da der Raum zur Aufnahme des Überschusselektrons durch katalytische Rückstände zusätzlich zum Substrat vergrößert wird. Diese Energieabsenkung steht in direktem Zusammenhang mit der Unschärferelation; je weniger das Überschusselektron lokalisiert ist, desto mehr wird es stabilisiert.

Die berechneten chemischen Verschiebungen (δ) korrelieren in gewissem Maße mit dem kleinsten Wert von d(O3-Or) für die gleiche Anzahl von H-Bindungen, während das Vorhandensein einer zweiten H-Bindung δ aufgrund des verstärkten Abschirmeffekts erhöht. Auf der Grundlage unserer Ergebnisse kann ein großer Wert von δ oft ein guter Indikator für SSHB sein, aber δ ist nur teilweise mit kcat korreliert. Diese Korrelation nimmt insbesondere bei großen δ-Werten (>16 ppm) oder kleinen absoluten Werten von ΔrH (<0,5 Å) ab, da die Abhängigkeit von kcat von δ in Frage gestellt wurde (50).

Die Senkung der Aktivierungsbarrieren in Anwesenheit katalytischer Reste wird durch die MO-Analyse gut verstanden (Abb. 3). Der auffällige Unterschied in den TS2-MO-Energieniveaus zwischen a und g ergibt sich aus der Quantennatur der überschüssigen Elektronendichte, die sich durch die Deprotonierung durch Asp-40 auf dem Substrat ansammelt. Die daraus resultierende Stabilisierung, die durch die Ableitung eines Teils der Elektronendichte an die katalytischen Rückstände erreicht wird, ist auf die bereits erwähnte Unschärferelation zurückzuführen, die derjenigen ähnelt, die bei der Wechselwirkung eines überschüssigen Elektrons mit Wasserclustern beobachtet wird (51, 52), was einen angemessen großen Hohlraum begünstigt. Das Vorhandensein der katalytischen Reste (die durch partiellen Elektronentransfer vom Substrat zu den katalytischen Resten eine ladungspuffernde Rolle spielen) reduziert also die Ladungsanreicherung am Oxyanion drastisch. Diese Stabilisierung der EIs und TSs wird im Wesentlichen durch SSHBs unterstützt. Dieser Effekt wird durch die Anwesenheit von Asp-103 und Tyr-16/57 noch verstärkt. Die MO-Energien des Falles g sind daher viel niedriger als die des Falles a. Der Effekt des dielektrischen Mediums des Enzyms ist nicht so drastisch wie der Effekt des katalytischen Restes, der den Elektronentransfer beinhaltet. Somit sind partielle Protonen-Shuttles und Ladungsumverteilungen, die durch SSHBs gefördert werden, eher für die Senkung der TS und EI verantwortlich als der dielektrische Effekt des Enzyms. Folglich resultiert der katalytische Effekt aus einer günstigen Kombination von Gewinnen aus nicht-induzierten elektrostatischen Energien und MO-Wechselwirkungsenergien (Polarisation, Ladungstransfer und kovalente Bindungsenergie). Während erstere aus den partiellen Protonen-Shuttles aufgrund des Vorhandenseins geladener H-Bindungen resultiert (und daher mit der Stärke der SSHBs zusammenhängt), ergibt sich letztere hauptsächlich aus der elektronischen Delokalisierung aufgrund der katalytischen Rückstände, die die Pufferrolle für ein überschüssiges Elektron spielen. Der MO-Wechselwirkungs-Energiegewinn steht in engem Zusammenhang mit der zusätzlichen Enzym-Substrat-Wechselwirkung, die durch SSHB gefördert wird.

Die Stabilisierungsenergie kann somit als die Summe der erhöhten Energie der geladenen H-Bindung (unter Beteiligung ionischer Spezies) von EIs/TSs im Verhältnis zur normalen H-Bindung (zwischen neutralen Partnern) des ES und des MO-Wechselwirkungs-Energiegewinns aufgrund der Ladungsumverteilungen, die die Elektronenabgabe an die katalytischen Reste beinhalten, dargestellt werden. Da die beiden Energieterme nicht leicht zu trennen sind, ist es schwierig, jeden Term zu schätzen. Wir bewerten diese Terme im Fall d jedoch mit der folgenden Methode. Aus dem Vergleich der Energien von EI1 relativ zu ES in Abwesenheit und Anwesenheit von Tyr-16 (Y16) ergibt sich, dass die Stabilisierungsenergie von EI1 durch Y16 8,7 kcal/mol beträgt. Um den Beitrag der nicht-induzierten elektrostatischen Wechselwirkung (die den elektrostatischen Induktionseffekt des Substrats + Asp-40 (D40) auf den Rest Y16 nicht einschließt) zur Stabilisierung zu untersuchen, haben wir die Berechnungen von ES und EI1 für den Fall durchgeführt, dass Y16 durch einen Ghost-Rest ersetzt wird, der nur aus seinen natürlichen Bindungsorbital-Ladungen (NBO) besteht (Y16q), die für ein einzelnes Molekül Y16 in Abwesenheit von Substrat + D40 berechnet wurden. Danach beträgt der nicht induzierte elektrostatische Wechselwirkungsenergiegewinn (oder der vororganisationsbedingte elektrostatische Energiegewinn) 4,4 kcal/mol, der für die erhöhte Bindungsstärke der geladenen H-Bindung (d. h. SSHB selbst) verantwortlich ist. Der Unterschied in den Stabilisierungsenergien zwischen dem vollen Quanteneffekt durch Y16 und dem nicht induzierten elektrostatischen Effekt durch Y16q (4,3 kcal/mol) sollte dann aus der induzierten elektrostatischen Wechselwirkungsenergie, der kovalenten Energie usw. stammen. Die induzierte elektrostatische Wechselwirkung umfasst Polarisations- und Ladungstransfereffekte. Um den induzierten elektrostatischen Energiegewinn zu erhalten, haben wir zunächst die atomaren Ladungen von Y16 (Y16qind) ermittelt, die den Induktionseffekt in Gegenwart des Substrats + D40 beinhalten. Dann haben wir die Berechnungen von ES und EI1 für den Fall durchgeführt, dass Y16 durch einen Ghost-Rest (Y16qind) ersetzt wird, der nur aus seinen atomaren Punktladungen besteht. Da diese Stabilisierungsenergie 8,2 kcal/mol beträgt, liegt der induzierte elektrostatische Energiegewinn durch die Wechselwirkung zwischen Substrat + D40 und Y16 bei 3,8 kcal/mol. Somit ist der Energiegewinn durch den Ladungstransfer und die Polarisierung groß und vergleichbar mit dem nicht-induzierten elektrostatischen Energiegewinn. Der Rest Y16 spielt eine wichtige katalytische Rolle als Ladungspuffer, um einen großen Teil der überschüssigen negativen Ladung im Substrat abzuziehen und zu halten, sowie bei der entsprechenden elektronischen Ladungsumverteilung während der Reaktion. Diese induzierte elektrostatische Energie ergibt sich aus der MO-Wechselwirkungsenergie durch die quantenmechanische elektronische Ladungswechselwirkung zwischen dem katalytischen Rest (Y16) und dem Substrat + D40 (d. h. die SSHB-getriebene Substrat-Rest-Wechselwirkungsenergie). Der verbleibende Energiebeitrag von 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol könnte hauptsächlich der nicht-elektrostatischen kovalenten Energie entsprechen. Diese Energie ist recht gering, was durch unsere MO-Analyse bestätigt wird, wonach die nicht-elektrostatische Orbitalüberlappung im SSHB selbst nicht signifikant ist.

In Enzymen mit zweistufigem Reaktionsmechanismus ist ein Substrat nicht vollständig negativ geladen, sondern teilweise anionisch mit Elektronenabgabe an die katalytischen Reste. In diesem Fall erweist sich der durch SSHB verursachte Zuwachs an Stabilisierungsenergie (≈10 kcal/mol bei EI1) gegenüber der normalen H-Bindung als nicht gering. Wenn die SSHB-Energie so erweitert wird, dass sie die Substrat-Rest-Wechselwirkungen aufgrund von Ladungsumverteilungen sowohl im Substrat als auch im Rest einschließt, ist die Stabilisierungsenergie die Summe aus der SSHB-Energie der Vororganisation und der SSHB-bedingten MO-Wechselwirkungsenergie. Betrachtet man jedoch nur die Stärke der SSHB selbst, so ist der Anstieg der Bindungsenergie wesentlich geringer (auf ≈5 kcal/mol).